TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
Tp.HCM 09/ 2011
1
Chương I
ĐỐI TƯỢNG VI SINH VẬT VÀ CÁC CHỈ TIÊU TRONG THỰC PHẨM
1.1GIỚI THIỆU
Ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây được ghi nhận khá thường xuyên,
trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Có nhiều nguyên nhân khác nhau có thể gây
ra các vụ ngộ độc thực phẩm nhưng phần lớn các trường hợp là có nguôn gốc từ vi
sinh vật, do sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh hay sự hiện diện của độc tố tiết ra
bởi các vi sinh vật này trong nước uống, thực phẩm. Ngày nay, an toàn, nhất là về
phương diện vi sinh vật, trở thành một trong những yêu cầu không thể thiếu đối với
chất lượng thực phẩm.
Việt Nam là một nước nông nghiệp có tiềm lực lớn về sản xuất nông sản, thủy
hải sản, thực phẩm. Ngoài thị trường tiêu thụ nội địa cho hơn 80 triệu dân, thực phẩm
và thủy sản của nước ta cũng đã xuất khẩu được ra thị trường thế giới (Châu Âu, Bắc
Mỹ, Nhật Bản…), mang lại nhiều ngoại tệ cho đất nước, giải quyết việc làm cho một
số lượng lớn người lao động ở cả nông thôn và thành thị. Do nhận thức ngày càng
được nâng cao của người tiêu dùng trong nước về an toàn vệ sinh thực phẩm và sự
tăng cường về quản lý của Nhà nước, kiểm tra, giám sát của các cơ quan chức năng,
yêu cầu nghiêm ngặt về chỉ tiêu vi sinh của thị trường thế giới, việc phân tích vi sinh
vật gây bệnh, thực hiện các biện pháp nhằm đảm bảo sản xuất, chế biến thực phẩm đạt
tiêu chuẩn an toàn và thực hiện các biện pháp đảm bảo sản xuất, chế biến thực phẩm
đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm ngày càng được các đơn vị sản xuất, chế biến
thực phẩm nội địa quan tâm thực hiện. Tuy nhiên không phải vì thế mà ngộ độc thực
phẩm, số vụ ngộ độc thực phẩm, mức độ ngộ độc thực phẩm khi con người tiêu thụ
thực phẩm được thuyên giảm.
Nước và thực phẩm nuôi sống con người nhưng cũng có thể gây ngộ độc hoặc
hoặc độc tố của chúng tiết ra trong thực phẩm khi được sử dụng phải đủ lớn. Tuy mật
độ vi sinh vật ban đầu trong nước, trong nguyên liệu hoặc trong thực phẩm có thể rất
thấp nhưng ở những điều kiện nhất định thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo độc tố của
vi sinh vật trong quá trình chế biên hoặc bảo quản thực phẩm, mật độ vi sinh vật được
nhân lên nhanh đến mức đủ để gây bệnh hay hay sản xuất đủ lượng độc tố gây hại. Do
vậy, mật độ cho phép của vi sinh vật gây bệnh trong nước, thực phẩm là rất thấp, trong
đa số các trường hợp là bằng không.
1.2. TÌNH HÌNH CÁC VỤ NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM TRONG CẢ NƯỚC VÀ Ở
TP. HỒ CHÍ MINH TRONG THỜI GIAN VỪA QUA
Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới, mỗi năm Việt Nam có 8 triệu người
(chiếm xấp xỉ 1/10 tổng dân số) bị ngộ độc thực phẩm hoặc ngộ độc do liên quan
đến thực phẩm.
Hàng năm Việt Nam có khoảng hơn 3 triệu trường hợp nhiễm độc từ thực phẩm, gây
thiệt hại hơn 200 triệu USD. Đây là con số được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đưa ra
trong một hội thảo về an toàn thực phẩm - dantri.com.vn - 18:02 15-04-2011.
Theo số liệu thống kê tại Cục An toàn Vệ sinh thực phẩm, từ 1997 tới 2004 đã
có 2.237 vụ ngộ độc thực phẩm với 43.655 người mắc và 429 người tử vong. Nguyên
nhân gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là do vi sinh vật (42,2%), sau đó là hoá chất
(24,9%) và độc tố tự nhiên trong thực phẩm (25,2%), còn lại không xác định được
nguyên nhân. 4 lý do chưa thể xác định được nguyên nhân các vụ ngộ độc là: Lấy
mẫu chậm, không lấy được mẫu, không có cách nào điều tra được hoặc còn phải xét
nghiệm.
