~ i ~
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
BK
TP HCM
ĐỒ ÁN MÔN HỌC
TRANG BÌA
CÔNG NGHỆ CỐ ĐỊNH ENZYM
VÀ ỨNG DỤNG SVTH : NGUYỄN BẢO DƢ
MSSV : 60700443
GVHD : TS. TRẦN BÍCH LAM
TRANG BÌA
TP Hồ Chí Minh, 6/2011
Đồ án môn học
~ ii ~
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6/2011
Nguyễn Bảo Dƣ
Đồ án môn học
~ iv ~
MỤC LỤC
TRANG BÌA i
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN ii
LỜI CẢM ƠN iii
MỤC LỤC iv
DANH MỤC HÌNH vi
DANH MỤC BẢNG vi
Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1
1.1. Lịch sử phát triển của enzym cố định 1
2.1.3.2. Nguồn thu nhận enzym α-galactosidase 23
2.1.3.3. Cách phƣơng pháp cố định enzym α-galactosidase 23
2.1.3.4. Ứng dụng của enzym riffinase cố định 26
2.2. Ứng dụng trong phân tích 27
2.2.1. Tổng quan về cảm biến sinh học (biosensor) 27
2.2.1.1. Giới thiệu về cảm biến sinh học 27
2.2.1.2. Lịch sử phát triển cảm biến sinh học 27
2.2.1.3. Phân loại 28
2.2.1.4. Các yếu tố sinh học 29
2.2.1.4.1. Enzym 29
2.2.1.4.2. Kháng thể 29
2.2.1.4.3. Vi sinh vật 30
2.2.1.5. Bộ chuyển đổi (transducer) 30
2.2.1.5.1. Chuyển đổi điện hóa 30
2.2.1.5.2. Chuyển đổi quang 30
2.2.1.5.3. Chuyển đổi nhiệt 30
2.2.1.5.4. Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric) 30
2.2.2. Cảm biến sinh học sử dụng L-glutamate oxidase và L-glutamate dehydrogenase
cố định dùng để phân tích monosodium glutamate trong thực phẩm 31
2.2.2.1. Giới thiệu 31
2.2.2.2. Phƣơng pháp thí nghiệm 31
2.2.2.2.1. Các hóa chất sử dụng 31
2.2.2.2.2. Sự cố định enzym 31
2.2.2.2.3. Điện cực 32
2.2.2.2.4. Thử nghiệm 32
2.2.2.2.5. Quá trình phản ứng 33
2.2.2.2.6. Cấu hình nhiệt độ và pH 33
2.2.2.2.7. Xác định giá trị K
m
và V
~ 1 ~
Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. Lịch sử phát triển của enzym cố định [1]
- Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát và cho thấy rằng enzym invertase của nấm men
(EC.3.2.1.2.6) khi hấp thụ vào than có khả năng thủy phân đƣờng saccharose. Sau đó trên thế
giới xuất hiện nhiều báo cáo về khả năng cố định enzym bằng liên kết đồng hóa trị trên chất
mang. Trƣớc năm 1953 chƣa có một nghiên cứu nào về enzym không hòa tan đƣợc ứng dụng
vào thực tế.
- Năm 1953, Grubhofer và Schleith đã cố định đƣợc một số enzym nhƣ carboxy
peptidase, diastase, pepsin và ribonuclease trên polyaminostyrene bằng liên kết đồng hóa trị
và các nghiên cứu trên mới bắt đầu thử nghiệm ứng dụng qui mô pilot.
- Năm 1954, Chang đã tạo ra đƣợc các vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzym để chống lại
dị ứng khi đƣa enzym vào cơ thể.
- Năm 1963, Bernfeld và Wan đã thí nghiệm thành công việc nhốt các enzym nhƣ
amylase, trypsin, papain, ribonuclease vào gel polyacrylamide.
- Năm 1964, Quiociio và Richards đã mô tả phƣơng pháp liên kết chéo cố định
carboxy peptidase A với glutaraldehyde. Cũng trong năm này Chang đã triển khai phƣơng
pháp tạo vi nang để nhốt enzym carbonic anhydrase.
- Năm 1969, Wilson đã xây dựng thành công xƣởng thực nghiệm để sản xuất glucose
bằng glucoamylase cố định.
