BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

CHƯƠNG TRÌNH KH&CN TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC
KC04/06-10
“Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học” BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

ĐỀ TÀI
“NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN
VÀO LỤC LẠP TẠO RA THỰC VẬT SẢN XUẤT PROTEIN
TÁI TỔ HỢP ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG Y DƯỢC”
Mã số: KC.04.10/06-10 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Sinh học Nhiệt đới
Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thị Thanh

Tp.HCM - 2011
BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
CHƯƠNG TRÌNH KH&CN TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC
KC04/06-10
“ Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học”

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

7 KS. Lê Tấn Đức NCV
8 CN. Mai Trường HVCH LỜI CẢM ƠN
Nhóm nghiên cứu đề tài xin chân thành cảm ơn:
- Bộ Khoa học và Công nghệ
- Văn Phòng các Chương trình KH&CN trọng điểm cấp Nhà nước
- Ban Chủ nhiệm Chương trình KC.04/06-10
đã tài trợ và giúp đỡ cho đề tài này.
- Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo
điều kiện và giúp đỡ để nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài.

Họ
c hàm, học vị: Tiến sĩ Sinh học phân tử Thực vật
Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên Chức vụ: Phó Trưởng phòng
Điện thoại: Tổ chức: Nhà riêng: (08) 38984233
Mobile: 0982157759
Fax: E-mail:
Tên tổ chức đang công tác: Phòng Công nghệ gen
Địa chỉ tổ chức: 9/621 Xa lộ Hà nội, P. Linh Trung, Q. Thủ Đức, Tp.HCM
Địa chỉ nhà riêng: 241 Xô Viết Nghệ Tĩnh, Q. Bình Thạnh, Tp.HCM.

3. Tổ chức chủ trì đề tài/dự án:
Tên tổ chức chủ trì
đề tài: Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam
2
Điện thoại: (08) 22181635- 22157508 Fax: (08) 38978791
E-mail:
Website:
Địa chỉ: 9/621 Xa lô Hà nội, P. Linh Trung, Q. Thủ Đức, Tp. HCM
Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Hoàng Nghĩa Sơn
Số tài khoản: 931010100085
Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Quận 1, Tp.HCM
Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Khoa học và Công nghệ

II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện đề tài/dự án:
- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ ngày 28 tháng 11 năm 2007
đến tháng 10 năm 2010
- Thực tế thực hiện: từ tháng 12 năm 2007 đến tháng 10 năm 2010


c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:
Đối với đề tài:
Đơn vị tính: Triệu đồng
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Số
TT
Nội dung
các khoản chi
Tổng SNKH Nguồn
khác
Tổng SNKH Nguồn
khác
1 Trả công lao động
(khoa học, phổ
thông)
850 850 815 815

2 Nguyên, vật liệu,
năng lượng
1345 1345 1349 1349

3 Thiết bị, máy móc 40 40 40 40

4 Xây dựng, sửa
chữa nhỏ
20 20 18 18

5 Chi khác 445 445 422 422
thực hiện đề tài năm 2007 (đợt II)
thuộc Chương trình “Nghiên cứu,

4
phát triển và ứng dụng công nghệ
sinh học”, mã số KC.04/06-10.
3 2809/QĐ-BKHCN,
ngày 27/11/2007
Quyết định phê duyệt kinh phí 04
đề tài, 03 dự án sản xuất thử
nghiệm bắt đầu thực hiện năm
2007 thuộc Chương trình KH&CN
trọng điểm cấp Nhà nước giai
đoạn 2006-2010 “Nghiên cứu,
phát triển và ứng dụng công nghệ
sinh học”, mã số KC.04/06-10. 4

226/VPCTTĐ-THKH Quyết định điều chỉnh dự toán
kinh phí KC.04.10/06-10.
4. Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự án:
Số
TT
Tên tổ chức
đăng ký theo

chủ yếu đạt
được
Ghi
chú
*
1 Nguyễn Thị Thanh Nguyễn Thị Thanh Chủ nhiệm đề
tài; Hợp tác
Quốc tế; Cấu
trúc vector,
chuyển gen vào
lục lạp thuốc lá,
phân tích biểu
hiện gen,
Hợp tác Quốc
tế; Cấu trúc
vector, phân
tích biểu hiện
gen, protein.

5
protein.
2 Trần Văn Minh Trần Văn Minh Nuôi cấy mô
thực vật.
Tư vấn xây
dựng hệ
thống tái sinh
thuốc lá, cà
chua.

3 Nguyễn Hữu Hổ Nguyễn Hữu Hổ Nuôi cấy mô và

6 Võ Phan Mi Sa Võ Phan Mi Sa Chuyển gen vào
thực vật, bảo
quản giống
thuốc lá, cà chua
in và ex vitro.
Bảo quản
giống thuốc
lá, cà chua in
và ex vitro.

