BỘ Y TẾ

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BIẾN ĐỔI GEN
TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI

PGS.TS. Nguyễn Nghiêm Luật

9209

Năm 2012
1


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
TỔNG QUAN................................................................................................. 3
1.1. Đa polyp tuyến gia đình (FAP) ......................................................... 4
1.2. Cấu trúc và chức năng của gen APC.................................................. 5
1.2.1. Cấu trúc của gen APC và protein APC ....................................... 6
1.2.2. Các chức năng của gen APC và protein APC ........................... 11
1.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen APC ............. 15
1.3.1. Kỹ thuật PCR.............................................................................. 16
1.3.2. PCR đơn mồi ............................................................................. 17
1.3.3. PCR đa mồi................................................................................ 17
1.3.4. PCR sao chép ngược ................................................................. 18

AFAP

Attenuated familial adenomatous polyposis: đa polyp tuyến
gia đình thể nhẹ.

APC

Adenomatous polyposis coli: đa polyp tuyến

CHRPE

Congenital hypertrophy of the retinal pigment epithelium:
chứng phì đại bẩm sinh biểu mô sắc tố võng mạc.

CIN

Chromosome instability: sự bất ổn định của nhiễm sắc thể

CLIP170

Một protein có chức năng làm ổn định vi ống trong tế bào

CtBP

C-terminal-binding protein: protein gắn C tận

dAPC

Drosophila APC: APC của ruồi giấm


IQGAP1

IQ-motif-containing GTPase activation protein 1: protein 1
hoạt hóa GTPase chứa IQ.

LEF

Lymphoid enhancer factor: yếu tố tăng cường lympho

MCR

Mutation cluster region: vùng bó đột biến

MLPA

Multiplex ligation-dependent probe amplification

mRNA

Messenger ribonucleic acid: ribonucleic acid thông tin

MYC

Tên của một trong các gen đích của con đường tín hiệu Wnt

PCR

Polymerase Chain Reaction

RT-PCR

lành tính nhưng về sau có thể trở thành ác tính nếu không được điều trị. Bệnh
sinh của ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình được cho là do đột
biến của gen APC (adenomatous polyposis coli), một gen áp chế ung thư đa
chức năng (multi-functionality tumor suppressor gene) [31, 36, 44] . Tuy chỉ
chiếm tỷ lệ khoảng 1% ung thư đại trực tràng nói chung nhưng ung thư đại trực
tràng thể đa polyp tuyến gia đình có ý nghĩa quan trọng vì đây là bệnh có khả
năng di truyền cao [24, 27, 36] . Tuy nhiên, ở Việt Nam cho đến nay chưa có đề
tài nghiên cứu nào về các đột biến gen trong ung thư đại trực tràng được công
bố. Vì vậy, để có thể đánh giá nguy cơ của ung thư đại trực tràng thể đa polyp
tuyến gia đình ở những người thân trong gia đình bệnh nhân ung thư đại trực
tràng thể đa polyp tuyến gia đình (FAP) để có biện pháp theo dõi và sử lý sớm
1


trước khi ung thư xuất hiện, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát hiện
biến đổi gen trong ung thư đại trực tràng”, trong đó tập trung vào nghiên cứu
các đột biến dòng mầm của gen APC ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể đa
polyp tuyến gia đình” nhằm 2 mục tiêu sau đây:
1. Phát hiện các đột biến trên exon 15 của gen APC ở các bệnh nhân ung
thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình.
2. Đánh giá các đột biến trên exon 15 của gen APC ở những người thân
trong gia đình các bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình.

2


1. TỔNG QUAN

Ung thư đại trực tràng là bệnh lý ác tính phổ biến (đứng thứ ba tại Mỹ).
Hơn 95% ung thư đại trực tràng là ung thư biểu mô tuyến (adenocarcinoma).

có thống kê cụ thể về FAP. Nguyên nhân của bệnh FAP là do có sự đột biến ở
gen APC, một loại gen ức chế khối u, có vai trò ức chế sự hình thành của khối u
mới sinh ở đại tràng. Độ tuổi xuất hiện triệu chứng của FAP là 16. Bệnh nhân
được chẩn đoán FAP ở độ tuổi trung bình là 36. Hầu hết bệnh nhân FAP sẽ phát
triển thành ung thư nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp ở giai đoạn sớm
của bệnh [75]. Trên thế giới, 85% ung thư đai trực tràng là do ngẫu nhiên, khoảng
15% có tính chất gia đình trong đó FAP chiếm tỷ lệ khoảng 1% [24].

