Bộ y tế
******
Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

ứng dụng kỹ thuật nat để phát hiện
sớm hiv, HBV, hcv ở ngời cho máu

Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Nguyễn Anh Trí
PGS. TS. Bạch Khánh Hòa
Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Huyết học Truyền máu TW
6909
26/6/2008

Hà Nội 2008

Bộ y tế
******


3. Th ký đề tài: Nguyễn Quốc Cờng
Trần Vân Chi
4. Danh sách những ngời thực hiện chính:
TT Họ và tên cán bộ thực
hiện đề tài
Học vị, học
hàm, chức vụ
Cơ quan công tác
1 Nguyễn Chí Tuyển Bác sỹ Viện Huyết học-Truyền
máu TW
2 Nguyễn Quốc Cờng Cử nhân Viện Huyết học-Truyền
máu TW
3 Chử Thị Thu Hờng Bác sỹ Nội trú Đại học Y Hà Nội
4 Nguyễn Minh Phơng Cử nhân Viện Huyết học-Truyền
máu TW
5 Nguyễn Kim Dũng Kỹ thuật viên Viện Huyết học-Truyền
máu TW

5. Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 10/2005 đến tháng 12/2007.
Lời cảm ơn.
Chúng tôi chân thành cảm ơn Vụ Khoa học và Đào tạo - Bộ Y tế, Ban
lãnh đạo Viện Huyết học Truyền máu TW, Khoa Thu gom máu - Viện
Huyết học - Truyền máu TW, Hãng CHIRON giúp đỡ và tạo điều kiện để
chúng tôi hoàn thành tốt đề tài này.

Bản tự đánh giá
Về tình hình thực hiện và những đóng góp mới của đề tài KH&CN cấp Bộ

1. Tình hình thực hiện đề tài so với đề cơng:
1.1/ Về mức độ hoàn thành, khối lợng công việc: đã hoàn thành vợt

Anti HBe : Anti Hepatitis B e
(Kháng thể kháng kháng nguyên e virus viêm gan B)
Au : Australia
BN : Bệnh nhân
C : Cytosin
DNA : Acid Desoxyribonucleic
ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay
(Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym)
EIA : Enzyme Immunoassay
(Kỹ thuật miễn dịch enzym)
FDA : Food and Drug Administration
(Cục quản lý thực và dợc phẩm Hoa Kỳ)
G : Guanin
HBcAg : Hepatitis B core Antigen
(Kháng nguyên lõi virus viêm gan B)
HBsAg : Hepatitis B surface Antigen
(Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B)
HBeAg : Hepatitis B e Antigen (Kháng nguyên e virus viêm gan B)
HBV : Hepatitis B virus (Virus viêm gan B)
HCV : Hepatitis C virus (Virus viêm gan C)
HH-TM TW: Huyết Học Truyền máu Trung Ương
IC : Internal Control (Nội kiểm tra)
KN : Kháng nguyên
KT : Kháng thể
NAT : Nucleic acid testing (Xét nghiệm phát hiện acid nucleic)
NCM : Ngời cho máu
NCMCN : Ngời cho máu chuyên nghiệp
NCMTN : Ngời cho máu tình nguyện
NNCM : Ngời nhà cho máu
PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi)

1.2.1. Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngời (HIV)
6
1.2.2. Virus viêm gan C
9
1.2.3. Virus viêm gan B
10
1.3. Các biện pháp bảo đảm an toàn truyền máu, phòng lây
nhiễm HIV, HBV, HCV qua đờng truyền máu
14
1.3.1. Lựa chọn NCM an toàn
14
1.3.2. Các kỹ thuật sàng lọc huyết thanh HIV, HBV, HCV cho NCM
15
1.4. Kỹ thuật sàng lọc NAT
18
1.4.1. Cơ sở sinh học phân tử
18
1.4.2. Nguyên lý kỹ thuật
20
1.4.3. Các giai đoạn kỹ thuật
21
1.5. Tình hình áp dụng quy trình kỹ thuật sàng lọc NAT để phát
hiện sớm NCM nhiễm HIV, HBV, HCV trên thế giới và tại Việt
Nam
23
1.5.1. Trên thế giới
23
1.5.2. Tại Việt Nam
24
Chơng 2: đối tợng và phơng pháp