- Năm 1969, Chibata và những ngƣời cộng tác ở công ty Tanabe Seiyaku – Nhật đã là
những ngƣời đầu tiên thực hiện thành công việc áp dụng enzym cố định vào sản xuất công
nghiệp. Theo phƣơng pháp cố định enzym của các tác giả ngƣời Nhật, enzym aminoacylase
của nấm sợi đã đƣợc gắn vào DEAE-sephadex thông qua liên kết ion và sử dụng chúng cho
các quá trình thủy phân.
- Năm 1970, Mosbach đã tiến hành cố định ba loại enzym: -galactosidase, hexokinase,
glucophosphatase bằng liên kết cộng hóa trị với các hạt sephadex.
- Năm 1971, Gregoriadis đã triển khai liposome có chứa amyloglucosidase.
- Năm 1973, Chibata và các cộng tác viên cũng là những ngƣời đầu tiên thành công
enzym có sự thay đổi ở mức độ nhất định. Chính vì sự thay đổi cấu trúc này mà sự kết hợp
giữa enzym và cơ chất sẽ kém đi, dẫn đến hoạt tính của chúng cùng giảm.
Do enzym bị nhốt vào mạng lƣới hoặc bị liên kết bởi chất mang khiến cho sự tiếp
xúc giữa enzym và cơ chất bị kém đi.
- Enzym cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis – Menten nhƣng có một số sai
khác nhất định:
Có thể xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzym và chất mang.
Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học
~ 3 ~
Xảy ra hiện tƣợng cản trở khuếch tán của cơ chất và sản phẩm làm giảm tốc độ
phản ứng.
- Enzym cố định thƣờng có tính bền nhiệt hơn enzym tự do nhờ có tác dụng che chở
của chất mang.
- Enzym cố định thƣờng có pH tối ƣu không trùng với enzym tự do cùng loại.
- Enzym cố định do có chất mang che chắn nên đƣợc bảo vệ tốt hơn enzym tự do.
- Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần và dễ dàng tách ra khỏi cơ chất một cách
dễ dàng sau phản ứng và độ bền của enzym cố định cao hơn enzym tự do.
1.2.3. Ƣu nhƣợc điểm của enzym cố định [1]
Ưu điểm:
- Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài.
- Enzym cố định không lẫn vào trong sản phẩm cuối của phản ứng enzym, do đó nó
không gây ảnh hƣởng xấu đến chất lƣợng sản phẩm, hay nói cách khác chúng ta không tốn
chi phí cho việc tách enzym ra khỏi sản phẩm.
- Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang – enzym ra khỏi
dung dịch cơ chất.
- Enzym cố định tƣơng đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn enzym tự do.
- Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phƣơng pháp liên tục.
Nhược điểm:
giảm do những biến đổi về
cấu trúc của enzym trong quá
trình cố định.
Phƣơng pháp gắn các
phân tử enzym lại với
nhau bằng liên kết cộng
hóa trị
Tạo đƣợc liên kết rất bền trƣớc
các tác nhân pH, nhiệt độ…
Thƣờng đƣợc dùng phối hợp với
các phƣơng pháp khác.
Chi phí cao, thao tác thực
hiên tƣơng đối phức tạp.
Hoạt tính enzym có thể bị
giảm do những biến đổi về
cấu trúc của enzym trong quá
trình cố định.
Phƣơng pháp vật lý
Phƣơng pháp
Ƣu điểm
Nhƣợc điểm
Phƣơng pháp gắn enzym
lên chất mang bằng tác
nhân vật lý
Thao tác thực hiện đơn giản.
Điều kiện tiến hành cố định
enzym ôn hòa nên không làm
mất hoạt tính của enzym trong
quá trình cố định.
Có khả năng tái sử dụng chất
1.2.5. Vật liệu cố định [1]
Vật liệu và phƣơng pháp cố định là hai yếu tố có tính chất quyết định đến hiệu quả của
quá trình cố định enzym. Trong đó, không có đặc điểm, tính chất của vật liệu cố định nào
thích hợp cho tất cả các loại enzym và cũng không có enzym nào thích hợp với tất cả các loại
vật liệu cố định.
Vật liệu cố định enzym và tế bào có thể chia làm hai loại: vật liệu vô cơ và vật liệu hữu
cơ.
Vật liệu vô cơ:
- Đặc điểm: chất mang vô cơ bền với các tác động bên ngoài, không bị vi sinh vật ăn
mòn, phân hủy, nhƣng việc gắn với enzym thƣờng khó khăn hơn.
