BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN DƯỢC LIỆU
Bùi Hồng Cường
NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN, THÀNH PHẦN
HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA
PHỤ TỬ TỪ CÂY Ô ĐẦU TRỒNG Ở SA PA
(Aconitum carmichaelii Debx. var. carmichaelii)

Chuyên ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền
Mã số: 62 73 10 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Công trình được hoàn thành tại: Viện Dược liệu, Trường đại học Dược Hà Nội,
Trường đại học Y Hà Nội, Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, Công ty cổ phần Traphaco.

Người hướng dẫn khoa học:

1. TS. Phùng Hoà Bình

2. PGS.TS. Nguyễn Trọng Thông
Phản biện 1: GS.TS. Phạm Thanh Kỳ

CT Công thức
DĐTQ Dược điển Trung Quốc
DĐVN Dược điển Việt Nam
Diester alc Diester alcaloid
DL Dược liệu
g/kgTT Liều tính bằng g cho 1 kg thể trọng
gDL/kgTT Liều tính bằng g dược liệu cho 1 kg thể
trọng
HPP Hắc phụ phiến
PP Phương pháp
PT
Phụ tử (附 子): củ con (củ nhánh) của
cây Ô đầu
PTC Phụ tử chế
PTMg Phụ tử chế với dung dịch MgCl
2

PTMgNa Phụ tử chế với dung dịch MgCl
2
và NaCl
PTNa Phụ tử chế với dung dịch NaCl
PTP Phụ tử phiến
PTS Phụ tử sống

1
A. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Phụ tử là củ nhánh của một số loài thuộc chi Aconitum L. (chi Ô đầu), là vị
thuốc quý trong y - dược học cổ truyền phương Đông, có tác dụng “hồi dương
cứu nghịch”, nhưng có độc tính rất cao. Trong y dược học cổ truyền, Phụ tử nhất

cây, các đặc điểm vi học của rễ củ, thân, lá cây Ô đầu, góp phần tiêu chuẩn hoá
dược liệu.
Chế biến Phụ tử chế và bào chế cao Phụ tử:
- Xác định thời điểm thu hoạch Phụ tử ở Sa Pa trong giai đoạn cây ra hoa đến
ra quả (cuối tháng 8 đến cuối tháng 10).
- Đã xây dựng được dự thảo quy trình chế biến Phụ tử chế từ Phụ tử khô theo
phương pháp ngâm với dung dịch muối NaCl. Phụ tử chế có hàm lượng alcaloid
toàn phần là 0,23%, diester alcaloid là 0,036%, aconitin là 0,0012%.
- Đã xây dựng được dự thảo quy trình bào chế cao đặc và cao khô Phụ tử từ
Phụ tử khô bằng phương pháp chiết nóng với nước. Cao đặc có hàm lượng
alcaloid toàn phần là 3,43%, diester alcaloid là 0,323%, không có aconitin. Cao
khô có hàm lượng alcaloid toàn phần là 2,42%, diester alcaloid là 0,198%, không
có aconitin.
Hoá học:
- Các bộ phận của cây đều có alcaloid, acid amin, đường tự do, acid hữu cơ.
Ngoài ra, rễ củ có chất béo, sterol; thân có carotenoid; lá và hoa có carotenoid,
sterol, flavonoid; hạt có chất béo, carotenoid.
- Đã xây dựng được phương pháp định lượng aconitin trong Phụ tử và các sản
phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. 3
- Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất: karacolin, benzoylmesaconin, β-
sitosterol glucopyranosid từ Phụ tử sống; neolin và acid benzoic từ cao Phụ tử.
Tác dụng sinh học: Các mẫu chế biến, cao nước từ Phụ tử đã được chứng minh
có độc tính cấp thấp, có tác dụng tăng biên độ co bóp của tim thỏ cô lập, tăng lưu
lượng mạch vành và không gây loạn nhịp tim, giãn mạch tai thỏ cô lập và có tác
dụng giảm đau trên mô hình gây quặn đau bằng acid acetic.
4. BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN
Luận án gồm 142 trang với 4 chương, 44 bảng, 41 hình, 186 tài liệu tham