43
3.1.6. Tỉ lệ nhiễm các virus đợc sàng lọc bằng kỹ thuật NAT trong
nghiên cứu
43
3.1.7. Kết quả RT-PCR của mẫu bị nhiễm virus HCV
43
3.2. Xây dựng labo sinh học phân tử (SHPT) thực hiện đợc các
kỹ thuật SHPT trong đó có NAT phục vụ cho nội dung sàng lọc
máu và đào tạo
44
Chơng IV: Bàn luận
45
4.1 . Kết quả nghiên cứu hiệu quả sử dụng kỹ thuật NAT trong
việc nâng cao tính an toàn sinh học của các chế phẩm máu
45
4.1.1. Kỹ thuật NAT
45
4.1.2. Sử dụng trộn 8
46
4.1.3. Tỉ lệ dơng tính khi phát hiện đồng thời cả 3 loại virus HIV,
HBV, HCV (Procleix Ultrio Assay)
47
4.1.4. Tỉ lệ không có giá trị trong quá trình xét nghiệm
49
4.1.5. Kết quả xác định loại virus bằng Probe đặc hiệu
51
4.1.6. Kết quả xác định ngời cho máu bị nhiễm virus viêm gan C
trong mẫu trộn dơng tính
52
4.1.7. Tỉ lệ nhiễm các virus đợc sàng lọc bằng kỹ thuật NAT trong

máu của Quốc gia, trong đó sàng lọc các tác nhân lây nhiễm qua đờng truyền
máu đợc xem là một trong những nội dung then chốt [18].
Các tác nhân gây bệnh có thể đợc truyền từ máu và chế phẩm máu của
ngời cho máu (NCM) đã nhiễm bệnh sang ngời thân. Căn nguyên gây các
bệnh nhiễm trùng qua đờng máu có rất nhiều [54], [55], tuy nhiên theo
khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới thì 3 virus bắt buộc phải đợc sàng lọc
NCM là HIV, HBV, HCV [58], [102].
Trong sàng lọc NCM hiện nay, ngời ta dùng phơng pháp ELISA để
phát hiện các kháng thể (KT) và các kháng nguyên (KN) của virus. Phơng
pháp này có độ tin cậy khá cao, tuy nhiên nhợc điểm của phơng pháp là phụ
thuộc rất nhiều vào đáp ứng miễn dịch của mỗi cá thể, giai đoạn cửa sổ còn
khá dài, nguồn NCM cha thực sự an toàn. Do vậy, ngời ta vẫn gặp những
trờng hợp bệnh nhân (BN) bị lây nhiễm virus do truyền máu nhiễm virus
trong giai đoạn cửa sổ.
Từ năm 1999, kỹ thuật NAT đã phát triển cho phép xác định trực tiếp
HIV-RNA, HBV-DNA, HCV-RNA. Nhờ sử dụng phơng pháp này, ngời ta
có thể loại trừ những mẫu máu có virus mà kỹ thuật huyết thanh học không
phát hiện đợc, do đó làm giảm nguy cơ BN bị lây nhiễm virus do truyền máu
trong giai đoạn cửa sổ. Cụ thể rút ngắn giai đoạn cửa sổ từ 80-90 ngày còn 23

2
ngày cho HCV; 22-30 ngày còn 11 ngày cho HIV; 50-60 ngày xuống còn 34
ngày cho HBV [51].
Hiện nay, một số nớc tiên tiến đã áp dụng thờng quy kỹ thuật NAT
để sàng lọc HIV, HBV, HCV cho NCM nh Mỹ, Nhật, Hà Lan, Thụy Điển,
Đức
Tại Việt Nam, sàng lọc HIV, HBV, HCV cho NCM đã đợc thực hiện
trên phạm vi toàn quốc từ cuối năm 1994. Tuy nhiên do điều kiện kinh phí còn
hạn hẹp nên các biện pháp kỹ thuật sàng lọc NCM còn nhiều hạn chế, vì vậy
giai đoạn cửa sổ huyết thanh còn khá dài nên việc lây nhiễm các bệnh qua

