Bộ khoa học công nghệ

Bộ y tế

Báo cáo tổng kết
Đề tài nghiên cứu khoa học độc lập
cấp nhà nớc
nghiên cứu quy trình sản xuất và chuẩn hoá
các sản phẩm huyết tơng đạt tiêu chuẩn quốc tế
sử dụng cho điều trị Chủ nhiệm đề tài :
GS.TSKH. đỗ trung phấn
Cơ quan chủ trì : Viện Huyết học - truyền máu tw
viện trởng: pgs.ts. nguyễn anh trí
Cơ quan chủ quản : Bộ y tế

ngời cho máu tình nguyện tại Viện HHTM Trung ơng đã hết sức nhiệt tình,
với trách nhiệm cao đã cùng chúng tôi hoàn thành đề tài có kết quả.
Đề tài đã đem lại cho Viện HHTM một số trang bị, quy trình công nghệ sản
xuất các sản phẩm huyết tơng, kiến thức và tay nghề của 1 số cán bộ - KTV
trực tiếp tham gia thực hiện đề tài. Chúng tôi coi đây là cơ sở vật chất quý giá để
phát triển đề tài trong tơng lai.
Hà Nội, ngày 28/12/2007
Thay mặt tập thể
nhóm nghiên cứu GS.TSKH.NGND
Đỗ Trung Phấn

Các thành viên tham gia nghiên cứu thuộc đề tài
nghiên cứu sản xuất các sản phẩm huyết tơng
(Giai đoạn 2004 - 2007)

Chủ nhiệm đề tài: GS.TSKH. Đỗ Trung Phấn
Th ký đề tài: ThS. Phạm Tuấn Dơng

1. Các thành phần tham gia nghiên cứu: gồm các nhóm sau đây:
1. Nhóm: Vận động và thu gom máu chất lợng cao
- Ths. Nguyễn Đắc Thuận Viện HHTM TW
- ThS. Trần Ngọc Quế -
- BS. Nguyễn Mạnh Quân -
2. Nhóm: Sàng lọc các bệnh nhiễm trùng
- PGS. TS. Bạch Khánh Hoà Viện HHTM TW
- TS. Bùi Mai An -
- KTV: Trần Thị Ngọc Anh -

Chữ viết tắt

ACD
Acid Citrate dextrose
CD
Cluster of differentiation
CFU
Colony forming unite
CM
Carboxyl methyl
CPD
Citrate - Phosphate dextrose
CPD-A1
Citrate - Phosphate dextrose - Adenine
DIC
Disseminated Intravaseular Coaglulation
DEAE
Dimethylaminoethyl
ELISA
Enzym leankaged sorbant Assay
FDP
Fresh Dried plasma
FFP
Fresh frozen plasma
G-CSF
Granulocyte - colony Stimulating factor
GEMM
Granulocyte - Erythrocyte - Monocyte - Megakaryocyte
HBV
Hepatitis B virus
Mục lục

Trang
1. Đặt vấn đề - mục tiêu - nội dung nghiên cứu 1
2. Tổng quan 3
2.1. Lịch sử phát triển truyền máu và sản xuất các sản phẩm máu 3
2.2. Máu và các thành phần của máu 3
2.3. Các thành phần huyết tơng 7
2.4. Các phơng pháp chiết tách các thành phần huyết tơng 15
2.5. Bảo quản huyết tơng và các sản phẩm huyết tơng 23
2.6. Giám sát và quản lý chất lợng các sản phẩm huyết tơng 24
2.7. Một số sản phẩm huyết tơng có giá trị cao trong điều trị 25
2.8. Tình hình sử dụng các sản phẩm huyết tơng trên thế giới 28
2.9. Khả năng sản xuất và sử dụng các sản phẩm huyết tơng tại Việt Nam 30
2.10. Một số vấn đề mới về protein huyết tơng: proteome - proteomics 31
2.11. Hớng phát triển trong tơng lai 33
3. Đối tợng và phơng pháp 35
3.1. Đối tợng 35
3.1.1. Ngời cho máu 35
3.1.2. Động vật thực nghiệm 35
3.2. Chất liệu nghiên cứu và trang thiết bị, hoá chất cần thiết 35
3.2.1. Chất liệu nghiên cứu: Huyết tơng 35
3.2.2. Trang bị, hoá chất 35
3.3. Phơng pháp 36
3.3.1. Tuyển chọn huyết tơng chất lợng cao và an toàn 36
3.3.2 Sản xuất các sản phẩm huyết tơng: sản phẩm và quy trình sản xuất 39
3.3.2.1. Huyết tơng tơi đông khô 39
3.3.2.2. Sản xuất yếu tố VIII cô đặc 40