………
Thông tin từ Bộ Y tế cho biết, trong năm 2010 toàn quốc đã xảy ra 132 vụ ngộ
độc thực phẩm với 4.676 người mắc, 3.281 người nhập viện và có 41 trường hợp tử
vong. Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người tử
vong do độc tố cá nóc tại các tỉnh Phú Yên, Bến Tre, Bình Thuận, trong đó có 3 vụ
ngộ độc lớn từ 30 người trở lên. Số người bị ngộ độc là 323 người với 242 người
nhập viện. So với cùng kỳ năm 2009, số người mắc giảm 189 người, số người đi viện
giảm 186 người. Tuy nhiên số người tử vong lại tăng lên 2 người. Số vụ ngộ độc thực
Mặc dù vậy, ông Hùng cũng khuyến cáo người dân trước tình trạng ngộ độc thực
phẩm tại gia đình chiếm gần 60% tổng số vụ ngộ độc thực phẩm trên cả nước, đặc biệt
là ngộ độc cá nóc. Điều đó cho thấy: Các vụ ngộ độc thực phẩm diễn ra tại khu vực hộ
gia đình có xu hướng tăng, ý thức người dân chưa cao trong việc thực hiện ATVSTP.
Trong khi đó, theo kết quả điều tra của Cục ATVSTP, nhận thức của người dân về
vấn đề ATVSTP đều được nâng cao hơn từ 2005-2008. Theo đó, nhận thức của người
4
sản xuất sản phẩm thực phẩm tăng từ 47,8% lên 55,7%; nhận thức của người kinh
doanh thực phẩm tăng từ 38,6% lên 49,4%; nhận thức của người sử dụng thực phẩm
tăng từ 38,3% lên 48,65%.
Nhờ đó, số vụ ngộ độc thực phẩm trong cả nước vẫn cao (8 triệu người/năm) nhưng
đã bắt đầu có chiều hướng giảm. Số người mắc ngộ độc thực phẩm năm 2005 đã giảm
gần một nửa (43,34%) so với năm 1994, số ca tử vong cũng giảm 28,17%.
Các cơ sở đảm bảo ATVSTP tăng mạnh. Năm 2006, cả nước chỉ có 1.106 cơ sở đạt
yêu cầu. Nhưng chỉ sau 2 năm, con số này đã lên tới 17.592 cơ sở.
Theo báo cáo của Bộ Trưởng Bộ Y tế Nguyễn Quốc Triệu, trong năm 2010, tỷ lệ
người kinh doanh thực phẩm có hiểu biết đúng đắn về VSATTP đã tăng từ 65%
(2008) lên 73% (2010); người tiêu dùng có hiểu biết đúng tăng từ 65,5% (2009) lên
84,5% (2010); người sản xuất và chế biến thực phẩm có hiểu biết đúng tăng từ 44,4%
(2009) lên 79,4% (2010). Trưởng Ban chỉ đạo, Phó Thủ tướng Nguyễn Thiện
Nhân đánh giá sự chuyển biến trong nhận thức của người dân là một trong những
điểm sáng của công tác VSATTP.
Năm 2011 : trong quý I/2011, số vụ ngộ độc thực phẩm giảm 50% và số ca tử
vong giảm tới 75% so với cùng kỳ năm ngoái (2010).
Trong 3 tháng đầu năm 2011, toàn quốc xảy ra 16 vụ ngộ độc thực phẩm với 442
người mắc và 5 người tử vong, trong đó có 1 vụ ngộ độc tập thể 30 người. So với
cùng kỳ năm ngoái, số vụ ngộ độc giảm 10 vụ (giảm 50%), số người mắc giảm 321
người, số tử vong giảm 11 trường hợp (giảm 75%). Theo thống kê từ Cục Vệ sinh an
toàn thực phẩm trong 6 tháng đầu năm 2011 toàn quốc đã xảy ra 53 vụ ngộ độc với
1.776 nạn nhân, trong đó có 9 trường hợp tử vong. Nguyên nhân gây ngộ độc do vi
Nấm men là những tế bào đơn tính sinh sản chủ yếu dạng vô tính theo kiểu nảy
chồi.
Aspergillus
Aspergillus flavus và A. parasiticus là hai loài nấm mốc quan trọng trong các
loài nấm mốc có khả năng tạo độc tố mycotoxin gây ngộ độc thực phẩm. Độc tố
mycotoxin có thể được tạo ra bởi nhiều chủng của hai loài này được gọi chung là
aflatoxin có khả năng gây ung thư. Các nấm mốc này có thể phát triển ở nhiệt độ từ 7-
40
0
C và tối ưu ở 24-28
0
C, do vậy có khả năng tăng trưởng tốt trên các loại ngũ cốc,
nông sản (gạo, lúa, đậu phộng, bắp…). Từ các nguyên liệu này, nấm mốc và độc tố có
thể nhiễm vào thực phẩm gây ngộ độc cho người.
