BỘ CÔNG THƯƠNG
VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CẤP BỘ

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐA DƯ LƯỢNG THUỐC
BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG CÁC MẪU RAU QUẢ
BẰNG GC/MS Chủ nhiệm đề tài: PHẠM VĂN THÀNH 7842

phẩm quốc gia trong công tác kiểm soát chất lượng, an toàn vệ
sinh thực phẩm.
Nhóm thực hiện đề tài xin chân thành cám ơn Vụ Khoa học và
Công nghệ - Bộ Công Thương, Viện Công nghiệp thực phẩm và các
đơn vị bạn đã tạo điều kiện và hỗ trợ chúng tôi hoàn thành
nhiệm vụ này.
Nhóm thực hiện đề tài Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009

2
MỤC LỤC
Trang

Lời nói đầu
01

Mục lục
02

Ký hiệu và chữ viết tắt
04

Mở đầu
05
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

thuôc BVTV
14
1.5.2 Phương pháp lấy mẫu để xác định dư lượng
thuốc BVTV
15
1.5.3 Phương pháp phân tích dư lượng thuốc BVTV 17

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM
21

2.1 Đối tượng nghiên cứu
21
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009

3
2.1.1 Các loại rau quả nghiên cứu 21
2.1.2 Các loại thuốc BVTV nghiên cứu 21

2.2 Cách tiến hành thực nghiệm
22

2.3 Phương pháp nghiên cứu
26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÌNH LUẬN
32


Phụ lục
65
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009

4
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BVTV Bảo vệ thực vật
ELIZA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EIA Enzyme Immunosorbent Assay
GC/MS Gas Chromatography/Mass spectrophotomet
HPLC High Performant Liquid Chromatography
LC Liquid Chromatography
LOD Limit of Detection
LOQ Limit of Quantification
LC/MS Liquid Chromatography/ Mass spectrophotomet
RIA Radio Immuno Assay
PAN Polycyclic Aromatic Hydrocarbon
SPE Solid Phase Extract
TLC Think Layer Chromatography
NN&PTNT Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

ợp tuy ít bền vững hơn nhóm
thuốc clo hữu cơ nhưng chúng lại được sử dụng với số lượng lớn. Vì vậy mối đe doạ
của các loại thuốc này đối với môi trường cũng không phải nhỏ khi có sự ước tính
khoảng 50% lượng thuốc BVTV khi dùng là phun vào đất. Trong đất, thuốc BVTV
bị phân huỷ dần bởi các yếu tố vô sinh và hữu sinh. Một số vi sinh vật có thể sử
dụng
thuốc BVTV như một nguồn dinh dưỡng; ngược lại, nhiều loại vi sinh vật không phải
đối tượng phòng trừ cũng bị ảnh hưởng. Nhiều thí nghiệm cho thấy, khi sử dụng
thuốc BVTV, hoạt độ của đất giảm 50 đến 90% so với điều kiện tự nhiên. Trên thực
tế, việc kiểm tra, giám sát dư lượng thuốc BVTV vô cùng phức tạp, ngay cả với các
nước công nghi
ệp phát triển, có hệ thống kiểm soát dư lượng thuốc BVTV cao thì
những rủi ro về ngộ độc do thuốc BVTV vẫn có thể xảy ra. Ở Việt Nam, kết quả
kiểm tra hàng năm của Trung tâm kiểm định thuốc BVTV phía Bắc và phía Nam cho
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009