6. Kết luận 117
1. Các sản phẩm huyết tơng đã thu đợc 117
2. Hiệu quả của phơng pháp đông khô các sản phẩm huyết tơng 117
3. Các quy trình công nghệ đã hoàn thiện 118
4. Các bài báo khoa học đã công bố 118
5. Kết quả đào tạo 118
7. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 119
8. Kiến nghị 120
9. Tài liệu tham khảo 121
1
1. Đặt vấn đề
mục tiêu - nội dung nghiên cứu
Viện HHTM đã hoàn thành 2 đề tài độc lập cấp nhà nớc:
1. Nghiên cứu lây truyền mẹ con của virus viêm gan B và các virus truyền
qua đờng truyền máu, KY01/15 nghiệm thu 06/ 1996.
2. Nghiên cứu sản xuất và chuẩn hoá các sản phẩm máu sử dụng cho điều
trị bệnh, KHCN 11/ DA5 nghiệm thu 03/ 2004. (10)
Hai đề tài trên đã thiết thực góp phần nâng cao chất lợng máu và an toàn
TM, trực tiếp phát triển truyền máu từng phần vừa có hiệu quả kinh tế cao, tiết
kiệm vừa nâng cao hiệu quả điều trị, làm thay đổi tập quán TM toàn phần trong
nhiều thập kỷ từ 1954 của các BS lâm sàng.
Trong các sản phẩm máu, chúng ta mới sản xuất, chuẩn hoá và sử dụng các
sản phẩm tế bào máu bao gồm HC, tiểu cầu, bạch cầu hạt, tế bào gốc (CD
34
), còn
các sản phẩm huyết tơng - nguồn nguyên liệu lớn, và rất quí bởi có nhiều thành
phần có thể tách ra riêng biệt sử dụng cho điều trị, tới nay ta vẫn cha làm đợc,

B. Nội dung:
1. Nâng cao chất lợng thu gom huyết tơng: Ngời cho máu an toàn, sàng
lọc bệnh nhiễm trùng.
2. Nghiên cứu điều chế huyết tơng đông khô: Thể tích 200ml/ chai, nồng
độ protein > 5g/ l, pH 6-7, nớc tồn d < 2%, thời gian bảo quản > 1 năm.
3. Nghiên cứu qui trình điều chế khối cô đặc yếu tố VIII; độ sạch đạt > 85%,
thể tích 10 - 20ml/lọ, nồng độ F-VIII từ 6 - 15 đơn vị, lợng yếu tố VIII trong 1 đv/
lọ: >70 UI; sau đông khô chất lợng ổn định. Thời gian bảo quản > 1 năm.
4. Nghiên cứu qui trình chiết tách và chuẩn hoá -globulin (phơng pháp
Cohn bằng ethanol): Độ tinh khiết đạt > 95%, thể tích 5 - 10 ml/lọ, nồng độ -
globulin 5g/l, pH 5 - 6; loại dùng tiêm bắp (IMIG); thời gian bảo quản > 1 năm.
5. Nghiên cứu qui trình chiết tách và chuẩn hoá albumin (phơng pháp
Cohn bằng ethanol): độ tinh khiết đạt > 80%, thể tích 5 - 10 ml/lọ, nồng độ
albumin 5 - 10 g/l; pH 5 - 6, thời gian bảo quản > 1 năm.
6. Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng nhằm đánh giá hiệu quả điều trị của
các sản phẩm. 3
2. Tổng quan 2.1. Lịch sử phát triển truyền máu và sản xuất các sản phẩm máu
Lịch sử truyền máu có thể tóm tắt trong các sự kiện sau đây: (Xem phụ lục 1)
1. Đầu thế kỷ XVII xuất phát từ lời kêu cứu của các bệnh nhân thiếu máu,
lời thỉnh cầu của họ đã làm thức tỉnh thầy thuốc lu ý đến nghiên cứu về truyền
máu. Đồng thời, W. Harvey phát minh hệ tuần hoàn, ông cho rằng máu chạy
trong các mạch máu. Nh vậy có thể lấy máu ra và truyền trả lại.
2. Trên cơ sở này Richard Lower (1662) đã lấy máu động vật truyền cho
ngời, nhng không có kết quả bệnh nhân tử vong. Do đó nghiên cứu TM bị cấm