Hình 9. Asperillus flavus (Chụp qua kính
hiển vi điện tử)
6
1.3.3. Salmonella
Nu phõn loi theo mc gõy bnh ca Salmonella ta cú cỏc loi sau:
- Loi ch gõy bnh cho ngi (vd: S. typhi gõy st thng hn ti ngi)
- Loi ch gõy bnh cho ng vt (vd: S. typhimurium gõy st thng hn ti
chut)
- Loi gõy bnh cho c ngi v ng vt (chim a s)
Salmonella l trc khun gram (-), khụng to bo t, cú tiờn mao (tr S.
gallinarum), cú kớch thc t bo vo khong 0,5 3 àm. Ging nh nhiu loi vi
khun khỏc Salmonella cú kh nng phỏt trin trong khong nhit tng i rng t
6 n 45.6
0
C, tuy nhiờn nhit phỏt trin ti u l 37
0
Nhóm Coliform phân là những Coliform có khả năng phát triển trong môi trường
có nhiệt độ từ 44.5 – 45
0
C (các Coliform khác có t
0
opt
=37
0
C). Đây cũng là đặc điểm
nhận biết và phân biệt Colifom phân. Tuy nhiên việc xác định này chỉ là giá trị dùng để
tham khảo cho việc xác định điều kiện sống của Coliform.
Dưới đây là một vài tính chất đặc trưng cho việc làm hư hỏng thực phẩm của
Coliform:
- Chúng có khả năng phân giải nhiều loại cơ chất khác nhau: carbohydrate, các
chất hữu cơ sinh năng lượng, các hợp chất chứa nitơ đơn giản,
- Có khả năng tổng hợp hầu hết các vitamin cần thiết.
- Có khả năng phát triển tốt trong môi trường có nhiệt độ từ 10 – 46
0
C.
- Có khả năng tạo ra acid và sinh gas từ đường
- Sinh ra mùi vị hư hỏng, khó chịu
Escherichia coli:
Được phát hiện là vi sinh vật gây bệnh từ năm 1700. E. coli thuộc họ
Enterobacteriaceae. Các loài E. coli hiện diện diện rộng rãi trong môi trường bị ô
nhiễm phân hay chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường. Các.
Thường sống trong ruột già của người và động vật, theo phân đi ra ngoài, nhiễm vào
thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sản xuất chế biến.
Có khả năng lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrat thành nitrit. Gây nhầy
nhớt, hư hỏng thực phẩm.
Khả năng gây bệnh của E. coli rất đa dạng: gây nhiễm khuẩn đường tiểu; với cơ
chế biến
Hình 3. Staphylococus aureus (Chụp
qua kính hiển vi điện tử)
Staphylococcus aureus
Đặc trưng nhất của loài nay là gây viêm ruột dẫn đến bệnh chảy máu ruột.
Mang tính chất đặc trưng của loài Staphylococcus, kết lại với nhau thành dạng
chùm nho hoặc thành từng chuỗi ngắn. Có một vài loài Staphylococcus aureus có khả
năng chịu mặc rất tốt (10 – 20% NaCl) và cũng chịu được tác động của nitrit. Chính vì
vậy phải rất kiểm tra sự hiện diện của Staphylococcus aureus đối với các sản phẩm thịt
như: xúc xích, dăm bông, lạp xưởng. Staphylococcus aureus cũng phát triển tốt trong
môi trường có nồng độ đường cao (50 – 60% đường). Chúng lên men và phân giải
đường nhưng lại không tạo mùi vị khó chịu cho sản phẩm.
Nguồn gây nhiễm Staphylococci vào cơ thể người thường từ những người bị
viêm mũi gây nên viêm xoang, từ các ung nhọt, hoặc các vết thương bị nhiễm trùng, từ
da người tiếp xúc với người bệnh. Staphylococci còn gây nên chứng viêm vú bò dẫn
đến làm nhiễm sữa và các sản phẩm từ sữa. Riêng không khí không phải là nguồn gây
nhiễm đặc trưng trừ phi trong môi trường có quá nhiều Staphylococci.
Các sản phẩm thực phẩm thường có Staphylococci : thịt và các sản phẩm từ thịt,
cá và các sản phẩm từ cá, sữa và các sản phẩm từ sữa, salad, pudding, cream. Nếu
không được trữ lạnh đúng mức thì Staphylococci sẽ phát triển mãnh liệt và gây bệnh.