6
thấy dư lượng thuốc BVTV trong rau quả rất đáng báo động, số các sản phẩm bị
nhiễm thuốc BVTV có xu hướng tăng lên, ảnh hưởng rất lớn đến sức khoẻ người tiêu
dùng. Kiểm soát dư lượng thuốc BVTV trong các sản phẩm luôn là bài toán khó đối
với các nhà quản lý và các nhà nghiên cứu. Một lý do không nhỏ làm hạn chế sự
kiểm soát này là phương pháp phân tích hiện nay còn phức tạp, mỗi qui trình chỉ có
thể áp dụ
ng cho một số nhóm, một số chất nhất định.
Hiện nay, trong bộ tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cũng chỉ ban hành tiêu
chuẩn kiểm tra thuốc BVTV cho nhóm ngũ cốc và chè, hơn nữa mỗi tiêu chuẩn chỉ
dùng xác định một số chất, số các loại thuốc BVTV có thể xác định được khi áp dụng

xua đuổi hoặc giảm nhẹ thiệt hại do dịch hại gây ra cho cây trồng (U.S.EPA).
Phân loại thuốc BVTV :
Có nhiều cách để phân loại thuốc bảo vệ thực vật [19], có thể phân loại thuốc theo
đối tượng phòng trừ, theo cơ chế tác động, theo mức độ độc h
ại,
+ Phân loại theo đối tượng phòng trừ
Theo cách này, thuốc BVTV được chia ra thành các nhóm
- Thuốc trừ nhện
- Thuốc trừ ốc
- Thuốc trừ nấm bệnh
- Thuốc trừ chuột
- Thuốc trừ cỏ
- Thuốc trừ sâu
- Thuốc trừ tuyến trùng
Trong các loại trên lại có thể chia ra theo nhiều cách khác nhau, ví dụ thuốc trừ
sâu có thể phân chia theo bản chất hoá h
ọc: clo hữu cơ, lân hữu cơ, carbamat,
pyrethroid, các nhóm thuốc trừ sâu thế hệ mới…
+ Phân loại theo cơ chế tác động
- Thuốc gây độc do tiếp xúc
- Thuốc gây độc vị độc
- Thuốc nội hấp, thấm sâu
- Nhóm thuốc xông hơi
+ Phân loại theo độ độc
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009

8

bình “ có
hại”(chữ đen
trên nền
vàng)
Chữ thập đen
trên nền
trắng
50-500 200-2000 100-1000 400-4000
III độc ít “chú
ý” (chữ đen,
nền xanh)
Chữ thập đen
trên nền
trắng
500-2000 2000-3000 1000 4000
IV nền xanh
lá cây
> 2000 > 3000
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009

9
1.2 Ảnh hưởng của thuốc BVTV đến môi trường và sức khoẻ con người
Sản xuất nông nghiệp ở bất cứ nơi nào trên thế giới đều không thể thiếu thuốc
BVTV nếu muốn đạt năng suất cao. Tuy nhiên, thuốc BVTV cũng chính là chất độc

10
ngọt, vào cá, qua cây cỏ vào sữa bò là những hiểm hoạ trực tiếp đến sức khoẻ con
người.
Thuốc BVTV không chỉ tích tụ trong đất mà khi bị rửa trôi do quá trình tưới
tiêu, mưa bão, chúng sẽ gây ô nhiễm nguồn nước mặt, nước ngầm và nước vùng cửa
sông. Người ta ước tính khoảng 340 tấn altrazin hay 1,2% lượng thuốc được dùng tại
12 bang của Mỹ đã chảy vào sông Misisipi và ra vịnh Mehicô. Tại California- Mỹ, từ
1980 đến 1984 đã phát hi
ện chất dibromo propan ở 2.000 giếng nước ăn trong khu
vực rộng 18.000 km
2
. Các loại thuốc diệt cỏ như altrazin, alaclo, sumazin trở thành
các chất gây ô nhiễm phổ biến dưới tầng canh tác của nhiều nước trên thế giới. Thậm
chí có nơi đã phát hiện thấy dư lượng thuốc BVTV ngay cả trong nước mưa và sương
mù.
1.3. Tình hình sử dụng và tiêu thụ thuốc BVTV ở Việt Nam và trên thế giới
Những năm trước đây, nhiều người cho rằng thuốc hoá học có thể dậ
p tắt mọi
dịch sâu bệnh, bảo vệ mùa màng, tăng năng suất cây trồng, hơn nữa chi phí cho việc
sử dụng thuốc hoá học lại rất thấp. Chính vì vậy, việc sử dụng thuốc BVTV bị lạm
dụng tràn lan ngay cả khi không thật cần thiết. Theo ước tính, lượng thuốc trừ sâu
bệnh được sử dụng thời gian này ở Mỹ gấp hàng trăm lần lượng thuốc c
ần thiết [6]
[7]. Hậu quả của việc sử dụng này đã gây tác hại rất xấu cho môi trường và con
người. Ngày nay có tới trên 1300 loại hoá chất được công nhận là thuốc BVTV [8]
[20]. Vào cuối những năm 40 của thế kỷ trước, lượng thuốc hoá học sản xuất trên thế
giới chỉ vào khoảng vài trăm tấn (tương đương vài trăm triệu USD), nhưng đến nay
giá trị sản lượng thuốc BVTV trên th
ế giới đã lên đến 31,25 tỷ USD.
Theo nhận định của Hội nghị liên tịch FAO và UNEP, thị trường thuốc BVTV