hồi dương cứu nghịch, bổ hoả trợ dương, khứ hàn giảm đau, ấm thận hành thuỷ,
kiện tỳ vị,…
1.5. Một số phương pháp chế biến Phụ tử
Các phương pháp chế biến đều dùng nguyên liệu củ tươi ngay sau khi thu
hoạch như chế Diêm phụ, Hắc phụ phiến, Bạch phụ phiến.
Chưa có nghiên cứu về chế biến Phụ tử và bào chế cao Phụ tử từ Phụ tử khô,
cũng như thành phần hoá học, tác dụng sinh học của Phụ tử chế và cao Phụ tử từ
loài A. carmichaelii Debx. ở Việt Nam.

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Phụ tử (củ con) thu từ cây Ô đầu được trồng ổn định ở Sa Pa – Lào Cai, tiêu
bản thực vật được lưu trữ tại một số bảo tàng mẫu ở Hà Nội, các mẫu nghiên cứu
chế biến, bào chế từ Phụ tử.
2.2. Phương pháp (PP) nghiên cứu
- Xác định tên khoa học theo PP so sánh đặc điểm hình thái thực vật, đối
chiếu với khoá phân loại chi Aconitum L. Nghiên cứu đặc điểm vi học: làm tiêu
bản và bột củ, thân, lá cây Ô đầu. 5
- Thu hoạch Phụ tử ở các thời kỳ sinh trưởng của cây, xác định khối lượng và
số lượng củ Phụ tử / gốc và tỷ lệ dược liệu khô / tươi để xác định thời điểm thu
hoạch thích hợp cho năng suất cao.
- Chế biến Hắc phụ phiến theo PP cổ truyền.
- Chế biến PTMg, PTNa, PTMgNa từ Phụ tử khô theo PP ngâm với các dung
dịch muối NaCl và MgCl
2
.
- Bào chế cao đặc và cao khô chiết nước theo PP chiết nước nóng. Bào chế

3.1.1. Xác định tên khoa học
Căn cứ kết quả phân tích đặc điểm hình thái thực vật, căn cứ khoá phân loại
của Thực vật chí Trung Quốc (2001) và một số tài liệu khác, tên khoa học của cây
Ô đầu ở Sa Pa đã được xác định là Aconitum carmichaelii Debx. var.
carmichaelii.
3.1.2. Nghiên cứu đặc điểm vi học
Đã xác định các đặc điểm vi phẫu và bột rễ củ, thân, lá Ô đầu.
3.2. NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN PHỤ TỬ VÀ BÀO CHẾ CAO PHỤ TỬ
3.2.1. Thu hoạch Phụ tử
Thu hoạch Phụ tử ở 5 thời kỳ sinh trưởng của cây, từ khi chưa ra hoa đến khi
lụi trong 3 năm 2003-2005. Sơ chế thành Phụ tử khô. Số lượng và khối lượng củ
Phụ tử / gốc thấp nhất vào tháng 7; ổn định vào các tháng 8, 9, 10, 11. Tỷ lệ dược
liệu khô / tươi ổn định vào các tháng 7, 8, 9, 10; thấp nhất vào tháng 11. Kết hợp
kết quả nghiên cứu về hàm lượng alcaloid trong Phụ tử và thời tiết ở Sa Pa, thời
điểm thu hoạch được đề nghị là từ cuối tháng 8 (ra nụ) đến cuối tháng 10 (ra quả).
3.2.2. Chế biến Phụ tử
3.2.2.1. Chế biến Hắc phụ phiến (HPP) từ Phụ tử tươi
Ngâm Phụ tử tươi vào dung dịch MgCl
2
theo công thức:
Phụ tử tươi 1000g
MgCl
2
.6H
2
O 400g
Nước 200ml
Tiến hành chế biến theo DĐTQ thu được Hắc phụ phiến: vỏ ngoài nâu đen,
mặt cắt có màu vàng sẫm, nhuận bóng, đục mờ, thể chất cứng, chắc, mùi thơm
nhẹ, vị cay tê nhẹ, hiệu suất chế biến 42,8%.