1.3.6. Vibrio
Có khoảng 28 loài. Trong đó có 4 loài thường gặp nhiều trong hải sản:
- Vibrio vulnificus
- V. cholerae
- V. parahaemolyticus
- V. alginolyticus
9
Vibrio là phẩy khuẩn. Phần lớn thuộc gram (-). Di động nhanh nhờ đơn mao ở
đầu. Không sinh nha bào, phản ứng oxydase dương tính. Thuộc loài hiếu khí tùy tiện.
Vibrio là loài vi khuẩn ưa mặn, trong môi trường sống yêu cầu có khoảng 1 – 3%
10
Bao gồm 4 loài
– S. dysenteriae
– S. boydii
– S. plexnery
– S. sonnei
Shigella tạo độc tố gây nên các triệu chứng lỵ (bệnh lỵ trực trùng), kích thích
lên thành ruột, lên hệ thần kinh trung ương, gây tiêu chảy, ức chế hấp thu
đường và acid amin ở ruột non. Nếu tác động lên hệ thần kinh thì có thể gây tử
vong. Khi bị nhiễm Shigella, chúng sẽ tấn công lớp biểu mô niêm mạc ruột
già, gây hoại tử, làm loét, xuất huyết. Khi ruột già bị tổn thương gây đau bụng
dữ dội, tiêu chảy nhiều lần, phân nhầy nhớt, có máu. Liều lượng gây ngộ độc
thực phẩm do Shigella rất thấp, có thể ở mức 10 tế bào/g sản phẩm. Không
được phép hiện diện trong 25g thực phẩm
Thường nhiễm vào cá, quả, rau, thịt, các loại salad từ nước hoặc phân người.
Thực phẩm bị nhiễm Shigella từ nguyên liệu hay thông qua tiếp xúc bề mặt trong quá
trình sản xuất, chế biến thực phẩm.
1.3.8. Yersinia
Hiện nay tìm thấy 11 loài. Là trực khuẩn gram(-). Trong một số trường hợp có
khả năng chuyển động. Thuộc loại kỵ khí tùy tiện, không tạo bào tử, không sinh nha
bào. Khoảng nhiệt độ phát triển tối ưu từ 25 – 32
oC
. Bị tiêu diệt ở 60
oC
trong vòng 1 – 3
phút. Đại diện tiêu biểu là Yersinia enterocolitica. Yersinia enterocolitica phát triển
trên nhiều loại thực phẩm khác nhau: bò, heo, dịch trứng, pho mát mềm, sữa, cá, tôm,
cua, gà, đậu phụ,… Y. enterocolitica thường gây bệnh đường ruột, gây viêm dạ dày tại
người. Sau 24 – 36 giờ sau khi sử dụng thực phẩm có mầm bệnh thì triệu chứng của
bệnh bắt đầu xuất hiện như đau bụng, sốt, tiêu chảy, các vết loét dạ dày hình thành.
các sản phẩm được làm tại nhà dễ bị nhiễm C.botulinum hơn là các sản phẩm sản xuất
trong công nghiệp.
Hình 7. Clostridium botulinum và bào tử hình viên đạn (Chụp qua KHV điện tử)
Tùy theo từng loại C. botulinum mà triệu chứng bệnh xuất hiện sau khi sử dụng
thực phẩm chứa độc tố xuất hiện sau các khoảng thời gian khác nhau (từ 12 – 36 giờ).
Khi bị ngộ độc các triệu chứng đầu tiên xuất hiện là: nôn mửa, tiêu chảy, mệt mỏi,
chóng mặt và đau đầu. Sau đó là các triệu chứng táo bón, nhìn một thành hai. Rồi các
hiện tượng khó nuốt, khó phát âm xuất hiện. Người bệnh cảm nhận được sự khô
miệng, khó thở, lưỡi bị sưng và xuất hiện màng. Có thể lên cơn sốt hoặc không. Tiếp
theo là cơ bị tê cứng, rồi đến hệ thống hô hấp bị tê cứng và cuối cùng là tim ngừng
12
đập. Kết quả là người bị bị tử vong do tê liệt hệ thống hô hấp. Sự tử vong này thường
diễn ra sau 3 – 6 ngày sử dụng thực phẩm nhiễm độc tố.