- Một số chất mang vô cơ thông dụng nhƣ: thủy tinh xốp, các oxid kim loại nhƣ oxid
nhôm, oxid mangan, oxid magie, silicagel…
Vật liệu hữu cơ:
- Đặc điểm: chất mang hữu cơ thƣờng có các nhóm hoạt động hóa học nhƣ: -NH
2
, -
COOH, -OH, -SH,… nên dễ kết gắn với enzym nhƣng độ bền với tác động của môi trƣờng
không cao, đặc biệt các polymer sinh học rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và tấn công.
Các polymer tự nhiên:
- Tinh bột là vật liệu phong phú rẻ tiền. Tinh bột dùng để đóng mạch, diethanolamin
tinh bột đã đƣợc dùng làm chất mang cố định enzym nhƣ lipase, glucoisomerase, trypsin,
amylase. Nhƣợc điểm của tinh bột là độ trƣơng kém, thiếu các nhóm chức năng nên khả năng
cố định và hoạt tính enzym còn thấp. Tinh bột thƣờng đƣợc ghép copolymer với các vinyl
monomer ƣa nƣớc nhƣ acrylamide, acrylic acid để cải thiện tính chất cơ lý, độ trƣơng nở và
tạo các nhóm chức năng trên bề mặt.
Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học
~ 6 ~
- Cellulose và dẫn xuất của cellulose là CM-cellulose, DEAE-cellulose,
- Anginate, carrageenan, cả hai vật liệu này tạo gel trong dung dịch CaCl
2
dùng để nhốt
tế bào, enzym.
- Chất mang protein thƣờng là gelatin, keratin, albumin,… thƣờng có khả năng dễ tạo
màng, tạo hạt, nhốt enzym trong khuôn gel với tác nhân đóng mạch là glutaraldehyde; nhƣợc
điểm của nhóm này là thƣờng kém bền, dễ bị nhiễm khuẩn.
Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học
~ 7 ~
Các polymer tổng hợp:
- Các polymer tổng hợp đƣợc sử dụng làm chất mang cố định enzym nhƣ
polyacrylamide, polyester, polyvinylalcohol, polyvinylacetate, polyacrylic,
polyhydroxyethylacrylate, polystyrene,…
- Ƣu điểm chung của các polymer tổng hợp này là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ
với sự tấn công của vi khuẩn, độ trƣơng tốt, một số polymer có thể điều chỉnh kích thƣớc siêu
lỗ.
- Nhƣợc điểm là một số polymer có giá thành cao, khả năng tƣơng hợp sinh học kém,
không thể phân hủy trong môi trƣờng tự nhiên nên gây ô nhiễm môi trƣờng.
1.2.6. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự cố định enzyme [1]
Ảnh hưởng của chất mang
- Các tính chất lý học của chất mang nhƣ tính hòa tan, tính bền cơ hóa, diện tích, tính
háo nƣớc và kỵ nƣớc,…đều có ảnh hƣởng nhất định đến lƣợng enzym đƣợc liên kết, đến tính
bền và hoạt tính sinh học của các chất dẫn xuất enzym không tan.
- Bản chất hóa học của chất mang cũng ảnh hƣởng đến khả năng tạo thành dẫn xuất
enzym và tới khả năng chất mang hấp phụ không đặc trƣng các chất từ môi trƣờng phản ứng.
- Sự định vị enzym giúp cho dẫn xuất enzym không tan có tính bền nhiệt cao hơn
enzym tan.
- Chất mang có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzym trong các dung môi, làm đứt
hai yếu tố chính là kích thƣớc chất mang polyme và trọng lƣợng của phân tử cơ chất. Hai yếu
tố này sẽ làm giảm tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác. Hơn nữa, cùng
với hoạt tính xúc tác cao của enzym sẽ làm xuất hiện gradient nồng độ của cơ chất và sản
phẩm của dung dịch và chất mang chứa enzym cố định. Điều này làm cho các thông số công
nghệ thay đổi, đó là điều cần để ý khi thiết lập quy mô của quá trình.
Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học
~ 9 ~
Chƣơng 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH
2.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
2.1.1. Enzym β-galactosidase
2.1.1.1. Giới thiệu về enzym β-galactosidase [2]
Enzym β-galactosidase (EC.3.2.1.23) là một lactase thủy phân đƣờng lactose thành
các monomer là glucose và galactose. Việc sử dụng β-galactosidase để thủy phân lactose
trong sữa và whey là một trong những ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp chế biến thực
phẩm và các sản phẩm từ sữa. Enzym này có thể đƣợc sử dụng dƣới dạng hòa tan hoặc dạng
cố định nhƣng dạng hòa tan chỉ có thể sử dụng trong qui trình sản xuất gián đoạn, còn dạng
cố định có lợi thế hơn là có thể sử dụng tốt cho cả hai qui trình sản xuất gián đoạn và liên tục.
Mặc dù hầu hết các ngành công nghiệp vẫn thủy phân lactose với enzym tự do, nhƣng
việc sử dụng enzym β-galactosidase cố định là một lĩnh vực đáng quan tâm vì những tiềm
2.1.1.3. Các phƣơng pháp cố định enzym β-galactosidase [2]
Phương pháp hấp phụ vật lý
Các chất vô cơ nhƣ nhôm, silic, thủy tinh xốp, đất sét, bentonite,… chất hữu cơ nhƣ
cellulose, tinh bột, than hoạt tính, nhựa trao đổi ion,… đƣợc sử dụng làm chất mang hấp phụ
trong cố định enzym. Hơn nữa có thể xử lí thêm với glutaraldehyde để tăng sự ổn định.
Enzym β-galactosidase từ K. fragilis và K. lactis đƣợc cố định trên chitosan có hoạt
độ riêng 0.9–2.2 U/mg trọng lƣợng khô của tế bào. Hoạt tính của enzym đƣợc cố định từ K.
fragilis thì cao hơn nhƣng độ ổn định của enzym cố định từ A. oryzae thì cao hơn 5-14 lần tùy
thuộc vào phƣơng pháp cố định. Khi dùng phƣơng pháp hấp phụ ngƣời ta nhận thấy hoạt tính
cao nhất thu đƣợc khi dùng enzym từ nấm men với chất mang là Ostsorb-DEAE. Hơn nữa, sự
cố định tối đa đạt đƣợc ở pH 5.5 và kết quả tối ƣu thu đƣợc khi có mặt dung dịch đệm
citrate/phosphate trong suốt quá trình cố định β-galactosidase từ E. coli bằng phƣơng pháp
hấp phụ vật lí trên chromosorb-W. Một thiết bị phản ứng mới chứa β-galactosidase từ B.
circulans đƣợc cố định trên màng có gờ làm từ PVC và silica đƣợc sử dụng để thủy phân
lactose trong sữa gầy. Việc cố định β-galactosidase từ Bullera singularis trên hạt Chitopearl
BCW 3510 (970 GU/g nhựa) bằng phƣơng pháp hấp phụ đơn giản cũng đƣợc thực hiện.
Các nghiên cứu về động học của enzym β-galactosidase từ Kluyveromces marxianus
(Saccharomyces) lactis đƣợc cố định trên những chất mang khác nhau nhƣ nhôm và silica đã
cho thấy rằng hoạt tính của enzym cố định phụ vào bản chất hóa học tự nhiên và cấu trúc vật
lí của chất mang. Khi kích thƣớc lỗ của các hạt chất mang tăng thì hoạt tính của enzym giảm
mạnh. Sự cố định β- galactosidase từ Thermus sp. diễn ra rất nhanh trên PEI-Sepabeads và
DEAE-Agarose. Tuy nhiên, độ mạnh hấp phụ thì cao hơn trong trƣờng hợp của PEI-
Sepabeads.
Enzym β-galactosidase từ B. stearothermophilus chịu nhiệt đƣợc cố định trên chitosan
sử dụng Tris (hydroxymethyl) phosphine (THP) và glutaraldehyde dùng để thủy phân đƣờng
lactose trong sữa. Khả năng chịu nhiệt và hoạt tính của enzym β-galactosidase đƣợc cố định
Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học
~ 11 ~
C. Các tế bào K.
bulgaricus có chứa enzym β-galactosidase đƣợc xử lí với glutaraldehyde đƣợc nhốt trong
alginate sử dụng dung dịch BaCl
2
. Các hạt alginate thu đƣợc sau khi xử lí tiếp theo với
polyethyleneimine thì đạt đƣợc độ ổn định cao. Enzym β-galactosidase của E. coli cũng đƣợc
cố định trong gel polyacrylamide thông qua việc chuẩn bị các dẫn xuất liên kết chéo của
enzym với bisimidoesters.