Hình 1. Hình ảnh đa polyp tuyến gia đình đại trực tràng

Bệnh polyp gia đình (FAP), yếu tố di truyền thể hiện rất rõ: tần số truyền
bệnh cho con ở các gia đình này đến 50%.
Biểu hiện lâm sàng của FAP thường là phân lẫn máu, phân lỏng, đau
bụng, đôi khi xuất hiện polyp, nhất là loại có cuống ở thấp, gần hậu môn có thể
bị lòi ra. Tuy nhiên, có trường hợp bệnh nhân hoàn toàn không thấy triệu chứng

4


lâm sàng nhưng vẫn có thể có polyp đại trực tràng. Vì vậy, phải chú ý những
trường hợp có tiền sử gia đình, đặc biệt ở nam giới trên tuổi 45.
FAP được chẩn đoán bằng cách tìm hồng cầu (soi phân bằng kính hiển
vi) hoặc hemoglobin trong phân (xét nghiệm Weber Meyer), siêu âm qua nội soi
đại trực tràng, siêu âm bụng, chụp x quang, chụp cắt lớp vi tính, định lượng
kháng nguyên ung thư phôi trong huyết tương CEA (carcinoembryonic
antigen), sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử (xác định các đột biến trên gen
APC), ...
1.2.Cấu trúc và chức năng của gen APC
Gen APC (adenomatous polyposis coli gene) là một gen ức chế khối u
đa chức năng, gồm 8972 cặp base (bp) nằm trên nhiễm sắc thể 5q21. Sản phẩm

Gen APC ở dạng phổ biến nhất gồm 8972 cặp base nitơ (bp) trải dài trên
21 exon và mã hóa cho một protein gồm 2.843 acid amin. Exon 10A nằm ở
phần cuối của exon 10, là đối tượng của sự thay thế và bổ sung 18 acid amin ở
protein APC khi sao chép.
Exon 15 chiếm trên 75% chuỗi mã hóa (coding sequence) của gen APC và
là đối tượng hay gặp nhất của cả các đột biến dòng mầm (germline mutations)
và của cả các đột biến dòng thân (somatic mutations) .
Gen adenomatous polyposis coli (APC) là một gen áp chế khối u quan
trọng. Các đột biến ở gen APC đã được tìm thấy không chỉ ở phần lớn các ung
thư đại tràng mà còn ở một số ung thư khác, ví dụ như ở ung thư gan.
Các đột biến dòng mầm của gen APC thường dẫn đến bệnh đa polyp tuyến
gia đình (familial adenomatous polyposis: FAP), được đặc trưng bởi hàng trăm
đến hàng ngàn khối u (polyps) trong đại tràng (Groden và cộng sự, 1991 [29]).
Các đột biến ở gen APC đã được phát hiện ở khoảng 60% các ung thư đại tràng
thể đa polyp tuyến gia đình cũng như ung thư đại tràng thể ngẫu nhiên (sporadic
carcinomas) (Powell và cộng sự, 1992 [61]). Các nghiên cứu di truyền sử dụng
mô hình chuột nhắt đột biến đã chứng minh rằng các đột biến ở gen APC có vai
trò trong bệnh sinh khối u ở đường ruột (intestinal tumorigenesis). Các đột biến
đồng hợp tử (homzygous APC mutations) của gen APC ở chuột nhắt dẫn đến sự
chết phôi và sự xóa có điều kiện (conditional deletion) của gen này ở chuột nhắt
6


trưởng thành đã phá vỡ sự hằng định nội môi (homeostasis) không chỉ ở ruột mà
còn ở các mô khác. Những bằng chứng này đã chứng tỏ rằng gen APC cần thiết
cho sự phát triển và sự hằng định nội môi của tế bào và rằng bất hoạt của nó tạo
điều kiện cho sự hình thành khối u (tumorigenesis).
Sản phẩm của gen APC là một protein có tên là protein APC, với 2.843 gốc
acid amin, có khối lượng phân tử 312 kDa, gồm nhiều vùng (domains) liên kết
với các protein khác, như các protein β-catenin, axin, CtBP, Asefs, IQGAP1,