Phương thức duy nhất để chữa trị là sử dụng các chất kháng độc tố. Tuy nhiên nó
chỉ hiệu nghiệm nếu sử dụng khi phát hiện ra các triệu chứng đầu tiên của bệnh. Còn
để khi các triệu chứng đặc trưng xuất hiện thì đã muộn rồi. Chính vì vậy việc xác định
bệnh là rất khó khăn. Kèm theo việc sử dụng chất kháng độc tố là phải giữ cho người
bệnh ở trạng thái yên tĩnh, sử dụng phương pháp thở nhân tạo, tạo sự cân bằng các
chất lỏng trong cơ thể,
Để ngăn chặn sự nhiễm C.botulinum vào cơ thể cần chú ý thực thi các việc sau:
- Nên xử lý nhiệt các đồ hộp trước khi sử dụng.
- Loại bỏ các đồ hộp có triệu chứng phồng, méo mó.
- Không nếm các thực phẩm có mùi khó chịu.
- Không sử dụng các thực phẩm đã được nấu chín nhưng không được bảo quản
tốt và không được hâm nóng.
- Cần đun nóng lại thực phẩm nghi ngờ trong khoảng 15 phút.
- Đối với cảc sản phẩm xông khói thì cần chú ý một số điểm sau:
- Sản phẩm được giữ sạch, tay trước khi cầm sản phẩm được rửa sạch.
- Trrong quá trình xông khói cần giữ ít nhất ở 82
0
1.4. CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG NƯỚC VÀ TRONG THỰC PHẨM
1.4.1. Chỉ tiêu vi sinh vật trong nước
* Nước dùng cho mục đích sinh họat và sản xuất
Các loại nước dùng cho mục đích này được gọi chung là nước mặt, tiêu chuẩn
quốc gia Việt Nam (TCVN 5942 – 1995) quy định hai mức như sau:
- Loại A dùng là m nguồn cấp nước sinh họat nhưng phải qua quá trình xử lý,
giới hạn tối đa số coliform cho phép là 5.000 MPN/100ml
- Loại B dùng cho các mục đích khác, giới hạn tối đa số coliform cho phép là
10.000 MPN/100ml
* Nước uống
Nước uống bao gồm nước đóng chai, nước giải khát (không cồn, có cồn). Tiêu
chuẩn (TCVN 6096 – 1995, TCVN 5042 – 1994) quy định về vi sinh vật của các dạng
nước này như sau:
- Nước uống đóng chai
Chỉ tiêu Mức độ tối đa cho phép
1. Coliform (MPN/100ml)
2. Coliform phân (MPN/100ml)
3. E. coli (CFU/100ml)
4. Clostridium khử sulphat (CFU/100ml)
5. Streptococci phân (CFU/100ml)
0
0
0
0
0
- Nước giải khát không cồn
14
Chỉ tiêu
Mức độ tối đa cho phép
Không đóng chai Đóng chai
6. Staphylococus aureus/vi khuẩn gây bệnh
đường ruột
10
3
0
0
0
10
2
0
10
2
0
0
0
0
0
1.4.2. Chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm
Các chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm được quy định bởi tiêu chuẩn của Bộ Y
tế tháng 4/1998 bao gồm các chỉ tiêu:
- Tổng vi khuẩn hiếu khí
- Coliform
- E. coli
- Staphyloccocus aureus
- Salmonella
- Vibrio parahaemolyticus
- Bacillus cereus
- Streptococcus faecalis
- Pseudomonas aeruginosa
- Clostridium botulinum
- Mẫu lấy phải đại diện cho lô hàng hay nơi lấy mẫu và được nhận dạng rõ ràng.
- Hàm lượng các chất hay các vi sinh vật cần xác định không được biến đổi kể từ
khi lấy mẫu đến khi phân tích.
Khi lấy mẫu cần lưu ý các nguyên tắc sau:
- Người lấy mẫu đọc kỹ tài liệu làm căn cứ lấy mẫu tương ứng (tài liệu luôn có
thể sẵn dùng).
16
Lô hàng đồng nhất: là lô hàng bao gồm những sản phẩm có cùng một tên gọi, cùng
một loại phẩm chất và cùng một khối lượng, đựng trong bao bì cùng 1 kiểu, cùng một
kích thước, sản xuất trong cùng một thời điểm nhất định theo cùng một quy trình công
nghệ.
- Trước khi lấy mẫu trung bình, phải xem xét lô hàng có đồng nhất không và
kiểm tra tình trạng bao bì của lô hàng đó.
- Mẫu thực phẩm phải có tính chất đại diện cho cả một lô hàng thực phẩm đồng
nhất.