Hemophilia đợc truyền máu nhiều lần [42].
Năm 1967 ông đã thành công trong việc dùng KT miễn dịch khuếch tán
trên gel thạch phát hiện KN viêm gan B, ký hiệu Au [18].
Năm 1970, nhà bác học Dane và cộng sự đã phân lập đợc virus viêm
gan B hoàn chỉnh gọi là Dane [17], [18], [37]. Những năm tiếp theo các dấu
ấn miễn dịch khác của virus viêm gan B nh kháng thể HBs, HBeAg, kháng
thể HBc, kháng thể HBe, HBcAg lần lợt đợc phát hiện [18], [69].
Sàng lọc HBsAg cho NCM đợc bắt đầu từ năm 1971, kỹ thuật ban đầu
đợc sử dụng là kỹ thuật khuếch tán trên gel thạch và kỹ thuật điện di. Năm
1975 sử dụng kỹ thuật phóng xạ miễn dịch (RIA) và kỹ thuật miễn dịch
enzym (EIA) để phát hiện HBsAg [71]. Năm 1980 bắt đầu sử dụng ELISA để
sàng lọc HBsAg ở NCM.
Virus viêm gan C đợc Houghton xác định và phân lập năm 1988, đồng
thời ông cũng là ngời nghiên cứu thành công trong việc sản xuất kít ELISA
thế hệ thứ nhất để chẩn đoán tình trạng nhiễm HCV [18].
Năm 1989, tác nhân gây viêm gan non A- non B đã đợc sáng tỏ [18].
Các nhà khoa học đã phân lập đợc virus viêm gan C và họ đã lai tạo thành
công dòng vô tính của virus từ E.coli chủng C-300-3 và từ kết quả này họ đã

4
sử dụng KN C-300-3 để phát hiện KT chống HCV trong huyết thanh của BN
viêm gan [65].
Năm 1990 tại Mỹ đã sử dụng kỹ thuật EIA thế hệ 1 (HCV 1.0 EIA) để
phát hiện KT đặc hiệu với KN Protein c100-3 của HCV [73].
Năm 1992 kỹ thuật EIA thế hệ 2 phát triển (HCV 2.0 EIA) có độ nhạy
hơn thế hệ 1 trong việc phát hiện nhiễm trùng HCV cấp và mạn. KN đợc sử
dụng trong kỹ thuật này bao gồm 2 thành phần protein: 1 cấu trúc (c22-3) và 1
không cấu trúc (c33c). Những KT chống lại protein này xuất hiện sớm hơn
c100-3 do đó giai đoạn cửa sổ huyết thanh học đợc rút ngắn so với thế hệ 1 là
10-20 ngày [73].

kỹ thuật khuếch tán trên gel thạch.
Năm 1984 chúng ta bắt đầu sử dụng kỹ thuật ELISA để sàng lọc NCM
ở một số trung tâm truyền máu lớn.
Phơng pháp và kỹ thuật phát hiện KN Au có rất nhiều [18], KN đợc
phát hiện có thể chính là virus hoặc là những thành phần liên quan chặt chẽ
với virus viêm gan, đơn giản nhất là kỹ thuật miễn dịch khuếch tán trên gel
thạch. Huyết thanh cần xác định và kháng thể Australia đợc đặt đối diện
trong 2 ô. Nếu huyết thanh BN có chứa KN thì sẽ hình thành 1 cung tủa nơi
gặp nhau của 2 huyết thanh.
Ngoài ra còn có kỹ thuật kết hợp bổ thể, ngng kết bị động ngợc, miễn
dịch phóng xạ, thờng dùng là điện di miễn dịch khuếch tán.
Kỹ thuật chủ yếu dùng ở Việt Nam thời đó là kỹ thuật khuếch tán miễn
dịch Ouchterlony và miễn dịch khuếch tán điện di của Repars cải tiến. Kỹ
thuật sử dụng sàng lọc NCM là kỹ thuật điện di khuếch tán vì có u điểm là
thời gian nhanh và sàng lọc đợc nhiều, tuy nhiên độ nhạy cha cao vì thế bỏ
sót những KN yếu.
Giáo s Bạch Quốc Tuyên và cộng sự [31] đã chỉnh lý kỹ thuật kết hợp
bổ thể, kỹ thuật ngng kết bị động ngợc để tăng độ nhạy của sàng lọc nhng

6
các kỹ thuật đó chỉ dùng vào một số trờng hợp nghiên cứu vì tốn kém kháng
thể nhiều và không thuận lợi khi xét nghiệm hàng loạt.
Tại Việt Nam, việc sàng lọc cả ba loại virus này mới đợc thực hiện từ
đầu những năm 90 của thế kỷ trớc và cho đến nay vẫn tỏ ra hữu hiệu trong
việc ngăn chặn sự lan truyền bệnh dịch. Từ năm 1996 trở về đây đã có thống
kê bớc đầu về tình hình lây nhiễm các virus qua đờng truyền máu [18].
Hiện nay phần lớn các trung tâm truyền máu nớc ta đã sử dụng kỹ
thuật ELISA với thế hệ kít thứ 3 (phát hiện đợc cả hai loại kháng thể HIV
loại IgG và IgM ) và thế hệ thứ 4 (phát hiện cả KN HIV p24, hai loại kháng
thể HIV IgG, IgM). Do vậy có thể phát hiện đợc NCM bị nhiễm HIV trong

