1
BỘ Y TẾ
BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BIẾN ĐỔI GEN
TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI
PGS.TS. Nguyễn Nghiêm Luật
9209 Năm 2012
2
Trang bìa 2
BỘ Y TẾ
3. Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Y Hà Nội
4. Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y tế
5. Thư ký đề tài: CN Nguyễn Thúy Hà
6. Phó chủ nhiệm đề tài ho
ặc ban chủ nhiệm đề tài (nếu có):
7. Danh sách những người thực hiện chính:
- PGS TS Nguyễn Nghiêm Luật
- ThS Nguyễn Phương Anh
- TS Trần Vân Khánh
- CN Nguyễn Thúy Hà
8. Các đề tài nhánh (đề mục) của đề tài (nếu có)
(a) Đề tài nhánh 1 (đề mục 1)
- Tên đề tài nhánh:
- Chủ nhiệm đề tài nhánh:
(b) Đề tài nhánh 2
- Tên đề tài nhánh
- Chủ nhiệm đề tài nhánh
9. Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 10 năm 2006 đến tháng 10 năm 2009
4
Phụ lục 2
BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ
Về tình hình thực hiện và những đóng góp mới
của đề tài kh&cn cấp bộ
1. Tên đề tài:
“Nghiên cứu phát hiện biến đổi gen trong ung thư đại trực tràng”.
2. Thuộc Chương trình (nếu có):
3. Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Nguyễn Nghiêm Luật
4. Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Y Hà Nội
ĐTT thể FAP.
- Các đột biến dịch khung (cài hoặc xóa từ 1 đến 4 nucleotid) là loại đột biến
phổ biến nhất, chiếm 86%, còn lại là đột biến thay thế (1 hoặc 2 nucleotid). Các
đột biến dịch khung và thay thế nucleotid có thể dẫn
đến các mã kết thúc
(stop codon), làm cho sự sinh tổng hợp protein APC sớm bị dừng lại, protein
APC bị cắt đoạn ngắn, chức năng ức chế khối u bị giảm hoặc mất. Kết quả
này cho thấy vai trò của đột biến gen APC trong cơ chế bệnh sinh của bệnh
ung thư ĐTT thể FAP.
- Vùng tập trung đột biến của gen APC là từ codon 1001-1400, chiếm
89,40%, trong khi ở vùng codon 656 – 1000, số đột biến chỉ chiếm 10,60%.
- Không phát hiện được các đột biến trên gen APC ở những người khỏe
mạnh đối chứng.
2. Đột biến trên exon 15 gen APC ở các thành viên có quan hệ huyết thống
với bệnh nhân mang gen đột biến
- Có sự lặp lại giống nhau về vị trí và kiểu đột biến của gen APC
giữa các thành
viên trong cùng một gia đình.
- 15/25 (60%) thành viên của 15 gia đình bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể
FAP có mang gen APC đột biến, trong đó chỉ có 3/15 (20%) người thân mang
gen đột biến đã biểu hiện bệnh đa polyp tuyến gia đình (FAP). Như vậy, các đột
6
biến của gen APC có khả năng di truyền ở các gia đình bệnh nhân ung thư đại trực
tràng thể đa polyp tuyến gia đình.
8.1/ Về giải pháp khoa học - công nghệ: đã sử dụng những kỹ thuật sinh học
phân tử hiện đại nhất hiện nay và đã xác định được các loại đột biến trong ung
thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình (FAP).
8.2/ Về ph
ương pháp nghiên cứu: sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện
học Việt Nam; 377 (1): 17-21.
3. Về tham gia hội nghị khoa học: Đã tham gia báo cáo khoa học tại 3 hội nghị
khoa học:
- Hội nghị Khoa học Hội Hóa sinh Y Dược Hà Nội và các tỉnh phía Bắ
c
lần thứ XI, Tam Đảo 19-20/ 8/ 2010 (Báo cáo khoa học).
- Hội nghị Sinh học phân tử và Hóa sinh Y học toàn quốc lần thứ 2, Hà
Nội, 18-19/ 9/ 2010 (Poster).
- Hội thảo Quốc gia Phòng chống Ung thư lần thứ XV, Hà Nội, 7-8/ 10/
2010 (Báo cáo khoa học).
Hà Nội, ngày 10 tháng 4 năm2011
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
(Họ, tên và chữ ký) PGS TS Nguyễn Nghiêm Luật
8
Phụ lục 4
Danh sách tác giả của đề tài KH&CN cấp Bộ
1. Tên Đề tài: “Nghiên cứu phát hiện biến đổi gen trong ung thư đại trực
tràng”.