Malysia 5,245 24.183,5 121,0 4,60 23,06
Phillipin 6,206 24.582,0 174,0 3,90 28,03
Thái Lan 15,623 71.365,8 320,0 4,57 20,48

Tỷ lệ các nhóm thuốc BVTV tiêu thụ trên thế giới cũng không đều nhau. Theo
thống kê năm 1993, tính chung trên thế giới thuốc trừ cỏ chiếm tỷ lệ cao nhất là 46%,
sau đó là thuốc trừ sâu 29% và thuốc trừ bệnh là 21%. Trong khi đó các nước Nam Á
tỷ lệ này có phẩn thay đổi. Pakistan thuốc trừ sâu chiếm 92%, thuốc trừ cỏ chỉ chiếm
6% [1] [3].
Ở Việt nam, trong những năm 90, lượng thuốc tiêu thụ khoảng 4000 tấ
n hoạt
chất, tương đương với khoảng 13 đến 15 ngàn tấn thành phẩm, trị giá khoảng 8,5
triệu USD. Giai đoạn này, mức độ sử dụng hoá chất BVTV còn rất thấp, chỉ vào
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009

12
khoảng 0,40 kg a.i./ha ; chủng loại sử dụng chủ yếu là nhóm clo hữu cơ và lân hữu
cơ. Các loại thuốc này tuy có hiệu quả phòng trừ tốt nhưng lại có độ độc cao, thời
gian phân huỷ chậm gây tác động xấu đến môi trường và con người. Năm 1999, số
lượng thuốc BVTV đạt 33,715 tấn tương đương 158,8 triệu USD, số tiền đầu tư cho
thuốc BVTV là 15,11 USD/ha. Những năm gần đây con số này t
ăng lên rất nhiều,
năm sau tăng hơn năm trước. Nếu năm 2006 giá trị thuốc BVTV nhập khẩu là 305
triệu USD thì năm 2007 là 383 triệu USD (tăng 25% so với 2006). Đến năm 2008
con số này là 472 triệu USD (tăng 23,3% so với 2007) ; dự đoán con số này sẽ không
giảm vào 2009 (Nguồn từ Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn).
Cơ cấu các loại thuốc BVTV ở Việt Nam cũng như một số nước Nam Á, số