Mẫu nghiên
cứu
n Hiệu suất chế P
1 PTMg 9 79,6 ± 5,7
2 PTNa 9 80,5 ± 5,4
3 PTMgNa 9 80,8 ± 5

> 0,05

3.2.3. Bào chế cao Phụ tử
3.2.3.1. Phương pháp 1: Phụ tử khô, rửa sạch, đồ mềm, thái phiến, sấy khô thu
được Phụ tử phiến (PTP). Nấu PTP với nước, cô cao, loại tạp bằng cồn, cô đặc
thu được cao đặc (chiết nước).
3.2.3.2. Phương pháp 2: Tương tự như bào chế cao đặc (chiết nước), không loại
tạp, cô đặc, sấy khô thu được cao khô (chiết nước).
3.2.3.3. Phương pháp 3: Bột thô Phụ tử được chiết bằng cồn, cất thu hối cồn, cô
đặc thu được cao đặc (chiết cồn).

8
Kết quả: Cao đặc và cao khô Phụ tử đạt các chỉ tiêu chung DĐVN III về thể
chất, hình thức và độ ẩm. Hiệu suất bào chế cao khô Phụ tử cao hơn cao đặc có ý
nghĩa thống kê (P < 0,01). Hiệu suất bào chế 2 cao đặc chiết nước chiết cồn khác
nhau không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) (Bảng 3.9). Cao Phụ tử chiết nước sau
15 phút nấu còn tê không đáng kể, sau 30 phút thì không còn vị tê, cao đặc (chiết
nước) và cao khô Phụ tử không có vị tê, trong khi đó cao đặc Phụ tử (chiết cồn)
vẫn còn vị tê rõ, chứng tỏ vẫn còn độc.
Bảng 3.9. Hiệu suất bào chế cao Phụ tử

chế (c) và cao Phụ tử (d)

c. Định tính bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao:
Trên sắc ký đồ của Phụ tử sống và Phụ tử chế xuất hiện pic có thời gian lưu
trùng với thời gian lưu của pic aconitin chuẩn, trên sắc ký đồ của cao Phụ tử
không thấy pic aconitin (Hình 3.18). a b c d
Hình 3.18. Sắc ký đồ của aconitin (a), alcaloid trong Phụ tử sống (b), Phụ
tử chế (c), cao Phụ tử (d)
3.3.2.2. Định lượng
a. Định lượng alcaloid toàn phần
* Định lượng alcaloid toàn phần trong Phụ tử sống
Hàm lượng alcaloid toàn phần trong Phụ tử sống thu hoạch ở 5 thời kỳ sinh
trưởng của cây trong từng năm và giữa các năm nghiên cứu dao động không
nhiều, từ 0,91% đến 1,11% (Bảng 3.11).
10
Bảng 3.11. Hàm lượng alcaloid toàn phần trong các mẫu Phụ tử sống
Hàm lượng alcaloid toàn phần (%)
Năm 2003 Năm 2004 Năm 2005
Thời kỳ
sinh trưởng
n

5 PTNa 36 0,23 ± 0,05
6 PTMgNa 39 0,21 ± 0,06
7
CĐ (chiết
nước)
9 0,42 ± 0,06 3,43 ± 0,50
8
CK (chiết
nước)
9 0,45 ± 0,16 2,42 ± 0,14
9
CĐ (chiết
cồn)
9 0,69 ± 0,02 5,48 ± 0,14