+ Env: Mã hoá cho việc tổng hợp protein màng là gp 120, gp 41,
+ Pol: Mã hoá cho việc tổng hợp 3 enzym: RT, proteaza, integraza.
00
Hình 1-1: Cấu trúc HIV [18]
Hiện nay, ngời ta đã phát hiện đợc cả hai loại HIV-1 và HIV-2. HIV-
1 gặp ở trên khắp thế giới, đợc phát hiện năm 1983. HIV-2 gặp chủ yếu ở
Tây và Đông Phi, Tây ấn Độ, đợc phát hiện năm 1986. Cả HIV-1 và HIV-2
đều là căn nguyên gây bệnh AIDS, tuy nhiên HIV-2 thờng khó đợc lan
p
roteaza
p
reteaza
reverse transci
p
taza
inte
g
raza

8
truyền hơn và khoảng thời gian từ lúc nhiễm đến lúc phát bệnh là lâu hơn
đáng kể so với HIV-1 [25], [27], [35].
1.2.1.2. Chuyển đổi huyết thanh của ngời nhiễm HIV/AIDS
- Giai đoạn I: Nhiễm trùng khởi phát có thể chia thành 2 giai đoạn nhỏ.
Giai đoạn đầu, ngời nhiễm HIV chỉ có những biểu hiện lâm sàng giống nh
các virus khác: sốt, đau mình mẩy, phát ban, sng hạch và trong huyết thanh
cha tìm thấy KN và KT, giai đoạn này kéo dài từ 1-2 tuần kể từ khi nhiễm
trùng. Giai đoạn tiếp theo trong huyết thanh xuất hiện kháng nguyên HIV
thờng phát hiện thấy KN p24. Tiếp theo có thể phát hiện thấy kháng thể
chống HIV type IgM. Thời gian này kéo dài 3-6 tuần.

gen C mã hoá protein của nucleocapsid p22, gắn với RNA virus, gen NS3 mã
hoá enzym protease, gen NS5A mã hoá enzym polymerase, gen NS5B mã hoá
enzym replicase. Hai enzym này cần thiết cho sự sao chép của HCV.

Hình 1-3: Cấu trúc HCV [18]
Protein
xuyên màng
RNA virus
Protein nucleocapside
Vỏ
Cấu trúc của
genome
Lớ
p
vỏ
Genome
RNA

10
1.2.2.2. Chuyển đổi huyết thanh của ngời nhiễm viêm gan C

Ag
Core
0
80
150
S ngy sau tiờm
HCV Ab
Ca s 70 ngy
?

-S.
Protein này có tính miễn dịch cao, cảm thụ đặc biệt với albumin, có thể đó là
thụ thể để virus tiếp cận và xâm nhập vào tế bào gan.
+ Protein lớn: bao gồm 380-400 acid amin, đợc mã hoá bởi các tiền
gen S
1
+S
2
, 1S. Protein này mang tính quyết định KN bề mặt viêm gan B và
đóng vai trò quan trọng trong việc liên kết, xâm nhập của virus vào tế bào gan.

Hình 1-6: Hình thái và cấu trúc màng của HBV [18]
HBeA
g
DNA
Polymerase
DNA
HBcA
g

HBsA
g

12
- Lớp Capsit: dày khoảng 28nm đợc mã hoá bởi các gen C (core=lõi)
gồm 183 axit amin, mang đặc trng của kháng nguyên HBc (HBcAg). Ngoài
ra còn có KN lõi đợc mã hoá bởi gen C+C, đó là HBe (HBeAg). KN này liên
quan đến khả năng nhân lên của virus.
- Lớp trong cùng:
+ Genome của virus: Là sợi kép HBV-DNA.

xâm nhập vào cơ thể, lúc đó HBsAg thờng hết trong huyết thanh. Anti HBs
có vai trò bảo vệ cơ thể chống tái nhiễm HBV do đó có giá trị đánh giá khả
năng bảo vệ của cơ thể, đồng thời Anti HBs cũng có giá trị đánh giá hiệu quả
của vaccin [72].
- HBeAg (Hepatitis B e Antigen): Là một KN nhân của virus HBV, xuất
hiện sau HBsAg, nồng độ của HBeAg tồn tại cùng với nồng độ HBsAg trong
huyết thanh, giảm sau khoảng thời gian 10 tuần nhiễm bệnh và thờng mất
sớm hơn HBsAg. Khi HBeAg tồn tại trong máu có nghĩa là virus đang đợc
nhân lên rất mạnh, lây nhiễm ở thời kỳ này là khá cao.