13
thuốc BVTV khác được nhập lậu qua biên giới, đặc biệt là biên giới phía Bắc hầu
như không được kiểm soát. Trong số này có không ít loại thuốc đã bị cấm sử dụng.
Về số lượng các chủng loại thuốc BVTV thương mại đang lưu hành trên thị
trường cũng gia tăng rất nhanh. Chỉ trong vòng 6 năm (từ năm 1998 đến 2004), số
lượng tên thuốc BVTV thương mại đã tăng g
ấp đôi, trong đó thuốc trừ sâu chiếm tỷ
lệ rất cao (499/261) khoảng 45%, thuốc trừ bệnh (364/208) chiếm khoảng 32%, thuốc
trừ cỏ (266/156) chiếm khoag 20%.
Năm 2000, Cục Bảo Vệ thực vật đã có đợt thanh tra lớn, kết quả 70% trong số
19.063 cơ sở bán lẻ thuốc BVTV tại các tỉnh và thành phố trong cả nước hoạt động
không có giấy phép, hoặc bán thuốc ngoài danh mục, hàng không đúng qui cách
Ngoài ra kiế
n thức về sử dụng thuốc BVTV sao cho an toàn, bảo đảm sức khoẻ và
bảo vệ môi trường của đại đa số nông dân còn rất thấp. Nhiều nơi nông dân thích mua
thuốc rẻ, có độc tính cao để sử dụng. Điều này càng làm tăng nguy cơ ngộ độc cho
người sử dụng và huỷ hoại môi trường sống.
1.5. Phương pháp xác định dư lượng thuốc BVTV
1.5.1. Phương pháp phân loại để phân tích thuố
c BVTV
Do tính chất phức tạp của thuốc BVTV: về số lượng (tới trên 1000 chất), về
đặc tính hoá học (rất nhiều nhóm chất khác nhau), và về cả phương thức sử dụng, đối
tượng sử dụng. Chính vì vậy việc phân tích dư lượng thuốc BVTV cần phải được
phân loại cụ thể cho từng đối tượng. Theo tổ chức tiêu chuẩn CODEX, nông sản thực
phẩm và thức ăn ch
ăn nuôi được phân loại thành 86 nhóm khác nhau để phân tích dư
lương thuốc BVTV [26]. Việc phân loại này được chia thành 5 lớp : A,B,C,D và E.
- Lớp A : Các mặt hàng thực phẩm ban đầu có nguồn gốc thực vật, từ nhóm 1
đến nhóm 29.
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009

Để bảo đảm tính khách quan, mẫu lấy phải đủ đại diện cho lô hàng phân tích.
Đối với phân tích dư lượ
ng thuốc BVTV thì yêu cầu này càng được qui định một
cách nghiêm ngặt. Trong quá trình lấy mẫu ban đầu, cần tránh không gây nhiễm
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009

15
bẩn mẫu hoặc biến đổi mẫu. Việc lấy mẫu phải phù hợp về số lượng và vị trí khi
lấy mẫu. Đối với đối tượng dạng rời, về số lượng mẫu ban đầu cần lấy theo bảng
sau :
Bảng 3. Số lượng mẫu ban đầu cần lấy
STT Khối lượng lô hàng
(kg)
Số lượng nhỏ nhất các mẫu ban đầu cần l
ấy
1 < 50 3
2 51-500 5
3 501-2000 10
4 >2000 15

Về khối lượng mẫu cần lấy cũng có những qui định cụ thể tuỳ thuộc đối
tượng, dạng sản phẩm. Tiêu chuẩn Việt Nam qui định cho từng đối tượng, dạng sản
phẩm như sau:
Bảng 4. Khối lượng mẫu cần lấy
STT Hàng hoá Tên Lượng yêu cầu
nhỏ nhất
1

- Dưa gang
- Dưa chuột
- …
2 kg (Ít nhất 5
đơn vị)
4 Các sản phẩm sữa
- Sữa nguyên
chất
- Bơ
- Pho mat
- …
0,5 kg
5
Thịt, thịt gia cầm, mỡ cá, các
sản phẩm thuỷ sản và gia súc
khác
1 kg
6 Dầu thực vật và mỡ 0,5 kg
7
Ngũ cốc và các sản phẩm của
ngũ cốc
1kg

Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009

17
1.5.3. Phương pháp phân tích dư lượng thuốc BVTV
18
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), về nguyên tắc, kỹ thuật tách bằng
HPLC giống với sắc ký cột truyền thống, tuy nhiên HPLC dùng bơm cao áp, cột nhồi
nhỏ, các cấu tử được phát hiện bằng các detector có độ nhậy cao.
- Phương pháp sắc ký khí (GC), phương pháp này liên quan đến sự tương tác giữa
pha hơi và pha tĩnh nên khó phát hiện các chất không bay hơi. Có hai loại sắc ký khí
là sắc ký khí - lỏng (pha tĩnh là chất lỏng) và sắc ký khí - rắ
n (pha tĩnh là chất rắn).
Mẫu được bơm vào buồng mẫu có nhiệt độ cao đủ để mẫu có thể hoá hơi, khí mang
sẽ kéo theo các cấu tử phân tích qua cột. Tại đây sẽ có sự tương tác với pha tĩnh dẫn
đến thời gian lưu của các cấu tử sẽ khác nhau. Các cấu tử sẽ lần lượt đi ra khỏi cột và
đi vào detector. Detector sẽ cho tín hiệu khi có mặt một chất hoặc m
ột nhóm chức
nào đó. Tín hiệu này có cường độ tỷ lệ với nồng độ cấu tử được phát hiện.
- Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS). Sự kết hợp giữa sắc sắc ký khí (GC) và
khốiphổ (MS), tạo nên một phương pháp phân tích đặc biệt có hiệu quả trong lĩnh
vực hoá phân tích. Hai thiết bị này có khả năng bổ sung và hỗ trợ cho nhau trong quá
trình phân tích (GC: tách, MS: phát hiện), vì vậy phương pháp này được sử
dụng rất
hữu hiệu cho quá trình khảo sát, định lượng các chất[13]. Hai kỹ thuật trên ghép nối
với nhau có thể tách và định lượng các chất có nồng độ 10
-10
gram hoặc nhỏ hơn nữa,
đây là nồng độ rất khó phát hiện ở các phương pháp phân tích công cụ khác. Ngoài
ra, với sự kết nối này, những mẫu không bền trong thời gian bảo quản cũng có có thể
được phân tích một cách thuận lợi, đặc biệt là việc phân tích các hỗn hợp phức tạp.
Nhờ đó, có thể tiết kiệm khá nhiều thời gian thực nghiệm vì phân lập mẫu theo
nguyên tắc điề

u có nồng độ rất nhỏ (tới 10
-10
g).
Về nguyên tắc hoạt động của detector khối phổ, khi cho một chất ở trạng thái
khí va chạm với một dòng electron thì phân tử chất có thể bị tách ra một hoặc hai
electron để trở thành các ion mang dương mang điện tích 1 hoặc 2; cũng có thể quá
trình va chạm này làm phân tử chất tiếp nhận thêm electron để trở thành ion âm gọi là
ion hoá phân tử. Khi va chạm mạnh hơn thì phân tử còn có thể bị phá vỡ ra thành
nhiều phần khác nhau mang đ
iện tích dương hoặc âm. Sự phá vỡ này hoàn toàn phụ
thuộc vào năng lượng va chạm dẫn đến các cách phá vỡ phân tử khác nhau. Các ion
này sẽ được tách và đo khối lượng sau đó ghi trên sắc phổ đồ.
Một ưu điểm của sự kết hợp GC/MS là có thể được áp dụng một cách hữu
hiệu cho việc nghiên cứu và phân tích các chất đồng vị bền. Nhờ những ưu điểm
đó
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009

20
mà kỹ thuật phân tích GC/MS ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong phân tích dư
lượng các chất kích thích, độc chất dễ bay hơi trong kiểm soát vệ sinh an toàn thực
phẩm và bảo vệ môi trường.
Ngoài những kỹ thuật phân tích đã nêu trên, hiện nay với sự phát triển không
ngừng của khoa học, kỹ thuật phân tích sắc ký khố phổ đã nâng lên thành
LC/MS/MS; GC/MS/MS, với sự ghép nối hai lần khối phổ này làm tăng lên rất nhiều
độ chính xác củ
a phương pháp, và khẳng định sự chắc chắn cho các kết quả thu được.