nên bởi các đột biến ở gen APC có liên quan đến việc khởi đầu và lan rộng của
ung thư đại tràng.
Protein APC gồm 6 vùng chức năng chính là: vùng Armadillo, vùng lặp
lại 15 aa, vùng lặp lại 20 aa, vùng cơ bản, vùng gắn EB1 và vùng gắn axin
(Hình 2).
- Vùng Armadillo: Vùng Armadillo ở protein APC là vị trí gắn của β-catenin,
GSK3β và axin, sự gắn này có tác dụng kích thích sự phosphoryl hóa và sự
thoái hóa của β-catenin, giải phóng β-catein khỏi nhân tế bào, giữ cho β-catein
không tương tác với TCF, kiểm soát sự phân bố của β-catenin giữa nhân tế bào/
bào tương tế bào và màng bào tương, làm tăng mức độ E-cadherin ở màng bào
tương và hoạt hóa Asef1, Asef2 và Cdc42, kìm hãm sự sao chép theo con đường
Wnt kinh điển, kích thích sự kết dính và sự di cư của tế bào (Aoki K và Taketo
MM, 2007 [18]).
- Vùng lặp lại 15 acid amin: Vùng lặp lại 15 acid amin ở protein APC là vị trí
gắn của β-catenin, GSK3β và axin, sự gắn này có tác dụng kích thích sự
phosphoryl hóa và sự thoái hóa của β-catein, giải phóng β-catenin khỏi nhân tế
bào, giữ cho β-catein không tương tác với TCF, kiểm soát sự phân bố của βcatein giữa nhân tế bào/ bào tương tế bào và màng bào tương, làm tăng mức độ
E-cadherin ở màng bào tương. Vùng lặp lại 15 acid amin ở protein APC cũng là
vị trí gắn CtBP, tạo nên phức hợp kìm hãm sự sao chép theo con đường Wnt
kinh điển, kích thích bám dính của tế bào (Aoki K và Taketo MM, 2007 [18]).
- Vùng lặp lại 20 acid amin: Vùng lặp lại 20 acid amin ở protein APC là vị trí
gắn của β-catenin, GSK3β và axin, sự gắn này có tác dụng kích thích sự
phosphoryl hóa và sự thoái hóa của β-catenin, giải phóng β-catenin khỏi nhân tế
bào, giữ cho β-catenin không tương tác với TCF, kiểm soát sự phân bố của βcatenin giữa nhân tế bào/ bào tương tế bào và màng bào tương, làm tăng mức độ
E-cadherin ở màng bào tương, kích thích sự kết dính của tế bào [15, 16, 28].
- Vùng cơ bản: vùng cơ bản ở protein APC là vị trí gắn của các vi ống. Sự gắn
của các vi ống vào protein APC có tác dụng điều hòa các chức năng của
8

nhẹ (1860-1987)
(1860-1987)
CHRPE
CHRPE(463-1387)
(463-1387)

Liên
Liên quan
quan đến
đến các
các khối
khối uu cứng
cứng (1445-1578
(1445-1578
Liên
Liên quan
quan đến
đến uu nguyên
nguyên bào
bào gan
gan (457-1309)
(457-1309)

Số
Số codon
codon

Hình 3: Sự liên quan giữa kiểu đột biến gen APC và kiểu hình của đa polyp tuyến gia đình
(FAP). CHRPE: chứng phì đại bẩm sinh biểu mô sắc tố võng mạc (Fearnhead NS và


bị chứng phì đại bẩm sinh biểu mô sắc tố võng mạc (congenital hypertropy of
the retinal pigment epithelium CHRPE). Nếu các đột biến nằm trong vùng từ
codon 1445-1578, bệnh nhân sẽ bị các u xơ cứng (desmoid tumours). Nếu các
đột biến nằm trong vùng từ codon 457-1039, bệnh nhân sẽ bị u nguyên bào gan
(hepatoblastoma) (Hình 3).
10