7 Lê Tấn Đức Lê Tấn Đức Bảo quản giống
chủng vi sinh
vật, kỹ thuật sinh
học phân tử.
Bảo quản
giống vi sinh
vật mang gen
trong điều
kiện tối ưu

8 Mai Trường Mai Trường Bảo quản và giữ
giống in vi tro và
ex vitro thuốc lá,
cà chua.
Bảo quản và
giữ giống in
vi tro và ex
vitro thuốc lá,
cà chua.



- Nội dung: Tham gia Hội
nghị khoa học sinh học;
phương pháp cấu trúc vector
lục lạp mang gen biểu hiện
trong lục lạ
p; phương pháp
tinh sạch protein tái tổ hợp.
- Thời gian: 26 ngày
- Kinh phí:
- Địa điểm: Maynooy- Ireland
- Tên tổ chức: Trường Đại
học Quốc gia Maynooth,
Ireland
- Số đoàn 1
- Số lượng người tham gia: 1. 2 Nội dung: Tham dự Hội nghị
Quốc tế
- Thời gian: 20 ngày
- Kinh phí: 92 triệu
- Địa điểm: Hoa Kỳ
- Số đoàn 1
- Số người 2
- Nội dung: Tham dự Hội
nghị Quốc tế về Sinh học
phân tử thực vật lần thứ 9
năm 2009.
- Thời gian: 10 ngày

th
IAPB
Congress.
- Số đoàn: 1
- Số người: 1
- Lý do thay đổi (nếu có):
8
7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:
Số
TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm )
Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh
phí, địa điểm )
Ghi chú*
1 Tham dự và đăng bài
báo tại Hội nghị BIO-
Hà nội 2010

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

8. Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:
(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong
nước và nước ngoài)
Thời gian
(Bắt đầu, kết thúc:tháng

12/2008-
4/2010
4/2010
4 Thu nhận, tách chiết tinh
sạch protein p24 từ cây thuốc
lá, cà chua biến đổi gen
12/2008-
3/2010
3/2010
5 Đánh giá hoạt tính của
protein kháng nguyên p24 từ
cây cà chua, thuốc lá biến đổi
gen
11/2008-
3/2010
8/2010
Nguyễn Thị Thanh
Trần văn Minh
Nguyễn Hữu Hổ
Phan Tường Lộc
Phạm Đức Trí
Võ Phan Mi Sa
Lê Tấn Đức
Mai Trường
Viện Sinh học Nhiệt
đới - Viện Khoa học
và Công nghệ Việt
Nam
9
- Lý do thay đổi (nếu có):

Kháng
nguyên
đặc
hiệu

Gram
(Phân
tích)

Gram
(Phân tích)

Gram
(Phân tích)
- Lý do thay đổi (nếu có):

b) Sản phẩm Dạng II:
Yêu cầu khoa học
cần đạt

Số
TT
Tên sản phẩm

Theo kế
hoạch
Thực tế
đạt được
Ghi chú


(Tạp chí, nhà
xuất bản)
1 Báo cáo khoa học 3 9
Trong nước: 7 bài
Quốc tế: 2 bài

Tên bài báo, tên tạp chí (Hội nghị) đã đăng
Trong nước
1 Nguyễn Thị Thanh, Phan Tường Lộc, Võ Phan Mi Sa, Phạm Đức Trí
(2009) Nghiên cứu chuyển gen vào lục lạp cây thuốc lá tạo protein kháng
nguyên HIV-1 p24. Tuyển tập Hội nghị Quốc gia về Sinh vật biến đổi gen
và quản lý an toàn Sinh học. Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công
nghệ. Tr.49-54.
2 Phạm Đức Trí, Nguyễn Thị Thanh (2009) Nghiên cứu hoàn thiện hệ thống
nuôi cấy mô định hướng việc chuyển gen vào plastid cà chua (Solanum
lycopersicum L.). Tuyển tập Hội nghị Quốc gia về Sinh vật biến đổi gen
và quản lý an toàn Sinh học. Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công
nghệ. Tr.183-188.
3 Nguyễn Hữu Hổ, Trương Thiện Trí, Phan tường Lộc, Nguyễn Thị Phương
Nam, Lê Tán đức, Phạm đức Trí, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Hữu Tâm,
Võ Phan Mi Sa, Mai Trường (2009) Kết quả bước đầu trong nghiên cứu
chuyển gen HbsAg vào cây cà chua, gen ipt vào cây hoa cúc và gen tạo
ferritin vào cây ngô. Tuyển tập Hội nghị Quốc gia về Sinh vật biến đổi gen
và quản lý an toàn Sinh học. Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công
nghệ. Tr.189-197.
11
4 Phạm Đức Trí, Nguyễn Thị Thanh (2010) Bước đầu nghiên cứu chuyển
nạp gien vào lạp thể cây cà chua (Solanum lycopersicum L.) bằng phương
pháp bắn gien. Tạp chí Nông nghiệp & phát triển Nông thôn 9: Tr. 22-26.
5 Nguyễn Thị Thanh, Phan Tường Lộc, Tôn Thất Huân, Phạm Đức Trí,