, Cyanofenphos, Diazinon, Dimethoate,
Edifenphos, EPN, Ethion, Ethoprophos, Etrimfos, Fenitrothion, Fensulfothion,
Fenthion, Iprobenfos, Isoxathion, Malathion, Methidathion, Methylparathion,
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009

21
Parathion, Phenthoate, Phorate, Phosalone, Pirimiphos-methyl, Prothiofos,
Quinalphos, Salithion, , Terbufos, Tolclofos-methyl.
Nhóm Pyrethroid: 10 loại
Bifenthrin, Cyfluthrin, Cyhalothrin, Cypermethrin, Ethofenprox,
Fenpropathrin, Fenvalerate, Flucythrinate, Fluvalinate, Permethrin, Tefluthrin
.
Nhóm cacbamate: 12 loại
Bendiocarb, Benthiocarb, Carbaryl, Chloro IPC, Diethofencarb, Fenobucarb,
Isoprocarb, Metolcarb, Pirimicarb, Propoxur, Swep, XMC, Xylylcarb.
Nhóm Anilide: 6 loại
Alachlor, Flutolanil, Mepronil, Metalaxyl, Oxadixyl, Propanil .
Nhóm Acaricide: 3 loại
Halfenprox, Pyridaben, Tebufenpyrad.
Nhóm ức chế tổng hợp sinh học Ergosterol (EBI): 5 loại
Bitertanol, Fenarimol , Propiconazole , Triadimefon, Triadimenol,
Triflumizole (Triflumizole and Triflumizole metabolite)Nhóm ức chế sự tăng trưởng của côn trùng (IGR): 1 loại
Buprofezin.
Các loại khác: 9 loại

- Bình cầu cổ nhám loại 300ml và 100ml.
- Ống đong 100ml, 200ml.
- Phễu lọc chân không Kiriyama loại 60mm.
-
Phễu thủy tinh.
- Giấy lọc 5C.
- Các loại pipet thể tích 0,5ml, 1ml, và 2ml, pipet Pasteur:loại thủy tinh
dài.
- Các bình định mức 10ml, 20ml, 50ml, 100ml.
- Ống nghiệm, bông thủy tinh.
- Bể lọc chân không, Supelco
TM
.
- Lọ thủy tinh (Vial) đựng mẫu loại 1,5 đến 2ml, dung cho hệ bơm mẫu tự
động của hệ thống GC/MS.
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009

23
- Các loại cột làm sạch pha rắn: Supelclean
TM
ENVI-Carb/LC-NH
2
6ml
(500mg/500mg): Supelco
TM
part# 54035-U, Cột Florisil, Ôxit nhôm,
Silicagen. 24
Dùng pipet lấy chính xác 1ml dung dịch nội chuẩn gốc nồng độ 1mg/ml
cho vào bình định mức 100ml, định mức đến vạch bằng dung môi aceton.
* Pha dung dịch chuẩn:
- Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1mg/ml pha trong bình định mức màu
nâu, cổ nhám bảo quản ở nhiệt độ < 4
0
C để tránh bay hơi, dung môi pha
là aceton.
- Dung dịch chuẩn trung gian: Dung dịch này có nồng độ 100 µg/ml được
chuẩn bị bằng cách lấy chính xác 1ml dung dịch chuẩn gốc 1mg/ml cho
vào bình định mức nâu 10ml, định mức đến vạch bằng acetone, lắc đều,
bảo quản ở nhiệt độ < 4
0
C.
- Dung dịch chuẩn làm việc hàng ngày: Dung dịch này được pha ở nồng
độ 10 µg/ml bằng cách lấy chính xác 1ml dung dịch chuẩn bằng acetone,
lắc đều, bảo quản ở nhiệt độ < 4
0
C.
* Xây dựng đường nội chuẩn:
Đường nội chuẩn được xây dựng dựa trên mối quan hệ giữa tỷ lệ nồng độ chất
cần phân tích với nồng độ chất nội chuẩn ( biểu diễn trên trục hoành) và tỷ lệ của số
đếm diện tích píc của chất cần phân tích với nội chuẩn ( biểu diễn trên trục tung).
X ( trục hoành): Nồng độ của chất phân tích/ nồ
ng độ chất nội chuẩn.