- Tỉ lệ lấy mẫu từ 0,5 ÷1,0% tùy theo số lượng, nhưng mỗi lần không ít hơn
lượng cần thiết để phân tích.
- Mẫu hàng lấy để đưa đi kiểm phải là mẫu trung bình. Nghĩa là sau khi chia
thành lô hàng đồng nhất, mẫu sẽ lấy đều ở các góc, ở các phía trên dưới, giữa lô
hàng và trộn đều
- Mẫu kiểm phải mang tính đại diện cho lô thực phẩm. Mẫu kiểm của một lô
hàng lớn hơn hoặc mẫu thực phẩm chưa bao gói tối thiểu phải đạt 200g, mẫu
bao gói rồi tối thiểu cần 100 g. Với sản phẩm bao gói, chỉ những sản phẩm còn
nguyên mới được dùng để phân tích. Đối với dạng lỏng (nước dùng trong chế
biến, nước mắm ): 500ml…
- Chuẩn bị đủ các trang bị, dụng cụ lấy mẫu và bảo quản mẫu phù hợp.
Dụng cụ lấy mẫu, bảo quản mẫu phải được tiệt trùng
- Chuẩn bị biên bản lấy mẫu, nhãn mẫu.
- Trên mẫu cần ghi:
+ Tên mẫu
2.1.2.2. Kế hoạch lấy mẫu
* Một kế hoạch lấy mẫu chi tiết cần có các yếu tố sau: n, c, m, M
- Số mẫu được phép nằm trong khoảng giữa m và M (c);
- Số lượng mẫu cần thử (n);
- Giới hạn vsv, m & M
+ Chấp nhận (acceptable) (< m)
+ Ngưỡng lân cận giới hạn (Marginally acceptable) (> m and < M)
+ Không chấp nhận (Unacceptable) (> M);
Các loại kế hoạch lấy mẫu: Kế hoạch hai thuộc tính và kế hoạch ba thuộc tính.
* Kế hoạch hai thuộc tính
- Chỉ nêu ra m
- Nếu tất cả các mẫu ≤m hoặc ≤c mẫu trong số n mẫu thử >m thì chấp nhận lô
hàng, nếu >c mẫu trong số n mẫu thử >m thì từ chối lô hàng
* Kế hoạch ba thuộc tính
- Đặt ra cả m và M
- Chỉ tiêu “m” thường phản ánh ngưỡng trên của GMP
- Chỉ tiêu “M” đánh dấu giới hạn trên đó sự ô nhiễm là nguy hiểm và không
chấp nhận được
- Nếu tất cả các mẫu ≤m hoặc ≤c mẫu trong số n mẫu thử nằm trong khoảng >m
và ≤M thì chấp nhận lô sản phẩm. Nếu >c mẫu trong số n mẫu thử nằm trong khoảng
> m và ≤M hoặc có một mẫu >M thì từ chối lô sản phẩm
* Lựa chọn kế hoạch lấy mẫu
Kế hoạch hai thuộc tính: đối tượng vsv quan tâm không được phép có trong
thực phẩm. Nếu cho phép một số lượng nhất định vsv trong một đơn vị thể tích thì
thường sử dụng kế hoạch ba thuộc tính.
VD: Số mẫu phải kiểm tra và giới hạn vi khuẩn cho thịt tươi
Mẫu Test
N C m M
Thịt tươi
gia súc
dạng, bị hở các mối ghép hay không? Ghi lại các nhận xét trên. Lau chùi bằng cồn
phía ngoài, đưa vào phòng vô trùng để kiểm. Chú ý chỉ kiểm các hộp phồng khi có yêu
cầu.
Đối với các sản phẩm bao bì bằng thủy tinh, bao nylon… phải kiểm tra độ kín
của bao bì, chùi cồn phía ngoài, đưa vào phòng vô trùng để kiểm
2.1.2.4. Chuẩn bị mẫu phân tích
- Đối với các sản phẩm đặc hoàn toàn: bánh, kẹo, mứt… Cân 10 g (hoặc 25 g)
mẫu cho vào cối sứ nghiền nát, sau đó bỏ vào erlen 150 ml hoặc 200 ml đã có
sẵn bi thủy tinh vô khuẩn hay nước cất đã tiệt trùng. Lắc đều, để lắng cặn. Hút
phần dịch để cấy mẫu, ta có độ pha loãng 10
-1
.
- Đối với các sản phẩm vừa đặc, vừa lỏng: đồ hộp thịt… cân 10-100 g mẫu (cả
cái lẫn nước) cho vào cối nhỏ vô trùng nghiền. Cân 10 g đã nghiền nát cho vào
erlen 250 ml có 90 ml dung dịch nước muối sinh lý có bi thủy tinh, lắc đều, để
lắng cặn. Hút phần dịch để cấy mẫu, ta có độ pha loãng 10
-1
.