- Tốc độ lắng: 35 mm sau 2 giờ.
- Khối tế bào (Hct): 0,40 - 0,50 l/lít hoặc 40 - 50%.
- pH = 7,33 - 7,73, các chất đệm duy trì pH là bicarbonate 23-27mmol/lít,
đệm phorphate, đệm protein, đệm Hb (chiếm 82%).
- áp lực keo do protein tạo nên bình thờng 28mmHg.
- áp lực thẩm thấu do các cation, amion tạo nên bình thờng là 7,2-8,1atm
(trực tiếp) hoặc đo bằng độ hạ băng điểm là 292-308 mmol/lít huyết tơng.
Máu có nhiều chức năng cần thiết cho sự sống của cơ thể:
- Dinh dỡng : vận chuyển các chất dinh dỡng
- Bài tiết : các chất cặn bã
- Hô hấp : ôxy và CO
2
- Bảo vệ : bạch cầu, kháng thể, bổ thể
- Cầm máu bằng cơ chế đông máu.
- Điều hoà:
+ Điều hoà các chức phận nhờ các hormone.
+ Duy trì tuần hoàn (huyết áp).
+ Điều hoà thân nhiệt.
Máu gồm 2 phần chính: tế bào và huyết tơng.
2.2.1. Phần tế bào máu: gồm có hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, tế bào gốc (9).
2.2.1.1. Hồng cầu
Có nguồn gốc từ tế bào gốc định hớng tuỷ (CFU - GEMM) phát triển và
biệt hoá thành HC ra máu ngoại vi.
- HC chứa HST vận chuyển O
2
, chức năng này do màng hồng cầu đảm nhiệm.
- Cấu tạo màng hồng cầu:
+ Lớp ngoài cùng: carbohydrat kỵ nớc liên kết với protein tạo thành glycoprotein.
+ Lớp lipid màng: gồm 2 lớp lipid kép.
+ Protein màng: protein xuyên màng, màng hồng cầu đợc cấu trúc bởi 3

- Bắt nguồn từ tế bào gốc định hớng tuỷ (CFU - GEMM) phát triển thành
bạch cầu trởng thành làm nhiệm vụ ở máu ngoại vi.
- Bạch cầu tuỷ làm nhiệm vụ bảo vệ cơ thể bằng cơ chế thực bào (không đặc
hiệu) tiêu huỷ vi trùng và các tế bào thoái hoá của cơ thể.
- Bạch cầu tuỷ có 2 loại: bạch cầu hạt và bạch cầu mono, chúng đều có chức năng
thực bào. Bạch cầu mono - đại thực bào còn làm nhiệm vụ trình diện kháng nguyên.
- Bạch cầu tuỷ: có nhiều men sử dụng tiêu huỷ các đối tợng thực bào.
- Bạch cầu Mastocyte, bạch cầu ái kiềm có nhiều chất trung gian gây dị ứng
nh: histamin, serotonin, prostaglandin, thromboxan gây sốt, gây đau.
- Bạch cầu sản xuất các cytokin khi đợc hoạt hoá.
- Bạch cầu có kháng nguyên HLA gây miễn dịch đồng loài.
b) Bạch cầu lympho:
Bắt nguồn từ tế bào CD
34
trở thành tế bào gốc dòng lympho. Từ tế bào này
phát triển thành 3 dòng tế bào: T lympho, B lympho và tế bào NK. T và B lympho
cùng với đại thực bào trực tiếp tham gia tạo kháng thể đặc hiệu, sản xuất các cytokin.
2.2.1.3. Tiểu cầu
- Mẫu tiểu cầu sinh ra từ tế bào gốc định hớng tuỷ (GEMM) phát triển
thành tiểu cầu.