Số lượng
Số
TT
Cấp đào tạo, Chuyên
ngành đào tạo
Theo kế
hoạch
Thực tế đạt
được
Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)
1 Tiến sỹ 1 2 2011
- Lý do thay đổi (nếu có):

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống cây
trồng:
Kết quả
Số
TT
Tên sản phẩm
Đăng ký
Theo
Kế hoạch
Thực tế
đạt được
Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)
1

biến đổi gen trong lục lạp làm nguyên liệu để tạo kít chẩn đoán và vắcxin để
phòng bệnh nguy hiểm ở người (HIV/AIDS). Công nghệ chuyển gen hữu ích vào
lục lạp hiện nay được xem là công nghệ tiến bộ nhất, là công nghệ đỉnh cao của
lai tạo giống cây trồng bằng công nghệ sinh học hiệ
n đại. Vì có nhiều ưu điểm
vượt trội so với phương pháp chuyển gen vào nhân tế bào: có kiểu di truyền theo
mẹ, mức độ biểu hiện gen cao (10.000 bản sao/tế bào), cây chuyển nạp gen đồng
nhất và bền vững, hàm lượng protein ở cây chuyển gen thu nhận được rất cao (70
% trên lượng protein hoà tan tổng số), độc tính protein lạ (ngoại lai) có thể được
giảm thiểu, bởi sự phân ngăn của lục lạ
p và ở lục lạp, có sự hình thành nối liên
kết (desulfide bond). Điều này làm cho lục lạp nơi lý tưởng sản xuất vắcxin,
dược sinh học, kháng nguyên, kháng thể, protein tái tổ hợp và như vậy, cây
chuyển gen lục lạp được xem như nhà máy sinh học (Bioreactor) trong tương lai.
Đề tài đã xây dựng được qui trình công nghệ chuyển gen vào lục lạp thực vật để
sản xuất protein HIV-1 p24 bao gồm đầy đủ các bước thiết kế vector l
ục lạp
chứa gen HIV-1 p24 ứng dụng chuyển gen vào lục lạp cây trồng, chuyển gen vào
HIV-1 p24 vào lục lạp các đối tượng thuốc lá, cà chua bằng phương pháp bắn
gen, tái sinh và thu nhận các dòng chuyển gen lục lạp đồng nhất, thu nhận
protein và xác định biểu hiện protein bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như
PCR, Southern blot, SDS-PAGE, Western blot, ELISA. Ngoài ra, qui trình này
14
sẽ làm cơ sở trong việc xây dựng qui trình chuyển gen hữu ích khác vào các loại
cây trồng chính trong sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam.

- Về trình độ công nghệ:
Đề tài đạt trình độ của của công nghệ tương đương trên thế giới và là một
hướng nghiên cứu mới ở nước ta, nhằm tạo ra cây trồng vừa là thực phẩm vừa là
dược phẩm (vắcxin, protein kháng nguyên có thể ăn được), để

c tình trạng giao phấn chéo đối với các cây trồng hoang dại khác,
vượt trội hơn hẳn ở trường hợp chuyển gen vào nhân tế bào. Hàm lượng protein
biểu hiện cao, độc tính của protein lạ có thể giảm tối thiểu đối với cây, bởi sự
phân ngăn của lục lạp, cây chuyển gen bền vững và đồng nhất, ở lục lạp có sự
hình thành nối liên kết (desulfide bond). Cây chuyển gen lục lạp đáp
ứng được
nhu cầu của con người và đất nước nông nghiệp Việt Nam.

3. Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:
Số
TT
Nội dung
Thời gian
thực hiện
Ghi chú
(Tóm tắt kết quả, kết luận
chính, người chủ trì…)
I Báo cáo định kỳ
Lần 1:
Thiết kế vector lục lạp;
Xây dựng qui trình tái sinh cây
thuốc lá;
Xây dựng qui trình tái sinh cây
cà chua
5/2008 - 02 vector lục lạp;
- Qui trình tái sinh cây
thuốc lá;
- Qui trình tái sinh cây cà
chua
Lần 2

sinh học phân tử;
Protein HIV-1 p24 tái tổ
hợp từ cây biến nạp gen
Lần 4:
Nghiên cứu xây dựng qui trình
chuyển gen HIV-1 p24 vào cây
cà chua bằng phương pháp bắn
gen; Phân tích và xác định cây
cà chua, thuốc lá chuyển gen
(tiếp theo kỳ II).
3/2010 Xác định và thu nhận 15
dòng thuốc lá chuyển gen
HIV-1 p24 trong lục lạp;
Xác định và thu nhận 01
dòng cà chua bi chuyển
gen trong lục lạp;
Phân tích và xác định cây
cà chua, thuốc lá chuyển
gen (PCR, Southern blot,
Western blot)
Lần 5:
Kiểm tra và đánh giá các dòng
thuốc lá và dòng cà chua
chuyển gen trong lục lạp;
Thu nhận và tinh sạch protein
p24 từ cây biến nạp gen;
Định lượng hoạt tính
8/2010 Thu nhận và tinh sạch
protein p24 từ cây biến
nạp gen;