- Đối với các sản phẩm lỏng hoàn toàn: nước chấm, nước giải khát… Có thể hút
trực tiếp mẫu hoặc pha loãng tuỳ theo mức độ nhiễm bẩn. Lắc kỹ. Hút 10 ml
mẫu cho vào erlen 250 ml đã có sẵn 90 ml nước cất hay nước muối sinh lý tiệt
khuẩn. Ta có độ pha loãng 10
-1
.
- Đối với các sản phẩm lạnh đông: Mẫu được lau cồn phía ngoài bao PE
(Polyetylen), đặt vào khay tráng men đã vô trùng, đưa vào buồng vô trùng để rã
đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng, hoặc giải đông ở 2-5
oC
trong 18 h; hoặc 45
oC
dinh dưỡng không thể cung cấp đơn thuần một số chất nào đó hoặc một nhóm
nguyên tố nào đó mà trong tự nhiên, VSV sử dụng các nguồn dưỡng chất từ cơ
thể thực vật, động vật hoặc VSV.
- Nồng độ đường phù hợp để nuôi cấy vi khuẩn và xạ khuẩn khoảng 0,05 –
0,20%, nấm mốc và nấm men khoảng 3 – 15%.
- Các chất tăng trưởng chủ yếu là các vitamin và các gốc kiềm purin, pirimidin,
các acid béo, các thành phần của màng tế bào Nồng độ thích hợp của các gốc
kiềm purin, pirimidin cho vi sinh vật vào khoảng 5 – 20 µg /ml. Nồng độ thích
hợp của các vitamin vào khoảng 0,1 – 0,5 µg/ml (1 µg = 10
-6
g )
Thành phần cơ bản chính màng xelluloza của tế bào vi khuẩn
20
2.3.1. Phân loại môi trường
Môi trường có thể được phân thành các loại khác nhau theo bản chất của thành
phần của môi trường, theo tính chất vật lý và theo công dụng.
- Theo bản chất
- - Môi trường tự nhiên: có thành phần được sản xuất từ các sản phẩm có nguồn
gốc động thực vật do vậy thành phần chính xác của môi trường là không xác
định.
- - Môi trường tổng hợp: được điều chế từ các hoá chất tổng hợp tinh khiết với
hàm lượng xác định
- - Môi trường bán tổng hợp: là môi trường tổng hợp mà trong thành phần của
môi trường có bổ sung một số thành phần có nguồn gốc tự nhiên.
- Theo trạng thái vật lý
- - Lỏng (Broth): không chứa agar trong thành phần môi trường. Môi trường lỏng
dùng để nuôi cấy tăng sinh, thử nghiệm đặc tính sinh lý, sinh hoá.
- - Rắn: trong thành phần môi trường có từ 20-25% agar. Môi trường rắn dùng để
phân lập khuẩn lạc đơn, nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, định lượng
mật độ vi sinh vật.
, HPO
4
2-
, PO
4
3-
3
S SO
4
2-
1
- - Môi trường tiền tăng sinh: là môi trường lỏng dùng để tăng sinh không chọn
lọc vi sinh vật. Ví dụ: nước pepton.
- - Môi trường tăng sinh: là môi trường lỏng dùng để tăng sinh chọn lọc đối
tượng vi sinh vật cần kiểm nghiệm. Ví dụ: môi trường tetrathionate dùng tăng
sinh chọn lọc Salmonella
- - Môi trường chọn lọc: là môi trường rắn dùng để phân lập chọn lọc các khuẩn
lạc của vi sinh vật mục tiêu. Tác nhân chọn lọc trong môi trường chọn lọc:
- + Chất kháng sinh (polymixin B, ampicillin, moxalactam, novobioxin,
oxytetracycline, D-cycloserine, vancomycin, trimethiprim, cycloheximide);
- + Chất chỉ thị màu như brilliant green, sodium selenite, bile salts, potassium
tellurite, sodium lauryl sulfate;
- + anaerobiosis bằng cách tạo điều kiện kỵ khí hoặc bổ sung những hóa chất ức
chế quá trình hô hấp như sodium azide, potassium cyanide (ức chế vsv sinh
catalase); phủ một lớp thạch lên trên mặt thạch (vd trong phân tích VK lactic);
- + pH, hoạt độ của nước, nhiệt độ.