Tế bào K. marxianus có chứa lactase hoạt động đƣợc nhốt trong gel calcium pectate
(CPG) và trong gel calcium alginate (CAG) đƣợc làm cứng bằng polyethyleneimine và
glutaraldehyde. Các tế bào đƣợc cố định trong CPG đã thủy phân hơn 80% lactose trong quá
trình liên tục và bán liên tục.
So sánh các phƣơng pháp cố định enzym β-galactosidase từ Thermus aquaticus cho
thấy rằng việc cố định bằng liên kết chéo sau đó nhốt enzym trong hạt agarose có thể cho
hiệu suất hoạt động tốt hơn. Việc nhốt enzym β-galactosidase từ A. oryzae trong gel
polyvinyl alcohol lạnh xốp sẽ tăng cƣờng độ ổn định với nhiệt độ, pH, lực ion hơn so với
Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học
~ 12 ~
enzym tự do. Khung dạng sợi đƣợc làm từ alginate và gelatin đƣợc bổ sung chất làm cứng là
glutaraldehyde có thể giữ đƣợc 56% hoạt tính của enzym trong 35 ngày mà không có bất kì
sự giảm hoạt tính.
Ngƣời ta nhận thấy rằng chế phẩm β-galactosidase đƣợc liên kết chéo bằng canavalin
A có thể thủy phân lactose vƣợt trội trong hàng loạt quá trình so với các chế phẩm khác vì
chúng vẫn giữ đƣợc hoạt tính cao, cụ thể là giữ đƣợc 95% hoạt tính sau 7 lần sử dụng, và giữ
đƣợc 93% hoạt tính sau 2 ngày bảo quản ở 4
o
C.
Phương pháp liên kết cộng hóa trị
~ 13 ~
Bảng 2.1: Tóm tắt các phương pháp cố định enzym β-galactosidase
Phƣơng pháp cố định
Nguồn β-galactosidase
Tác nhân cố định
Hấp phụ vật lý
K. fragilis and K. lactis
A. oryzae
E. coli
B. circulans
B. stearothermophilus
A. niger
K. fragilis
K. lactis
Chitosan
Phenol-formaldehyde resin
Chromosorb-W
Polyvinyl chloride, Silica gel
Chitosan
Porous ceramic monolith
Chitosan beads
CPC-silica, agarose
Bao gói
K. bulgaricus
E. coli
A. oryzae
Thermus aquaticus YT-1
Penicillium expansum F3
K. lactis
sữa chua và tăng tốc độ phát triển cấu trúc và hƣơng vị cho phó mat. Chất lƣợng của sữa
đông lạnh và kem làm từ sữa cũng đƣợc cải thiện đáng kể khi thêm enzym lactase. Nó chống
Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học
~ 14 ~
lại sự kết tinh đƣờng lactose bằng cách thủy phân thành glucose và galactose và làm giảm
cấu trúc cát sạn.
Thủy phân lactose trong whey là một ứng dụng quan trọng khác của β-galactosidase
trong ngành công nghiệp chế biến sữa. Whey thủy phân và cô đặc hay whey thu đƣợc qua lọc
màng có thể đƣợc sử dụng nhƣ chất tạo ngọt trong sản xuất siro rau quả đóng hợp và nƣớc
giải khát.
β-galactosidase từ nấm (Miles Chemie) đƣợc cố định trong gel polyvinyl alcohol
đƣợc nhận thấy là bền nhiệt hơn so với enzym tự do, giữ đƣợc 70% hoạt tính sau 24h ở 50
o
C
và 5% hoạt tính ở 60
o
C. Thủy phân đƣợc 75% lactose trong 5-6h và mức độ chuyển đổi giảm
50% sau 30 lần sử dụng. Các nghiên cứu về thủy phân lactose sử dụng enzym cố định β-
galactosidase (Aspergillus niger) trên nhựa phenol formaldehyde cho thấy nhiệt độ tối ƣu phụ
thuộc vào thời gian thực hiện quá trình nhƣng không phụ thuộc vào nồng độ và sự chuyển đổi
lactose. Enzym β-galactosidase từ A. niger thủy phân đƣợc 70% lactose trong sữa gầy ở 40
o
C
trong 10 phút. Enzym β-galactosidase có nguồn gốc từ nấm cố định trên hydrogel đƣợc dùng
để thủy phân whey, sau 7h thủy phân đƣợc 70-75% whey. Sự cố định enzym β-galactosidase
từ A. niger trên silica gel đã đƣợc kích hoạt, kết quả là hầu hết các chế phẩm enzym cố định
sử dụng silica gel đƣợc kích hoạt bằng TiCl
3
sử dụng để thủy phân liên tục lactose từ whey và sữa. Ngƣời ta nhận thấy rằng pH tối ƣu của
enzym hòa tan và enzym cố định là 4.8 nhƣng nhiệt độ tối ƣu tăng từ 50
o
C lên 60
o
C đối với
enzym cố định. Enzym cố định có sự ổn định nhiệt cao hơn ở 60
o
C. Gần đây thiết bị phản
ứng packed bed cùng với tế bào có tính thấm đƣợc nhốt trong alginate đƣợc sử dụng để thủy
phân lactose trong sữa trong hệ thống liên tục, đạt hiệu suất 87.2%. β- galactosidase từ A.