- Nội dung và tiến độ thực hiện
đề tài;
- Sử dụng kinh phí
3/2010 Đề tài thực hiện các nội
dung và giải ngân chậm.

Lần 5:
- Nội dung và tiến độ thực hiện
đề tài;
- Sử dụng kinh phí
8/2010 Đề tài cần hoàn thành tất
cả các nội dung và tiến
độ giải ngân để nghiệm
thu đề tài đúng thời gian
đăng ký (tháng 10/2010).
III Nghiệm thu cơ sở 12/2010 Đạt (đủ điều kiện đánh
giá kết quả đề tài cấp
Nhà nước). Chủ nhiệm đề tài
(Họ tên, chữ ký)Thủ trưởng tổ chức chủ trì
(Họ tên, chữ ký và đóng dấu)


1. Xây dựng quy trình tái sinh in vitro cây thuốc lá ứng dụng cho chuyển
gen……………………………………………………………………… 114
2. Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen HIV-1 p24 vào cây
thuốc lá bằng phương pháp bắn gen………………………………… 126
Nội dung nghiên cứu 127
2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất chọn lọc lên các mẫu mô lá, chồi
và tối ưu hoá các điều kiện bắn gen…………………………………… … 128
2.2 Nuôi cấy vi khuẩn mang gen, tách chiết và tinh sạch plasmid DNA
dùng cho bắn gen……………………………………………………… 140
2.3 Phương pháp bọc plasmid DNA vào hạt vàng và các điều kiện tối ưu,
ứng dụng cho bắn gen…………………………………………………… 147
2.4 Chuyển gen HIV-1 p24 vào lục lạp bằng phương pháp bắn gen…… 158
2.5 Tái sinh và thu nhận các dòng thuốc lá chuyển gen………………. … 170
Phần B:
Xây dựng quy trình chuyển gen, tái sinh cây cà chua chuyển
gen………………………………………………………………………… 182
I. Giới thiệu chung 183
II. Nội dung nghiên cứu 189
1. Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro cây cà chua dùng cho chuyển nạp
gen……………………………………………………………………… 190
2. Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen HIV-1 p24 vào cây cà chua
(Lycopersicon esculentum) bằng phương pháp bắn gen……………… 200
2.1 Thử ảnh hưởng của spectinomycin và streptomycin lên sự hình thành mô
sẹo cà chua
(Lycopersicon esculentum)…………………………… 202
2.2 Nuôi cấy vi khuẩn mang gen, tách chiết và tinh sạch plasmid DNA,
xác định nồng độ và độ tinh sạch DNA, cuẩn bị cho bắn gen ………… 211
2.3 Phương pháp coating vàng với plasmid DNA, xác định khoảng cách, độ tuổi
mẫu mô, ảnh hưởng của áp lực khí lên mẫu mô, tìm ra chỉ số không gây ảnh
hưởng đến mô……………………………………………………………… 217

II. Nội dung nghiên cứu.…………………………………………… 372
1. Thu nhận và tinh sạch protein kháng nguyên HIV-1 p24 từ cây chuyển
gen………………………………………………………………………… 373
2. Phương pháp phân tích biểu hiện protein bằng Bioanalyser……………. 388
3. Phương pháp kiểm nghiệm protein bằng Western blot…………………. 412

Chương V: ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CỦA PROTEIN KHÁNG NGUYÊN
HIV-1 P24 TỪ CÂY BIẾN ĐỔI GEN………………………………… 424
Định lượng hoạt tinh c
ủa protein HIV-1 p24 từ cây thuốc lá chuyển
gen…………………………………………………………………… 425
Phương pháp miễn dịch học ELISA………………………………………. 426
1. Giới thiệu………………………………………………………………. 427
2. Vật liệu và phương pháp………………………………………………. 431
3. Kết quả và thảo luận…………………………………………………… 436
4. Kết luận………………………………………………………………… 443

Phần III:
CÁC KẾT QUẢ VÀ SẢN PHẨM KHOA HỌC CÔNG NGHỆ
ĐẠT ĐƯỢC CẢU ĐỀ TÀI……………………………………. 444
Sản phẩm Dạng I…………………………………………………………… 445
Sản phẩm Dạng II………………………………………………………… 446