2. Thuộc Chương trình (nếu có):
3. Thời gian thực hiện: 10/ 2006-10/ 2009
4. Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Y Hà Nội
5. Bộ chủ quản: Bộ Y Tế
6. Danh sách tác giả:
TT Học hàm, học vị, họ và tên Chữ ký
Tổng kinh phí được duyệt: 340 triệu VND
Tổng kinh phí đã cấp: 340 triệu VND
Tổng kinh phí đã quyết toán: 340 triệu VND
Các hoạt động chi tiêu của đề tài đảm bảo đúng theo đề cương đã duyệt và đảm
bảo qui định về tài chính của Nhà nước.
Số kinh phí còn lại: (chỉ để khoả
ng 20 – 25 triệu đồng) phục vụ cho nghiệm
thu cấp cơ sở và nghiệm thu cấp BYT.
XÁC NHẬN CỦA PHÒNG TÀI CHÍNH CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PGS TS Nguyễn Nghiêm Luật
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
TỔNG QUAN 3
1.1. Đa polyp tuyến gia đình (FAP) 4
1.2. Cấu trúc và chức năng của gen APC 5
1.2.1. Cấu trúc của gen APC và protein APC 6
1.2.2. Các chức năng
của gen APC và protein APC 11
1.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen APC 15
1.3.1. Kỹ thuật PCR 16
1.3.2. PCR đơn mồi 17
1.3.3. PCR đa mồi 17
1.3.4. PCR sao chép ngược 18
1.3.5. Real-time PCR 18
1.3.6. Kỹ thuật MLPA 19
1.3.7. Kỹ thuật giải trình tự gen 19
2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
CtBP C-terminal-binding protein: protein gắn C tận
dAPC Drosophila APC: APC của ruồi giấm
DNA Desoxyribonucleic acid
EB1 End binding 1: protein điều hòa bộ khung tế bào bằng cách
gắn vào các vi ống và kiểm soát sự sinh sôi của chúng.
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EphB Một trong các gen đích của con đường tín hiệu Wnt
FAP Familial adenomatous polyposis: đa polyp tuyến gia đình
GEF Guanine nucleotide exchange factor: một yếu tố trao đổi
guanin của Rac, thuộc gia đình Rho của các GTPase.
GSK3β Glycogen synthase kinase 3-beta
IQGAP1 IQ-motif-containing GTPase
activation protein 1: protein 1
hoạt hóa GTPase chứa IQ.
LEF Lymphoid enhancer factor: yếu tố tăng cường lympho
MCR Mutation cluster region: vùng bó đột biến
MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification
mRNA Messenger ribonucleic acid: ribonucleic acid thông tin
MYC Tên của một trong các gen đích của con đường tín hiệu Wnt
PCR Polymerase Chain Reaction
RT-PCR Revers transcriptase-PCR
Rac1 Một protein trong gia đình Rho của GTPase.
TCF T-cell factor: yếu tố tế bào T 1
MỞ ĐẦU
Ung thư đại trực tràng (colorectal cancer), có thể gồm các khối ung thư ở
2
trước khi ung thư xuất hiện, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát hiện
biến đổi gen trong ung thư đại trực tràng”, trong đó tập trung vào nghiên cứu
các đột biến dòng mầm của gen APC ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể đa
polyp tuyến gia đình” nhằm 2 mục tiêu sau đây:
1. Phát hiện các đột biến trên exon 15 của gen APC ở các bệnh nhân ung
thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đ
ình.
2. Đánh giá các đột biến trên exon 15 của gen APC ở những người thân
trong gia đình các bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình.
3
4
1.1.Đa polyp tuyến gia đình (FAP):
Đa polyp tuyến gia đình là bệnh di truyền trội có đặc điểm là sự phát triển
của hàng trăm đến hàng nghìn u tuyến ở đại tràng và trực tràng . Tỷ lệ mắc FAP
ở Hoa Kỳ là 1/ 5000 và ở Nhật là 1/17.000 dân [52], ở Châu Âu tỷ lệ mắc là
1/11.300- 37.600 dân. FAP phân bố đều ở cả hai giới. Ở Việt Nam hiện chưa
có thống kê cụ thể về FAP. Nguyên nhân của bệnh FAP là do có sự
đột biến ở
gen APC, một loại gen ức chế khối u, có vai trò ức chế sự hình thành của khối u
mới sinh ở đại tràng. Độ tuổi xuất hiện triệu chứng của FAP là 16. Bệnh nhân
được chẩn đoán FAP ở độ tuổi trung bình là 36. Hầu hết bệnh nhân FAP sẽ phát
triển thành ung thư nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp ở giai đoạn sớm
củ
a bệnh [75]. Trên thế giới, 85% ung thư đai trực tràng là do ngẫu nhiên, khoảng
15% có tính chất gia đình trong đó FAP chiếm tỷ lệ khoảng 1% [24].