Hình 1-7: Diễn biến huyết thanh của ngời nhiễm HBV [18].

14
- Anti HBe (Anti Hepatitis e): là kháng thể chống lại HBeAg, kháng thể
này thờng xuất hiện ngay sau khi HBeAg mất đi. Khi có mặt Anti HBe là dấu
hiệu tốt của đáp ứng miễn dịch, khả năng lây truyền ở thời kỳ này rất thấp,
virus đang trong thời kỳ nghỉ ngơi không sinh sản.
- HBcAg (Hepatitis B core Antigen): là KN lõi xuất hiện trong nhân tế
bào gan, không xuất hiện trong huyết thanh hoặc có xuất hiện trong huyết
thanh của những ngời có virus đang phát triển và nhân lên nhng cha có thử
nghiệm thơng mại hoá để phát hiện. HBcAg rất có giá trị chẩn đoán nhiễm
HBV vì HBcAg dơng tính thì luôn luôn có HBsAg dơng tính.
- Anti HBc (Anti Hepatitis B core): là kháng thể chống lại HBcAg, là
dấu ấn miễn dịch xuất hiện thứ ba sau khi nhiễm HBV. Kháng thể HBc gồm
hai loại: kháng thể HBc loại IgM thờng tồn tại trong giai đoạn nhiễm cấp và
mất dần trong giai đoạn hồi phục, kháng thể HBc IgG tồn tại nhiều năm trong
huyết thanh của bệnh nhân đã bị nhiễm HBV. Anti HBc có tác dụng nh một
chỉ điểm chứng tỏ sự có mặt của HBcAg.
Hiện nay, bằng kỹ thuật PCR phát hiện HBV-DNA đã rút ngắn đợc
thời kỳ cửa sổ của HBV chỉ còn 20-30 ngày [48].

1.3.2. Các kỹ thuật sàng lọc huyết thanh HIV, HBV, HCV cho NCM
Sàng lọc huyết thanh cho NCM là một biện pháp rất quan trọng để đảm
bảo an toàn truyền máu, trong những năm qua nhờ thực hiện tốt biện pháp này
mà tỷ lệ nhiễm HIV, HCV, HBV ở NCM đã đợc giảm đi một cách rõ rệt [7],
[18], [40].
* Nguyên tắc: (Theo quy định của Tổ chức Y Tế thế giới) [34], [35],
[101].
- Phải đảm bảo 100% đơn vị máu trớc khi truyền đợc sàng lọc cả
HIV, HBV, HCV. Các túi máu có kết quả kháng thể HIV, kháng thể HCV,
HBsAg dơng tính đều phải loại bỏ.

16
- Lựa chọn các kỹ thuật có độ nhạy, độ đặc hiệu cao và đặc thù cho
từng vùng để sàng lọc HIV, HBV, HCV cho NCM một cách hiệu quả nhất.
* Sàng lọc kháng thể HIV, kháng thể HCV, HBsAg cho NCM:
Để phát hiện sự có mặt của virus, ngời ta sử dụng phơng pháp tìm
KN virus hoặc KT chống virus trong huyết thanh. Có 3 loại kỹ thuật chính
hiện đang đợc sử dụng là [9]:
- Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (EIA/ELISA)
- Kỹ thuật ngng kết (PA)
- Kỹ thuật nhanh (Quick test)
1.3.2.1. EIA/ELISA
* Sàng lọc HBsAg cho NCM là xét nghiệm thờng quy đợc thực hiện ở
tất cả các ngân hàng máu trên toàn thế giới để đảm bảo an toàn truyền máu.
Các nớc đã phát triển hiện nay sử dụng kỹ thuật ELISA thế hệ kít thứ ba (sử
dụng ba loại KT đơn dòng khác nhau để phát hiện các dới nhóm khác nhau
của HBV) sàng lọc HBsAg cho NCM [33], [100]. HBsAg là một dấu ấn quan
trọng nhất để chẩn đoán viêm gan B. Sàng lọc HBsAg dựa theo nguyên lý EIA
kẹp giữa và sử dụng KT (thờng là KT đơn dòng) để phát hiện các dới nhóm
của HBsAg đợc gắn trên bề mặt giếng. Độ đặc hiệu là trên 99%. Có thể có