P
1 – 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9

< 0,001
P
3 – 4, 5, 6
< 0,001
P
4 – 5, 6
< 0,01
P
5 – 6
> 0,05
P
9 – 7, 8

Hàm lượng diester alc trong các mẫu chế biến và bào chế tính theo dược liệu
đều thấp hơn trong PTS có ý nghĩa thống kê (p < 0,001), (Bảng 3.15).
Bảng 3.15. Hàm lượng diester alcaloid trong các mẫu chế biến và bào
chế
Hàm lượng diester alc (%)
T
T
Mẫu n
Tính theo DL Tính theo cao
P (tính theo DL)
1 PTS 36 0,241 ± 0,032
2 PTP 15 0,126 ± 0,009
3 HPP 12 0,045 ± 0,003
4 PTMg 27 0,023 ± 0,007
5 PTNa 42 0,036 ± 0,012
6 PTMgNa 32 0,032 ± 0,010
7
CĐ (chiết
nước)
9 0,040 ± 0,012 0,323 ± 0,094
8
CK (chiết
nước)
9 0,046 ± 0,004 0,198 ± 0,025
9
CĐ (chiết
cồn)
9 0,119 ± 0,006 0,816 ± 0,025

P

2
=0,9996 (Hình 3.20).
Đường cong chuẩn định lượng aconitin
y = 131825x - 2385
R
2
= 0.9996
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
01234567
Nồng độ aconitin (mg%)
Diện tích pic

Hình 3.20. Đường cong chuẩn aconitin

- Khảo sát độ chính xác của phương pháp: phương pháp có độ lặp lại cao, ổn
định (RSD = 2,61%).
- Khảo sát độ đúng: Xác định bằng phương pháp thêm chuẩn, kết quả cho thấy
phương pháp này có độ đúng cao, tỷ lệ thu hồi là 93,3%.
* Định lượng aconitin trong PTS ở các thời kỳ sinh trưởng của cây
Hàm lượng aconitin trong PTS qua các thời kỳ sinh trưởng của cây trong 3
năm dao động từ 5,3 – 12,7 mg% (Bảng 3.20).

chế
TT Mẫu n
Hàm lượng
aconitin
(mg%)
P
1 PTS 36 8,8 ± 2,4
2 PTP 9 4,0 ± 2,5
3 HPP 12 2,3 ± 0,4
4 PTMg 12 1,2 ± 0,8
5 PTNa 15 1,4 ± 0,9
6 PTMgNa 15 1,4 ± 0,5
7 CĐ (chiết nước) 6 0
8 CK (chiết nước) 6 0
9 CĐ (chiết cồn) 6 0
P
1 – 2, 3, 4, 5, 6
< 0,001
P
3 – 4, 5, 6
< 0,01
P
4 , 5, 6
> 0,05

Căn cứ kết quả nghiên cứu định tính, định lượng alcaloid và tham khảo tài
liệu, một số chỉ tiêu đã được đề nghị để xây dựng dự thảo tiêu chuẩn kỹ thuật của
Phụ tử sống và các sản phẩm (Bảng 4.3).

Bảng 4.3. Một số chỉ tiêu đề nghị trong tiêu chuẩn kỹ thuật

3.3.3.1. Chiết xuất và phân lập
* Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ Phụ tử sống:
Bột Phụ tử (5 kg) được chiết với methanol. Chiết xuất và phân lập các hợp
chất bằng sắc ký cột vài lần thu được các chất sạch 1 (35mg), 3 (50mg) và Ac-2
(4mg), trong đó, Ac-2 là sản phẩm acetyl hoá của 2.
* Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ cao Phụ tử:
Bột cao khô Phụ tử 400g (tương đương 2kg Phụ tử sống) được chiết với
methanol. Chiết xuất và phân lập các hợp chất bằng phương pháp thăng hoa và
sắc ký cột vài lần thu được các chất sạch 4 (58mg) và 5 (21 mg).
3.3.3.2. Nhận dạng các hợp chất phân lập được
* Hợp chất 1:
Hợp chất 1 dạng bột màu trắng, cho phản ứng dương tính với thuốc thử
Dragendorff. Điểm chảy: 182
0
C. IR (KBr), ν
∗
max
(cm
-1
) :

3376 (OH), 2924, 2852
(CH), 1094 (C-O-C). ESI-MS: m/z 378 [M + H]
+
: C
22
H
35
NO
4

15
Hợp chất 1 được xác định là karacolin (Hình 3.23)dựa trên sự so sánh với
các dữ kiện của hợp chất karacolin đã được công bố.
N
H
OH
OH
OH
OMe
16
15
19
18
17
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
1: Karacolin