Hình 1. Hình ảnh đa polyp tuyến gia đình đại trực tràng
Bệnh polyp gia đình (FAP), yếu tố di truyền thể hiện rất rõ: tần số truyền
bệnh cho con ở các gia đình này đến 50%.
Biểu hiện lâm sàng của FAP thường là phân lẫn máu, phân lỏng, đau
bụng, đôi khi xuất hiện polyp, nhất là loại có cuống ở thấp, gần hậu môn có thể
bị lòi ra. Tuy nhiên, có trường hợp bệnh nhân hoàn toàn không thấy tri
ệu chứng
5
lâm sàng nhưng vẫn có thể có polyp đại trực tràng. Vì vậy, phải chú ý những
trường hợp có tiền sử gia đình, đặc biệt ở nam giới trên tuổi 45.
nguyên nhân khởi phát và phát triển của ung thư đại trực tràng.
6
1.2.1. Cấu trúc của gen APC và protein APC
Gen APC nằm ở vùng 5q21 của nhiễm sắc thể thứ 5. Việc xác định một
bệnh nhân bị đa polyp tuyến gia đình (FAP) đại trực tràng gắn liền với sự chậm
phát triển tâm thần và các bất thường khác là đầu mối đầu tiên để xác định vị trí
của APC, người ta thấy có sự xóa đoạn của nhiễm sắc thể 5q21 (Kinzler và
cộng sự, 1991 [43]). Phân tích sự
liên quan của các gia đình với FAP đã dẫn đến
việc lập bản đồ gen của gen APC ở nhiễm sắc thể 5q21. Sau đó, gen APC đã
được người ta dòng hoá, nhận biết và xác định đặc tính (Bodmer và cộng sự,
1987 [23], van Es và cộng sự, 2001 [73]).
Gen APC ở dạng phổ biến nhất gồm 8972 cặp base nitơ (bp) trải dài trên
21 exon và mã hóa cho một protein gồm 2.843 acid amin. Exon 10A nằm ở
phần cuối của exon 10, là đối tượng của sự thay thế
và bổ sung 18 acid amin ở
protein APC khi sao chép.
Exon 15 chiếm trên 75% chuỗi mã hóa (coding sequence) của gen APC và
là đối tượng hay gặp nhất của cả các đột biến dòng mầm (germline mutations)
và của cả các đột biến dòng thân (somatic mutations) .
Gen adenomatous polyposis coli (APC) là một gen áp chế khối u quan
trọng. Các đột biến ở gen APC đã được tìm thấy không chỉ ở phần lớn các ung
thư đại tràng mà còn ở một số ung thư khác, ví dụ như ở ung thư gan.
Các đột biến dòng mầm của gen APC thường dẫn đến bệnh đa polyp tuyến
gia đình (familial adenomatous polyposis: FAP), được đặc trưng bởi hàng trăm
đến hàng ngàn khối u (polyps) trong đại tràng (Groden và cộng sự, 1991 [29]).
Các đột biến ở gen APC đã được phát hiện ở khoảng 60% các ung thư đại tràng
thể đa polyp tuyến gia đình cũng như ung thư
đại tràng thể ngẫu nhiên (sporadic
đường cần thiết cho sự hình thành khối u (tumorigenesis), protein APC cũng có
vai trò đối với sự phát triển và sự hằng định nội môi (homeostasis) của nhiều
loại tế bào, chẳng hạn như các tế bào biểu mô và các tế bào lympho. Các nghiên
cứu sâu hơn đã chỉ ra rằ
ng protein APC còn đóng các vai trò trong một số các
qúa trình cơ bản của tế bào. Các quá trình này bao gồm sự kết dính và di trú của
tế bào, sự tổ chức mạng lưới actin và các vi ống, sự hình thành trục chính
(spindle) và sự phân chia nhiễm sắc thể. Sự mất điều hòa các quá trình này gây
Vùng Armadillo
Vùng gắn axin
Số codon
Vùng gắn EB1
Vùng cơ bản
Vùng lặp lại 20 acid
amin
Vùng lặp lại 15 acid
amin
8
nên bởi các đột biến ở gen APC có liên quan đến việc khởi đầu và lan rộng của
ung thư đại tràng.