1.2.2. Các chức năng của gen APC và protein APC
Chức năng của gen APC được thể hiện qua chức năng của sản phẩm sao
chép và sinh tổng hợp của nó là protein APC. Protein APC là một protein áp chế
ung thư đa chức năng. Các vùng chức năng đa dạng của protein APC và các đột
biến cắt ngắn của nó gây nên sự mất chức năng của nó, dẫn đến sự tạo thành các
polyp và ung thư đại trực tràng được thể hiện ở hình 4.
Protein APC là một protein đa chức năng, gồm 6 chức năng chính:
- Protein APC kìm hãm con đường tín hiệu Wnt kinh điển
Con đường tín hiệu Wnt kinh điển gồm một loạt các sự kiện xảy ra khi các
protein Wnt gắn vào các thụ thể bề mặt tế bào của một số protein đặc hiệu, cuối
cùng dẫn đến sự thay đổi về số lượng β-catenin đi vào nhân tế bào. Các protein
đặc hiệu này là thành phần then chốt của một phức hợp của thụ thể Wnt liên
quan đến màng tế bào mà khi được hoạt hóa, sự gắn của Wnt sẽ ức chế một
phức hợp thứ hai của các protein gồm axin, GSK-3 và protein APC. Bình
thường, phức hợp axin/GSK-3/APC thúc đẩy sự thoái hóa phân tử tín hiệu nội
bào β-catenin. Sau đó, "phức hợp phân hủy β-catenin" này bị ức chế, β-catenin
trong bào tương tế bào được ổn định và một số β-catenin có thể đi vào nhân tế
bào và tương tác với các yếu tố sao chép TCF/LEF để thúc đẩy sự biểu hiện gen
đặc hiệu.
Các protein đặc hiệu bề mặt tế bào thường tương tác với một protein vận
chuyển qua màng gọi là LRP. LRP gắn vào các protein đặc hiệu, vào Wnt và
axin có thể làm ổn định phức hợp Wnt / Frizzled / LRP / protein đặc hiệu/ axin /


Hoạt hóa sự sao
chép β-catenin/TCF

Cảm ứng sự sinh sôi
và ức chế sự biệt hóa

Cảm ứng sự phá hủy cấu
trúc của trục chính
Cảm ứng sự mất ổn định
nhiễm sắc thể

Kích thích mạnh
sự di cư của tế bào

Hình 4. Các vùng chức năng đa dạng của protein APC và các đột biến cắt ngắn gây nên sự
mất chức năng của nó, dẫn đến sự tạo thành các polyp và ung thư đại trực tràng.
(A) Các protein APC1 và APC2 ở ruồi dấm, chuột và người. Hai gen APC của ruồi giấm
không giống hai gen của động vật có vú.
(B) Sơ đồ các miền ở toàn bộ chiều dài của protein APC và chức năng của chúng. APC kích
thích sự di cư của tế bào qua tương tác với ASEF, IQGAP1 hoặc với mDia. APC có liên quan
đến sự kết dính tế bào thông qua kiểm soát sự phân bố của β-catenin giữa nhân tế bào / bào
tương (cytoplasm) và màng bào tương của tế bào. APC ức chế sự sao chép (transcription) của
β-catenin/ TCF thông qua những tương tác với β-catenin hoặc với CtBP. APC điều hòa sự
phân chia nhiễm sắc thể thông qua sự gắn kinetochore và qua sự áp chế tín hiệu Wnt kinh
điển. Mũi tên màu đỏ và màu xanh cho biết sự “kích hoạt” và “ức chế”, tương ứng.
(C) Sơ đồ của một trong những protein APC bị cắt ngắn ở đầu tận C và vai trò của nó trong
bệnh sinh khối u (tumorigenesis). Protein APC bị cắt ngắn kích thích di cư của tế bào mạnh
mẽ hơn so với protein APC có chiều dài đầy đủ, trái lại, sự mất các vùng ở đầu tận của C của
protein APC kích hoạt con đường tín hiệu Wnt và cảm ứng sự bất ổn định nhiễm sắc thể.