6
- Tiểu cầu có nhiệm vụ chống chảy máu giai đoạn đầu nhờ chức năng dính
và ngng tập.
- Tiểu cầu có hệ thống kháng nguyên HPA (human platelet antigen) và
HLA-A, B, C; không có HLA lớp II.
- Có nhiều chất gây dị ứng, gây viêm trong các hạt đặc, hạt , khi ly giải
gây rối loạn đông máu.
2.2.1.4. Tế bào gốc sinh máu (hemopoietic stem cells):
ở máu ngoại vi có một lợng rất nhỏ tế bào gốc sinh máu có dấu ấn CD

Cho ghép tuỷ tự thân: thờng dùng liều hoá chất cyclophosphamid rồi kích
thích huy động bằng G-CSF. Phơng pháp này có hiệu quả cho phép tự thân, hoá
chất (cyclophophoneid) có tác dụng loại tế bào ung th còn lại (MRD = minitmal
residual disease).
Cách thứ hai, không dùng hoá chất mà trực tiếp kích thích bằng G-CSF liên
tục trong 5 ngày, thu hoạch vào ngày thứ 5, cách này không gây tác dụng của hoá
chất cho ngời cho, ngời cho hoàn toàn an toàn. Cách này dùng cho ghép tuỷ đồng
loài, ngời cho là ngời bình thờng khoẻ mạnh.
- Từ máu cuống rốn ngời: máu cuống rốn có lợng đáng kể tế bào gốc CD
34
,
tế bào gốc ở đây có khả năng sinh sản và biệt hoá lớn. Vì vậy máu cuốn rốn đợc
coi là một nguồn vô tận cung cấp tế bào gốc sử dụng cho điều trị.
Cho tới nay Viện HHTMTW có thể tách cả 4 thành phần tế bào máu nói trên
sử dụng cho điều trị. Nhờ kết quả này chúng ta đã phát triển truyền máu từng thành
phần vừa có hiệu quả cao, an toàn và tiết kiệm.

7
2.2.2. Phần huyết tơng
- Máu toàn phần đợc chống đông rồi ly tâm khoảng 5000 g/ 5 phút ta thu
đợc huyết tơng. Đó là một dịch lỏng gồm nhiều chất dạng hoà tan, là kho chứa
các tế bào máu từ tuỷ xơng tạo ra trớc khi vào tổ chức. Khác với huyết thanh,
huyết tơng có chất chống đông máu, là chất ức chế phản ứng đông máu nh
citrate, acid - citrate dextrose, citrate - phosphate - dextrose, các chất chống đông
làm tăng thể tích huyết tơng, nhng không ảnh hởng đến tác dụng của các yếu
tố đông máu.
- Huyết tơng có tỷ trọng 1,055 - 1,063g/ml, chiếm 45% trọng lợng toàn
cơ thể (1,3 - 1,8lít/m
2
da, 40-50ml/kg), nớc của huyết tơng chiếm 68% lợng

, 75% CO
2
nằm trong huyết tơng, 25% trong HC. CO
2
tồn tại cả
3 dạng hoà tan trong huyết tơng, dạng HCO
3
-
và dạng kết hợp với HST.
2.3.3. Các vi chất và sinh tố
- Các cation bao gồm: Na
+
, K
+
, Ca
2+
, Mg
2+

- Các anion: Cl
-
, HCO
3
-
, HPO
4
2-
, SO
4
2-

chậm nhất là globulin. Nếu điện di trên gen tinh bột hoặc polyacryamid có thể
tách đợc 18 - 21 thành phần (12, 24).