CH
3
).
13
C-NMR (CDCl
3
, 125 MHz), δ (ppm): 72,26 (C-1), 29,35 (C-2), 29,90 (C-3),
38,16 (C-4), 44,89 (C-5), 83,16 (C-6), 52,20 (C-7), 74,27 (C-8), 48,33 (C-9),
44,15 (C-10), 49,51 (C-11), 29,40 (C-12), 40,39 (C-13), 76,03 (C-14), 42,83 (C-
15), 81,89 (C-16), 63,76 (C-17), 80,28 (C-18), 57,05 (C-19), 48,29 (N-CH
2
-CH
3
),
13,06 (N-CH
2
-CH
3
), 57,89 (6-OMe), 56,33 (16-OMe), 59,20 (18-OMe).

16
Hợp chất 5 được xác định là neolin dựa trên sự so sánh với các dữ kiện của
hợp chất neolin đã được công bố. Cấu trúc hoá học của karacolin được trình bày ở
Hình 3.24.
N
H
OH

max
(cm
-1
): 3486 (O-H),
2936 (C-H), 1255 (COO), 1725, 1244 (CH
3
COO). ESI-MS: m/z 674 [M + H]
+
.
1
H-NMR (CDCl
3
, 500MHz), δ (ppm): 3,431 (1H, d, J=6,0Hz, H-1), 2,977
(1H, H
a
-2), 2,174 (1H, H
b
-2), 5,414 (1H, d, J=6,0Hz, H-3), 2,685 (1H, d,
J=7,0Hz, H-5), 4,174 (1H, d, J=7,0Hz, H-6), 2,103 (1H, H-7), 1,798 (1H, H-9),
2,091 (1H, H-10), 1,255 (1H, H
a
-12), 2,410 (1H, H
b
-12), 4,941 (1H, d, J=5,0Hz,
H-14), 4,907 (1H, m, H-15), 3,139 (1H, m, H-16), 2,877 (1H, s, H-17), 3,952 (1H,
d, J=9,0Hz, H
a
-18), 2,985 (1H, d, J=9,0Hz, H
b
-18), 2,652 (1H, d, J=11,0Hz, H

3
CO), 21,19 (15-CH
3
CO), 170,25 (15-
CH
3
CO), 166,32 (C
6
H
5
CO), 130,09 (C-1'), 129,88 (C-2', C-6'), 128,43 (C-3', C-
5'), 132,96 (C-4').
Hợp chất Ac-2 được xác định là benzoylmesaconin diacetat (Hình 3.25).
Cấu trúc này được kiểm chứng bằng các phổ HSQC, HMBC và
1
H-
1
H-COSY.
Ac-2 là sản phẩm acetyl hoá hai lần của benzoylmesaconin. Như vậy cấu trúc của
hợp chất gốc tạo ra sản phẩm diacetat có trong Phụ tử sống là benzoylmesaconin
(2) (Hình 3.26).
N
H
MeO
OH
OMe
HO
MeO
OMe
O

2
1
Ac-2: Benzoylmesaconin diacetat
2'

Hình 3.25. Cấu trúc hoá học của hợp chất Ac-2

N
H
MeO
OH
OMe
HO
MeO
OMe
OH
O
C
O
HO
16
15
19
18
17
14
13
12
11
10

O
O
H
OH
H
HO
H
HO
H
OH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

H
6
O
2
), 105 [M - OH]
+
, 77 [M - COOH]
+
;
1
H-NMR (CDCl
3
, 500MHz), δ (ppm): 8,13 (2H, d, J = 7,5Hz), 7,62 (1H, t, J
= 7,5Hz), 7,48 (2H, t, J = 7,5Hz).
13
C-NMR (CDCl
3
, 125MHz), δ (ppm): 172,3 (C=O), 133,8 (CH), 130,2 (2xCH),
129,4 (C), 128,5 (2xCH).