13


Từ những kết quả nghiên cứu thu được [16, 26, 40, 48, 60, 76], người ta
cho rằng protein APC kích thích sự di cư của tế bào bằng cách gắn vào Acef1
và Acef2 các vùng lặp lại Armadillo để hoạt hóa chúng và hoạt hóa Cdc42; gắn
vào IQGAP1 tại các vùng lặp lại Armadillo để thu thập IQGAP1 và CLIP170,
tạo nên một phức hợp với IQGAP1, CLIP170, Rac1 và Cdc42 đã được hoạt
hóa, tạo nên mạng lưới actin; gắn với EB1 tại vùng gắn EB1 tạo điều kiện dễ
dàng cho hoạt đông của Rho và mDia, làm ổn định và polymer hóa các vi ống,
giúp cho việc phân chia nhiễm sắc thể chính xác.
- Protein APC làm ổn định mạng lưới các vi ống
APC được tìm thấy ở cuối của các vi ống (microtubules), nó có thể bám
vào và ổn định các vi ống. Các kết quả này chỉ ra rằng APC điều hòa mạng lưới
vi ống và có thể đóng vai trò trong các quá trình trung gian của các vi ống như
sự di cư tế bào và sự hình thành trục chính của con thoi (spindle) (Nathke, 2006
[59]).
Các kết quả nghiên cứu thu được gần đây [35, 45, 57, 58, 59, 69] cho thấy APC
và EB1 làm giảm chức năng của Rho và protein gia đình formin mDia protein
trong sự ổn định các vi ống. Vì APC có thể tạo thành một phức hợp với EB1 và
mDia ở đoạn cuối các vi ống ổn định nên sự tham gia của APC vào sự di cư
của tế bào có thể bao gồm sự kết hợp với mDia. Do đó, APC kích thích sự di cư
tế bào qua một vài con đường khác nhau.
- Protein APC giúp sự phân chia nhiễm sắc thể chính xác
Sự mất ổn định nhiễm sắc thể (chromosome instability: CIN) được xem là
một trong những động lực kích thích sự tạo thành khối u (tumorigenesis). Một
số nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự mất APC cảm ứng sự phân chia sai lệch (missegregation) của nhiễm sắc thể (Aoki và cộng sự, 2007 [18]).
Từ những kết quả nghiên cứu thu được [18, 33, 71], người ta cho rằng
protein APC giúp sự phân chia nhiễm sắc thể chính xác bằng cách gắn vào các
vi ống tại vùng cơ bản (basic domain) để điều hòa các chức năng của

phát hiện sớm nguy cơ mắc bệnh để có hướng điều trị, tiên lượng mức độ bệnh.

15


1.3.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật PCR được một nhà Hóa sinh học người Mỹ là Kary Mullis (sinh
năm 1944) phát minh vào năm 1985 (giải Nobel Hóa học 1993). Sự ra đời của
kỹ thuật PCR đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong Công nghệ Sinh học
phân tử, giúp các nhà Sinh học phân tử dễ dàng và nhanh chóng khuếch đại các
chuỗi DNA lên hàng tỷ lần trong một thời gian rất ngắn trong điều kiện in vitro.
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR:
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, bắt cặp
của DNA và tổng hợp ADN nhờ enzym DNA polymerase. Với nguyên liệu là
bốn loại nucleotid (A, G, T, C), DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp một mạch
DNA mới từ mạch DNA khuôn. Kỹ thuật đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi
và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn.
Kỹ thuật PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm
ba bước:
- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Trong một dung dịch phản
ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến
tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94oC 95oC trong vòng 30-60 giây.
- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho phép
các mồi cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC-70oC tuỳ thuộc Tm của
các mồi sử dụng và kéo dài 30-60 giây.
- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được
tăng lên 72oC để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq
polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất.
Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại, thường kéo
dài từ 30 giây đến nhiều phút.

DNA, hoặc trên các phân tử DNA khác nhau. Điều cần thiết là phải thiết kế các
cặp mồi có cùng nhiệt độ bắt cặp lên DNA đích, đồng thời các mồi này không