9
Ngày nay ngời ta biết huyết tơng có khoảng trên 120 protein khác nhau
có thể phân lập đợc, các protein này có thể xếp loại theo nhiều cách khác nhau:
theo khả năng hoà tan, khả năng điện di, hoặc theo chức năng của chúng.
Theo chức năng, Carlson (1996) đã phân thành 7 nhóm bao gồm: nhóm
globulin miễn dịch, nhóm các thành phần bổ thể, các yếu tố đông máu, các chất
ức chế enzym, các protein liên kết với lipid, các protein vận chuyển (trong đó có
albumin), và một số protein khác cha xác định đợc chức năng.
Phân loại các protein theo chức năng: (24)
a) Các globulin miễn dịch: IgG, IgA, IgM, IgD và IgE (phụ lục 1)
b) Các thành phần bổ thể: C1
q
, C1
r
, C
1s
, C
2
, C
3
, C
4
, C
5
, C
6
, C

glycoprotein,
1
, glycoprotein.
-
1
microglobulin
- Histedin giàu glycoprotein, serum amyloid
Các thành phần protein nói trên đều có thể thay đổi trong bệnh lý, nh quá
trình viêm, hoạt tính của bổ thể C
1
, fibrinogen, ceruloplasmin, haptoglobin
tăng lên nhiều lần, trong khi đó albumin lại giảm một cách đáng kể, tác dụng
này chịu ảnh hởng của các cytokin nh IL-2; IL-6; TNF (24, 31).
Bằng phơng pháp điện di và điện di MD, sử dụng kháng huyết thanh đa
giá đặc hiệu với các protein huyết tơng ngời, ta có thể tách ra đợc nhiều
thành phần protein khác nhau (H.1.1).

10
Khán
g
hu
y
ết thanh đa
g
iá
đặc hiệu hu
y
ết t ơn
g
n

u
u

2

1
Albumin
2


H
.1.1.

11

2.3.5. Một số protein và chất phi protid huyết tơng đặc biệt
- Albumin: là một trong nhiều protein đợc tổng hợp tại gan, trọng lợng
phân tử 65 kd, có 17 cầu nối disulfure (SH-). Huyết tơng ở ngời trởng thành
khoẻ mạnh albumin chiếm 35 - 50 g/lít, chiếm 56% tổng protein huyết tơng,
luôn đổi mới thời gian bán huỷ là 20 ngày. Albumin có lợng nhỏ các protein
tối cần thiết mà cơ thể không tổng hợp đợc nh tryptophan, methiomin,
isoleucin. Hàng ngày cơ thể có khả năng tổng hợp đợc 140-200mg albumin/kg
cân nặng cơ thể. Số này phân bổ ở các khu vực nh sau: 1/3 trong lòng mạch, số
còn lại nằm ngoài lòng mạch, cơ và đờng tiêu hoá (11, 44).
Điều hoà cân bằng albumin giữa sản xuất và tiêu huỷ là do cơ chế ức chế
ngợc (Feed Back) và cơ chế tiêu huỷ nội bào bởi các protease trong hệ enzym
lysosom nội bào. Albumin đóng vai trò duy trì áp lực keo và khối lợng tuần

-
globulin, trọng lợng phân tử là 85.000 làm nhiệm vụ vận chuyển hemoglobin về
gan để tiếp tục chuyển hoá và không để hemoglobin tự do lọt qua cầu thận.
- Transferrin (Siderophilin) là protein thuộc phần -globulin, trọng lợng
phân tử là 90.000. Nồng độ transferrin trong huyết tơng khoảng 2,9g/l,
transferrin làm nhiệm vụ vận chuyển sắt, cùng với ferritin và haptoglobin,
transferrin làm nhiệm vụ điều hoà cân bằng sắt trong cơ thể.