- - Môi trường phân biệt :là môi trường rắn chọn lọc chứa các thành phần chỉ thị
giúp cho sự phát hiện dễ dàng đối lượng vi sinh vật mục tiêu. Tác nhân phân
biệt trong môi trường phân biệt:
- + Chỉ thị pH: Lên men đường tạo acid và làm giảm pH, decarboxyl amino acids
Bảng. Một số chất chỉ thị màu và ngưỡng pH thay đổi màu của chúng
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
2.3.2. Pha chế, chuẩn bị môi trường
Hiện hay hầu hết các phòng kiểm nghiệm vi sinh vật đều sử dụng môi trường
đông khô thương phẩm của các hãng chuyên nghiệp MERCK, OXOID, HIGH-
MEDIA… để pha chế môi trường nhằm hạn chế biến động thành phần môi
trường ở các lần kiểm nghiệm khác nhau. Việc pha chế môi trường nuôi cấy từ
các môi trường đông khô này tương đối đơn giản với các bước cân, hoà tan,
chỉnh pH và hấp khử trùng. Phương pháp pha chế môi trường này được thực
hiện như sau:
- Cân, đong đúng lượng môi trường đông khô theo chỉ dẫn
23
- Bổ sung một thể tích nước cất hoặc nước khoáng bằng nửa dung tích cần thiết.
Lắc kỹ, bổ sung phần nước còn lại. Nếu môi trường có agar hoặc gelatin, cần
phải gia nhiệt để làm tan môi trường.
- Điều chỉnh pH môi trường. Để điều chỉnh pH dùng NaOH 1N hoặc HCl 1 N
- Phân phối môi trường vào các dụng cụ chứa thích hợp, làm nút đậy cho các
dụng cụ chứa.
- Tiệt trùng môi trường bằng nồi hấp áp lực
o
C trong 15-30 phút để diệt cả các thể sinh dưỡng lẫn các bào tử-nếu có-
của mọi vi sinh vật
Các bức xạ điện từ với bước sóng ngắn (như tia X hay tia gamma) có khả năng ion hóa
nhiều loại phân tử tạo nên những gốc tự do với hoạt tính hoạt hóa cực mạnh có thể phá
hủy các thành phần cũng như cấu trúc quan trọng như acid nucleic, màng lipoprotein,
các protein trong tế bào. Tia tử ngoại tuy không có khả năng ion hóa nhưng lại là một
tác nhân diệt khuẩn mạnh do khả năng tác động lên acid nucleic tạo đột biến gây chết
tế bào. Sóng viba (microwaves, dạng sóng điện từ có bước sóng từ khoảng 1-1000nm)
cũng được dùng phổ biến nhờ khả năng sinh nhiệt do kích thích các phân tử bất đối
xứng về điện tích dao động với tần số cao (trên 900 triệu lần/giây).
Các dịch lỏng có thể được khử trùng bằng cách lọc qua màng lọc có kích thước giới
hạn (< 0,75 µm), cho phép dịch lỏng đi qua và giữ lại tất cả các vi sinh vật (trừ
mycoplasma có đường kính chỉ khoảng 0,2-0,3 µm và virus). Một số hóa chất như
ethylen oxyde, triethylglycol, chất diệt khuẩn, kháng sinh… có thể kiểm soát sự tăng
24
trưởng của vi sinh vật thường được dùng để khủ trùng hoặc ức chế sự sống cũng như
tăng trưởng của vi sinh vật.
2.4.2.Khử trùng dụng cụ, môi trường sau nuôi cấy
Môi trường sau nuôi cấy vi sinh vật và các dụng cụ bị nhiễm cần được khử trùng, tiêu
hủy hoặc làm sạch phù hợp. Nói chung việc khử trùng bằng nhiệt đóng vai trò quan
trọng trước khi làm sạch hoặc loại bỏ các vật liệu sau nuôi cấy. Việc khử trùng bằng
hóa chất thường chỉ được thực hiện với các dụng cụ có kích thước và cấu tạo nhỏ gọn
(như pipet, lam kính…)hoặc trong vài trường hợp đặc biệt.
Đối với các dụng cụ thủy tinh được dùng làm nhiều lần (như bình tam giác, ống
nghiệm…) có thể khử trùng bằng autoclave ở 121
o
C trong 30 phút. Vật liệu nuôi cấy
trong các dụng cụ chứa dùng một lần (như plastic) cũng có thể khử trùng ở nhiệt độ
tương tự trong các bao plastic có điểm nóng chảy cao. Sau khi vi sinh bị diệt có thể
Copyright: Tài liệu đại học ©