19
Căn cứ trên số liệu phổ, hợp chất 4 được xác định là acid benzoic. Acid
benzoic là sản phẩm thủy phân của các diterpenoid alcaloid benzoyl ester trong
quá trình đun nóng mẫu với nước. Cấu trúc hoá học được trình bày ở Hình 3.28.
OH
O
1'
6
5
4

3.4.2.1. Thử tác dụng trên tim và mạch vành thỏ cô lập
- Tần số tim: tất cả các mẫu chế biến và bào chế của Phụ tử được nghiên cứu
không làm thay đổi tần số tim thỏ cô lập so với trước khi dùng thuốc (P > 0,05),
(Bảng 3.28).
Bảng 3.28. Tác dụng của các mẫu chế biến và bào chế Phụ tử lên tần số
tim thỏ cô lập
Tần số
tim/phút
Mẫu nghiên cứu
Trước truyền
thuốc
Sau truyền
thuốc
Mức độ
thay đổi
(%)
P
t-s
HPP 0,5% (n = 9) 62,0 ± 9,2 57,1 ± 9,1 ↓7,9 > 0,05
PTNa 1% (n = 7) 57,4 ± 10,1 56,9 ± 11,1 ↓ 0,9 > 0,5
CN 1% (n = 7) 77,4 ± 16,7 68,6 ± 14,9 ↓ 11,4 > 0,1
Alc-CN 1% (n = 8) 41,9 ± 8,2 39,9 ± 6,8 ↓ 4,8 > 0,1

- Biên độ tim: HPP, PTNa, CN, Alc-CN gây tăng (↑) biên độ co bóp tim từ
21,2 % đến 41,9 % so với trước khi dùng thuốc (p < 0,001), trong đó, CN, PTNa
gây tăng biên độ tim cao nhất (Bảng 3.29).
Bảng 3.29. Tác dụng của các mẫu chế biến và bào chế Phụ tử lên biên độ
tim thỏ cô lập
Biên độ
(mm)

thuốc
Mức độ thay
đổi (%)
P
t-s
HPP 0,5% (n = 9) 18,7 ± 2,6 19,5 ± 3,1 ↑ 4,5 < 0,05
PTNa 1% (n = 7) 22,0 ± 4,4 23,4 ± 4,6 ↑ 6,5 < 0,001
CN 1% (n = 7) 24,7 ± 2,4 27,2 ± 2,5 ↑ 13,0 < 0,005
Alc-CN 1% (n = 8) 18,5 ± 4,3 19,4 ± 4,3 ↑ 4,8 < 0,005

3.4.2.2. Thử tác dụng lên cơ trơn mạch tai thỏ cô lập
PTNa, CN, Alc – CN ở nồng độ 2 và 10gDL/l làm tăng số lượng dung dịch
chảy ra qua tĩnh mạch vành tai từ 19,5 – 66,3 % so với trước khi dùng thuốc (p <
0,05 – 0,001), (Bảng 3.31).
Bảng 3.31. Tác dụng của các mẫu chế biến và bào chế Phụ tử lên mạch tai thỏ
cô lập
Số giọt/phút (
SDX ±
)
T
T
Mẫu
nghiên cứu
n
Nồng độ
thử
Trước dùng
thuốc
Sau dùng
thuốc

carragenin gây ra trên chuột nhắt.
3.4.5.2. Thử tác dụng chống viêm mạn tính
PTNa, CN và Alc – CN thử trên chuột nhắt trắng với liều uống 10g/kg không
làm giảm trọng lượng u hạt so với lô chứng (p > 0,05).
C. KẾT LUẬN
1. Thực vật
- Xác định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở Sa Pa là Aconitum
carmichaelii Debx. var. carmichaelii.
- Xác định các đặc điểm vi phẫu và bột rễ củ, thân, lá cây Ô đầu, góp phần
tiêu chuẩn hoá dược liệu.
2. Chế biến Phụ tử và bào chế cao Phụ tử
- Xác định thời điểm thu hoạch Phụ tử Sa Pa thích hợp nhất trong giai đoạn
cây ra hoa đến khi cây ra quả (cuối tháng 8 đến cuối tháng 10)
- Chế biến Hắc phụ phiến từ Phụ tử tươi theo phương pháp cổ