12
- Seruloplasmin: là protid có màu xanh và vận chuyển đồng (Cu), cứ một
mol seruloplasmin mang 8 nguyên tử đồng, trọng lợng phân tử là 160.000, do
gan tổng hợp.
- Fibrinogen: là một glucoprotein gồm 3 chuỗi polypeptid khác nhau liên
kết với nhau bằng các cầu disulfur (SH-) phần liên kết với glucid qua asparagin
và N-acetyl, glucosamin, fibrinogen có trọng lợng phân tử là 330.000 -
340.000, di chuyển điện di giữa và globulin. Nó đợc tổng hợp ở gan và nồng
độ trong máu trung bình là 2 - 4 g/l (chiếm 4-5% lợng protid huyết thanh).
- Lipid: lipid toàn phần trong huyết thanh bình thờng là từ 4-7 g/l gồm
triglycerid, phospholipid, steroid Khi điện di nó tách cho ta 2 vùng bằng nhau, -
lipoprotein (hình thoi) và -lipoprotein (hình cầu) trọng lợng phân tử 1.300.000,
chứa 60% lipid và 1-2% glucid.
- Cholesterol: cholesterol máu tồn tại dới hai dạng cholesterol tự do và
cholesterol este hoá, chúng đều đợc tổ hợp trong các hạt lipoprotein, nồng độ
cholesterol toàn phần trong huyết thanh 1,5 - 2,0 g/ l hay 4 - 6,5 mmol/l (tự do
1,10 - 1,60 g/l; este hoá 0,35 - 0,9 g/l).
- Glucid: glucid trong máu là glucose, nồng độ bình thờng của glucose là
80 - 120 mg% và 5,55 mol/ lít, đợc điều hoà bởi hệ thống hormon và gan.
- Các Nitơ-phi-protid: các chất chứa nitơ phi protid là sản phẩm thoái hoá
của protid và acid amin, gồm có:
Urê: là sản phẩm thoái hoá quan trọng nhất của protid. Nó không độc

trong các mô.
Các enzym có nguồn gốc tế bào gồm: các enzym khu trú ở bào tơng nh
LDH, aldolase, các enzym vừa có ở bào tơng vừa có ở ty thể là AST, các enzym có
nguồn gốc ty thể GLDH, OCT, enzym có nguồn gốc lysosom là phosphatase
acid, glucuronidase Các enzym này đợc quan tâm nhiều hơn vì khi tăng
hoạt tính của chúng trong huyết thanh phản ánh trạng thái chức năng và bệnh lý
của các cơ quan tơng ứng.
2.3.6. Một số đặc điểm lý hoá của protein huyết tơng liên quan đến
các kỹ thuật chiết tách các thành phần protein huyết tơng:
Để tách đợc các thành phần protein, ngời ta chú ý đến các đặc điểm lý
hoá của huyết tơng (5, 24, 61).
- Điểm đẳng điện của protein: mỗi protid huyết tơng đều có điểm đẳng
điện (isoelectric) tơng ứng với pH. Khi đó protein trở nên trung tính về điện
tích, không sinh ra và cũng không cố định H
+
.
- Tính hoà tan của protein: tính hoà tan này chịu ảnh hởng của nhiều yếu tố:
Tính hoà tan trong dung dịch muối, độ hoà tan muối thấp thì độ hoà tan
protein giảm và ngợc lại;
ảnh hởng của nhiệt độ: độ hoà tan tăng khi nhiệt độ tăng - ngợc lại
nhiệt độ thấp độ hoà tan giảm.

14
- Tính bền vững và biến tính của protein: khi cấu trúc protein thay đổi độ
hoà tan thay đổi, tính chất sinh học cũng mất đi. Các yếu tố ảnh hởng đến biến
tính của protein huyết tơng:
Nhiệt độ: Nhiệt độ tăng có thể phá vỡ liên kết của phân tử protein.
Độ acid hoặc kiềm.
Do các tác nhân vật lý nh tia cực tím làm đứt gãy các liên kết peptid,
sóng siêu âm gây ôxy hoá.