17


bắt cặp với nhau và quan trọng nhất là độ nhạy phát hiện bệnh không giảm mà
vẫn tương đương như độ nhạy của PCR đơn mồi [11, 13].
1.3.4. Kỹ thuật PCR sao chép ngược (Reverse transcriptase-PCR, RT-PCR)
Kỹ thuật RT-PCR được sử dụng để tổng hợp mạch kép DNA bổ xung
mới (cDNA) từ mạch đơn mRNA. Do Taq polymerase không hoạt động trên
RNA nên người ta sử dụng kỹ thuật phối hợp RT-PCR.
Trước hết, mRNA được chuyển thành cDNA nhờ enzym phiên mã ngược
(reverse transcriptase). Mồi được sử dụng có thể là oligonucleotide T (oligo-dT)
để bắt cặp với đuôi polyA của các mRNA, cũng có thể là các hexanucleotide
(gồm 6 nucleotide có trình tự ngẫu nhiên) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự
ngắn trên phân tử RNA. Phần còn lại của sợi cDNA sau đó được tổng hợp với
sự có mặt của 4 loại desoxyribonucleosid triphosphat.
Sợi RNA trên phân tử lai RNA-DNA sau đó bị thuỷ phân trong môi
trường kiềm, còn sợi DNA không bị thủy phân trong môi trường kiềm.
Đầu 3’ của DNA mới được tổng hợp tạo ra một hình trâm cài tóc và làm
mồi cho sự tổng hợp sợi DNA đối xứng nhờ enzym Taq polymerase. Trâm cài
tóc lại bị loại bởi nuclease S1 nhận diện những nucleotid không có liên quan để
tạo ra sợi DNA kép hoàn chỉnh.
RT-PCR là kỹ thuật có độ nhạy cao, chỉ cần một lượng RNA thấp vẫn có
thể được phát hiện nhờ phản ứng khuếch đại. Đây là phương pháp thường được
sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh lý di truyền nói chung và bệnh lý KĐT
thể FAP nói riêng. Ngoài ra, RT-PCR còn giúp chẩn đoán các giai đoạn của
bệnh. Với phân tích bán định lượng, có thể xác định được mức độ biểu hiện của
RNA ở tế bào và mô cũng như đánh giá được hoạt động của gen tương ứng.

phân tích. Dựa vào màu huỳnh quang mà máy nhận diện được là nucleotid nào,
từ đó biết được trình tự của DNA đích [11, 12, 13].
Kỹ thuật giải trình tự của DNA đích đã được ứng dụng trong nhiều
nghiên cứu để xác định các đột biến mất nucleotid, thay thế nucleotid, thêm
nucleotid trên gen APC ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể FAP...
19


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Nhóm chứng: mười lăm người khỏe mạnh, bản thân và gia đình không bị
hội chứng FAP hoặc ung thư đại trực tràng.
- Nhóm nghiên cứu:
Mười lăm gia đình bệnh nhân bị hội chứng đa polyp tuyến gia đình (FAP)
khám bệnh hoặc điều trị tại Bệnh viện K từ 2006-2010, tổng cộng 47 người,
bao gồm:
+ Hai mươi hai bệnh nhân bị bệnh ung thư đại trực tràng thể đa polyp
tuyến gia đình tuổi từ 18-63, tuổi trung bình là 37, gồm 16 nam và 6 nữ.
+ Hai mươi lăm thành viên có quan hệ huyết thống bậc 1 với bệnh nhân
bị ung thư đại trực tràng thể FAP trong 15 gia đình bệnh nhân, trong đó 3 người
đã biểu hiện bệnh đa polyp tuyến gia đình (FAP) và 22 thân nhân chưa biểu
hiện FAP.
Gia đình bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể FAP và bệnh nhân đa polyp
tuyến gia đình được chọn trong nghiên cứu này phải có các điều kiện sau:
- Trong gia đình có ít nhất hai người bị bệnh FAP trở lên.
- Bệnh nhân có > 100 polyp trong đại trực tràng.
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu
2.2.1. Dụng cụ
-

- Proteinase K (10mg/mL)
- Dung dịch phenol: chloroform : isoamyl với tỷ lệ 25 : 24 : 1
- Dung dịch chloroform : isoamyl với tỷ lệ 24 : 1
- Ethanol 100% và ethanol 70%
- Sodium acetate 3M, pH=5,2
- Dung dịch hòa tan DNA để bảo quản DNA sau khi tách:
Dung dịch Lysis buffer
Hoá chất

Nồng độ

Thể tích (mL)

Sucrose

0,3 M

51,3

Tribase HCL (pH=7,5)

0,01M

0,785

MgCl2

0,005 M

0,2375

Chỉnh pH=8,0 bằng NaOH, hoàn thành bằng nước cất hai lần vừa đủ 200
mL.
* Hoá chất để thực hiện Kỹ thuật PCR (Invitrogen):
+ 10x buffer
+ dNTP 10mM
+ Taq polymerase
+ Các cặp mồi (xuôi và ngược)
* Hoá chất để điện di sản phẩm PCR trên gel agarose:
+ Agarose
+ Dung dịch TBE 10x (Tris; acid boric; EDTA):
+ Loading buffer 10x
+ Ethidium bromide.
* Hoá chất để tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose (QIAGEN):
+ Dung dịch QC.
+ Dụng dịch Sodium acetate.
+ Dung dịch Isopropanol.
+ Dung dịch QG.
22