Protein APC gồm 6 vùng chức năng chính là: vùng Armadillo, vùng lặp
lại 15 aa, vùng lặp lại 20 aa, vùng cơ bản, vùng gắn EB1 và vùng gắn axin
(Hình 2).
- Vùng Armadillo: Vùng Armadillo ở protein APC là vị trí gắn của β-catenin,
GSK3β và axin, sự gắn này có tác dụng kích thích sự phosphoryl hóa và sự
thoái hóa của β-catenin, giải phóng β-catein khỏi nhân tế bào, giữ cho β-catein
không tương tác với TCF, kiểm soát s
ự phân bố của β-catenin giữa nhân tế bào/
bào tương tế bào và màng bào tương, làm tăng mức độ E-cadherin ở màng bào
lặp đi lặp lại thứ ba và thứ tư, thứ tư và thứ năm và sau đoạn thứ bảy. Axin
cùng với β-catenin đã gắn vào protein APC tạo thành một phức h
ợp có tác
dụng ức chế sự sao chép của β-catenin/TCF, điều này hoạt hóa Myc và
cyclin D1, có tác dụng kiểm soát sự sinh sôi và biệt hóa của tế bào [31].
Hình 3: Sự liên quan giữa kiểu đột biến gen APC và kiểu hình của đa polyp tuyến gia đình
(FAP). CHRPE: chứng phì đại bẩm sinh biểu mô sắc tố võng mạc (Fearnhead NS và
cộng sự [26]).
Bình thường (1-2843)
FAP nặng (1249-1330)
Số codon
Liên quan đến u nguyên bào gan (457-1309)
Liên quan đến các khối u cứng (1445-1578
CHRPE (463-1387)
FAP nhẹ (1860-1987)
FAP nhẹ (1860-1987)
Bình thường (1-2843)
FAP nặng (1249-1330)
Số codon
Liên quan đến u nguyên bào gan (457-1309)
các đột biến nằm trong vùng codon 1249-1330, bệnh nhân sẽ bị đa polyp tuyến
gia đình thể nặng. Nếu các đột biến nằm ở một trong hai vùng codon 1-163 và
vùng codon 1860-1987, bệnh nhân sẽ bị đa polyp tuyến gia đình thể nhẹ. Nếu
các đột biến nằm trong vùng codon 463-1387, khoảng 60% bệnh nhân FAP sẽ
bị chứng phì đại bẩm sinh biểu mô sắc tố võng m
ạc (congenital hypertropy of
the retinal pigment epithelium CHRPE). Nếu các đột biến nằm trong vùng từ
codon 1445-1578, bệnh nhân sẽ bị các u xơ cứng (desmoid tumours). Nếu các
đột biến nằm trong vùng từ codon 457-1039, bệnh nhân sẽ bị u nguyên bào gan
(hepatoblastoma) (Hình 3).
11
1.2.2. Các chức năng của gen APC và protein APC
Chức năng của gen APC được thể hiện qua chức năng của sản phẩm sao
chép và sinh tổng hợp của nó là protein APC. Protein APC là một protein áp chế
ung thư đa chức năng. Các vùng chức năng đa dạng của protein APC và các đột
biến cắt ngắn của nó gây nên sự mất chức năng của nó, dẫn đến sự tạo thành các
polyp và ung thư đại trực tràng được thể hi
ện ở hình 4.
Protein APC là một protein đa chức năng, gồm 6 chức năng chính:
- Protein APC kìm hãm con đường tín hiệu Wnt kinh điển
Con đường tín hiệu Wnt kinh điển gồm một loạt các sự kiện xảy ra khi các
protein Wnt gắn vào các thụ thể bề mặt tế bào của một số protein đặc hiệu, cuối
cùng dẫn đến sự thay đổi về số lượng β-catenin đi vào nhân tế bào. Các protein
đặc hiệu này là thành phầ
n then chốt của một phức hợp của thụ thể Wnt liên
quan đến màng tế bào mà khi được hoạt hóa, sự gắn của Wnt sẽ ức chế một
phức hợp thứ hai của các protein gồm axin, GSK-3 và protein APC. Bình
thường, phức hợp axin/GSK-3/APC thúc đẩy sự thoái hóa phân tử tín hiệu nội
bào β-catenin. Sau đó, "phức hợp phân hủy β-catenin" này bị ức chế, β-catenin
mất chức năng của nó, dẫn đến sự tạo thành các polyp và ung thư đại trực tràng.
(A) Các protein APC1 và APC2 ở ruồi dấm, chuột và người. Hai gen APC của ruồi giấm
không giống hai gen của động vật có vú.