oryzae đƣợc cố định bằng 3 kĩ thuật khác nhau: hấp phụ trên celite, liên kết cộng hóa trị với
chitosan, hoặc kết hợp lại với nhau bằng liên kết chéo. Các chế phẩm enzym cũng đƣợc so
sánh với nhau về hiệu suất cố định, đặc tính của enzym, độ ổn định, và hiệu quả tổng hợp
oligosaccharide. Các enzym β-galactosidase đƣợc kết hợp lại với nhau bằng liên kết chéo
đƣợc cho là có hiệu quả trong việc thủy phân lactose, đạt hiệu suất 78% trong 12h. β-
galactosidase từ A. oryzae đƣợc cố định trên silica, hoạt tính cũng nhƣ độ ổn định của enzym
đã đƣợc thẩm định, và kết quả cố định tốt nhất thu đƣợc bằng cách sử dụng glutaraldehyde
nhƣ chất hỗ trợ hoạt hóa và ổn định cho enzym. Trong các phƣơng pháp xử lí whey khác
nhau (vi lọc, siêu lọc, xử lí nhiệt), siêu lọc đƣợc xem là phƣơng pháp tốt nhất đối với dung
dịch cơ chất để cho vào thiết bị phản ứng.
Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng các kỹ thuật cố định khác nhau
Nguồn VSV
Tác nhân cố định
Hiệu suất
thủy phân
Thời gian thủy
phân
Fungal galactosidase
E. coli
>80%
5-6 h
6 h
2.5 h
5 h
2 h
7 h
2.5 h
3 h 2 h
Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học
~ 16 ~
2.1.1.4.2. Tổng hợp Galacto-Oligosaccharides (GOSs) [2]
Bên cạnh hoạt động thủy phân, enzym β-galactosidase còn có tác dụng chuyển nhóm
bằng cách thủy phân và sản xuất ra nhiều oligosaccharide, các oligosaccharide tác dụng có lợi
cho các vi sinh vật có ít trong đƣờng ruột. Hơn nữa, phản ứng chuyển nhóm có thể đƣợc dùng
để gắn galactose vào hợp chất hóa học khác, kết quả tạo thành galacto-oligosaccharide. Do đó
cho thấy tiềm năng trong việc sản xuất các thành phần thực phẩm, dƣợc phẩm, và các hợp
chất có hoạt tính sinh học khác. Các điều kiện của phản ứng chuyển nhóm galactose nên có
nồng độ lactose cao, nâng nhiệt độ và giảm hoạt độ nƣớc trong môi trƣờng phản ứng. Nhiệt
độ, nồng độ cơ chất và nguồn gốc enzym đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp
oligosaccharide. Tuy nhiên ảnh hƣởng của nồng độ lactose ban đầu thì lớn hơn. Nói chung
với nồng độ lactose ban đầu càng cao thì càng nhiều galacto-oligosaccharide đƣợc tổng hợp.
Nhiệt độ cao cũng có thể làm tăng hiệu suất tổng hợp oligosaccharide. Hiệu suất cao hơn ở
nhiệt độ cao hơn là một lợi thế bổ sung khi tiến hành phản ứng ở nồng độ lactose ban đầu
từ lactose trong thiết bị phản ứng packed bed, kết quả tổng hợp đƣợc 55% GOS với năng suất
4.4 g/(L-h) hoạt động trong 15 ngày. Năng suất GOS đạt cao nhất khi nồng độ lactose ban
đầu là 27% (w/w), 50% lactose đƣợc chuyển đổi với nồng độ ban đầu là 500 g/L.