dịch (Igs), các yếu tố đông máu và một số chất kháng đông bao gồm cả các yếu
tố ức chế men nh antithrombin III,
1
-proteinase (40, 53).
2.4. Các phơng pháp chiết tách các thành phần huyết tơng
Sản xuất các thành phần huyết tơng dựa trên 3 điều kiện cơ bản:
- Huyết tơi có chất lợng tốt: > 60g protein, huyết sắc tố > 120g/l
- Độ an toàn cao: sàng lọc HIV, HBV, HCV, giang mai bằng phơng pháp
miễn dịch (ELISA) và phơng pháp sinh học phân tử nh phản ứng chuỗi
polymerase (polymerase chain reaction: PCR).
- Điều kiện sản xuất: phòng lạnh, vô trùng, trang bị tốt.
Các phơng pháp thờng dùng: tủa lạnh bằng ethanol, sắc ký (chromatography),
miễn dịch hấp thụ (immunoaffinity), tái tổ hợp (recombinant), chuyển gene ở động vật
(transgenic animal) và gần đây là proteomics.
2.4.1. Phơng pháp tủa lạnh bằng ethanol
2.4.1.1. Phơng pháp đợc Cohn nghiên cứu và thực hiện thành công tại
Mỹ từ 1947 nhờ thành công về nghiên cứu và sản xuất túi chất dẻo của Murphy
và Gibson, túi này có độ mềm dẻo có thể ly tâm tốc độ lớn mà không bị vỡ, bảo
quản lạnh sâu không h hỏng, Cohn đã ứng dụng túi chất dẻo để tách các thành
phần huyết tơng bằng ethanol. Bằng phơng pháp này khoảng 1949 - 1950 Cohn
đã thành công tách đợc 3 thành phần huyết tơng: albumin, immunoglobulin
(IgG) và ít tủa sợi huyết (fibrinogen), F-VIII. Tới 1964 tác giả đã thành công
nghiên cứu tan đông (thawing) của huyết tơng toàn phần ở nhiệt độ 2-4
0
C thu
đợc sản phẩm yếu tố VIII, sợi huyết, Von - Willebvand. Tác giả nhận thấy bớc
này không liên quan đến bớc sản xuất albumin và IgG cũng bằng ethanol (31).
* Về u điểm:
- Phơng pháp này có khả năng xử lý đợc một lợng lớn huyết tơng trong
bể có điều nhiệt (thermostatic tanks).

protein cha biết trong huyết tơng (61).
Bớc 1: Sử dụng nồng độ ethanol 8%, pH 7,2, lực Ion 0,14 sẽ thu đợc F-
VIII, V.Willebrand, fibrinogen.
Bớc 2: Xử lý nớc mặt của bớc 1 bằng ethanol 25%, pH 6,9; lực ion 0,09
thu đợc tủa II, III đó là yếu tố: F-II, V, VII, IX, X và các Ig: IgG; IgA, ít IgM
Bớc 3: Xử lý nớc mặt bớc hai bằng ethanol 18%, pH 5,2 thu đợc tủa
IV-1 và nớc mặt IV-1 trong đó có antithrombin III, bổ thể, IgM, protease inhibitor.
Bớc 4: Xử lý nớc mặt bớc 3 (IV-1) bằng ethanol 40%, pH 5,8 thu
đợc tủa IV-4 và nớc mặt IV-4. Trong tủa IV- 4 có haptoglobin transferrin,
-globulin.

17
Bớc 5: Xử lý nớc mặt bớc 4 (IV-4) bằng ethanol 40%, pH 4,8 thu
đợc tủa V có chứa albumin và -globulin; nớc mặt V đợc tủa bằng ethanol
40%, pH 5,2 thu đợc albumin sạch (H.2.1) (59).
Qui trình này cho 5 nhóm sản phẩm (Fraction I; II + III; IV-1; IV-4; V)
trong đó, mỗi nhóm lại có thể chiết tách các sản phẩm tinh khiết hơn. Tuy nhiên,
trong điều kiện cha đủ phơng tiện thì tập trung vào sản phẩm I (F-I), sản phẩm
II+III (F-II, III). Sản phẩm V (F-V) (bảng 2.1). F-I cho yếu tố VIII, F-II cho IgG,
F-V cho albumin, đó là các thành phần quan trọng, chiếm lợng lớn của huyết
tơng toàn phần.
Bảng 2.1: Các nhóm sản phẩm của protein huyết tơng thu đợc bằng
phơng pháp tủa ethanol của Cohn Các phân đoạn
(Fraction)
Ethanol (%) pH Protein nhận đợc
I 8 - 10 7,2
- Fibrrinogen

Huyết tơng tơi
Tủa I
Dịch nổi I
Ethanol 25%
pH 6,9; I = 0,09
Ethanol 8%

lobin
- -globulin

Dịch nổi V
Tủa V
- Albumin
- -globulin

- Ethanol 40%
- pH 4,5; I = 01
Dịch nổi
Loại
Dịch nổi loại bỏ
Albumin
sạch
- Ethanol 40%
- pH 5,2
- I = 0,01
Bớc 3
Bớc 4
Bớc 5
H.2.1. Sơ đồ tách các thành phần huyết tơng bằng phơng pháp Cohn
có cải tiến (theo Van Aken W.G. 1996) (59)