(B) Sơ đồ các miền ở toàn bộ chiều dài của protein APC và chức năng của chúng. APC kích
thích sự di cư của tế bào qua t
ương tác với ASEF, IQGAP1 hoặc với mDia. APC có liên quan
đến sự kết dính tế bào thông qua kiểm soát sự phân bố của β-catenin giữa nhân tế bào / bào
tương (cytoplasm) và màng bào tương của tế bào. APC ức chế sự sao chép (transcription) của
β-catenin/ TCF thông qua những tương tác với β-catenin hoặc với CtBP. APC điều hòa sự
phân chia nhiễm sắc thể thông qua sự gắn kinetochore và qua sự áp chế tín hiệu Wnt kinh
điển. Mũi tên màu đỏ và màu xanh cho biết sự “kích hoạt” và “ức chế
”, tương ứng.
(C) Sơ đồ của một trong những protein APC bị cắt ngắn ở đầu tận C và vai trò của nó trong
bệnh sinh khối u (tumorigenesis). Protein APC bị cắt ngắn kích thích di cư của tế bào mạnh
mẽ hơn so với protein APC có chiều dài đầy đủ, trái lại, sự mất các vùng ở đầu tận của C của
protein APC kích hoạt con đường tín hiệu Wnt và cảm ứng sự bất ổn định nhiễm sắc th
ể.
Các loại protein APC ở
người, chuột và ruồi giấm
Protein APC với độ dài
đầy đủ
Protein APC
bị cắt ngắn ở đầu tận C
Kích thích sự bám dính tế
bào
Kích thích sự di cư của tế bào
Kích thích sự ổn định của
các vi ống
Kích thích sự phân chia
nhiễm sắc thể
trúc của trục chính
Hoạt hóa Asef
Cảm ứng sự mất ổn định
nhiễm sắc thể
Cảm ứng sự sinh sôi
và ức chế sự biệt hóa
Kích thích mạnh
sự di cư của tế bào
Hoạt hóa sự sao
chép β-catenin/TCF13
protein thụ thể của Wnt. Ví dụ, Sclerostin có thể gắn vào LRP và ức chế con
đường tín hiệu Wnt.
Từ những kết quả nghiên cứu thu được [28, 34, 42, 70], người ta cho rằng
protein APC kìm hãm con đường Wnt kinh điển bằng cách gắn với β-catenin,
GSK3β và Axin để kích thích sự phosphoryl hóa và sự thoái hóa của β-catenin,
gắn với β-catenin tại các vùng lặp lại Armadillo, vùng lặp lại 15 hoặc 20 acid
amin, để giải phóng β-catenin khỏi nhân tế bào, làm β-catenin không tương tác
với TCF và gắn với CtBP tại vùng lặp lại 15 acid amin để sắp xếp lại phức hợp
kìm hãm đối ví bộ máy sao chép.
- Protein APC kích thích sự bám dính tế bào
Sự bấ
t hoạt protein APC cũng được cho là thúc đẩy sự sinh khối u
(tumorigenesis) qua việc làm mất độ bám dính của tế bào (Bienz, 2002 [21],
Bienz và Hamada, 2004 [22]). Protein APC được tìm thấy ở màng bào tương
của các tế bào biểu mô động vật có vú cả trong cơ thể (in vivo) và cả trong nuôi
cấy (Miyashiro và cộng sự, 1995 [51]). Protein APC tương tác với β-catenin,
trong sự ổn định các vi ống. Vì APC có thể tạo thành một phức hợp với EB1 và
mDia ở đoạn cuối các vi ống ổn định nên sự tham gia của APC vào sự di cư
của tế bào có thể bao gồ
m sự kết hợp với mDia. Do đó, APC kích thích sự di cư
tế bào qua một vài con đường khác nhau.
- Protein APC giúp sự phân chia nhiễm sắc thể chính xác
Sự mất ổn định nhiễm sắc thể (chromosome instability: CIN) được xem là
một trong những động lực kích thích sự tạo thành khối u (tumorigenesis). Một
số nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự mất APC cảm ứng sự phân chia sai lệch (mis-
segregation) của nhiễm sắc thể (Aoki và cộng sự
, 2007 [18]).
Từ những kết quả nghiên cứu thu được [18, 33, 71], người ta cho rằng
protein APC giúp sự phân chia nhiễm sắc thể chính xác bằng cách gắn vào các
vi ống tại vùng cơ bản (basic domain) để điều hòa các chức năng của
Copyright: Tài liệu đại học ©