Trisaccharides là một sản phẩm đƣợc tạo ra nhiều nhất, chiếm hơn 70% tổng lƣợng GOS
đƣợc tạo ra. β-galactosidase từ A. oryzae đƣợc cố định trên hạt chitosan tạo ra lƣợng
trisaccharides cao nhất (17,3% trong tổng lƣợng đƣờng), sử dụng 20% (w/v) lactose trong
vong 2h so với đối với enzym tự do và 4,6 % đối với tập hợp enzym có liên kết chéo.
2.1.2. Enzym lipase
2.1.2.1. Giới thiệu về enzym lipase
Lipase (EC 3.1.1.3) là một họ các enzym mà trong môi trƣờng tự nhiên chúng xúc tác
cho các phản ứng thủy phân chất béo. Tuy nhiên, trong các điều kiện phản ứng phù hợp
lipase còn cho thấy khả năng xúc tác các phản ứng ester hóa, chuyển ester và phản ứng
alcoholysis [4].
Sự phát triển nhanh chóng của công nghệ enzym đã mang lại sự quan tâm đáng kể đến
việc ứng dụng enzym lipase trong ngành công nghiệp dầu béo. Các phản ứng sử dụng enzym
lipase mang lại nhiều lợi thế hơn các phản ứng hóa học thông thƣờng. Lipase có thể sử dụng
một cách có hiệu quả và kinh tế trong điều kiện ôn hòa. Đây là đặc điểm quan trọng bởi vì
điều kiện khắc nghiệt sẽ gây ra các phản ứng trùng hợp chất béo và sinh ra nhiều sản phẩm
phụ. Do đó, việc sử dụng lipase sẽ làm giảm nhu cầu loại bỏ các hợp chất màu và các sản
phẩm phụ bằng cách phƣơng pháp tốn kém năng lƣợng [3].
Tuy nhiên, việc ứng dụng enzym lipase vẫn còn nhiều trở ngại do chi phí cao. Vấn đề
này có thể đƣợc khắc phục bằng cách sử dụng enzym cố định, khi đó enzym lipase có thể
đƣợc tái sử dụng dễ dàng và qui trình sản xuất có thể đƣợc vận hành liên tục [3].
2.1.2.2. Nguồn thu nhận enzym lipase
Enzym lipase thƣơng mại thƣờng đƣợc thu nhận từ động vật (tuyến tụy hoặc dạ dày
của động vật nhai lại) hoặc từ nấm sợi nhƣ (Penicillium spp., Aspergillus spp., Rhizopus spp.,
Rhizomucor spp., Mucor spp. or Candida spp…). Enzym lipase từ động vật có tính đặc hiệu
cao trong việc giải phóng các acid béo ở vị trí số 1 và số 3 trong phân tử triglyceride, trong
khi đó các lipase từ nguồn vi sinh vật có khả năng hoạt động và tính đặc hiệu rộng hơn [5].
7.5
Geobacillus sp.
70
9.0
Pseudomonas sp.
65
9.6
Pseudomonas sp.
90
11.0
Pyrobaculum calidifontis
90
-
Pyrococcus furiosus
100
-
Pyrococcus horikoshii
97
5.6
Pyrococcus horikoshii
95
7.0
2.1.2.3. Các phƣơng pháp cố định enzym lipase
Phương pháp hấp phụ vật lí
Đây là phƣơng pháp đơn giản nhất liên quan đến sự tƣơng tác bề mặt thuận nghịch
giữa enzym và chất mang. Lực liên kết chủ yếu là các tƣơng tác kỵ nƣớc. Phƣơng pháp này
có ƣu điểm là chi phí thấp, quá trình thực hiện đơn giản và nhanh chóng; không có sự biến
đổi về mặt hóa học enzym cũng nhƣ chất mang, đây là sự cố đinh thuận nghịch. Nhƣợc điểm
của phƣơng pháp này là sự giải hấp enzym ra khỏi chất mang, sự cản trở về mặt không gian
Nhóm carboxyl của -PGA (Poly(-glutamic acid)) đƣợc hoạt hóa bằng cách phản ứng
với carbodiimide (N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC). -
PGA sau khi đƣợc hoạt hóa sẽ đƣợc cho vào dung dịch đệm có chứa lipase tự do. Việc cố
định enzym lipase từ C. rugosa đƣợc thực hiện ở các thời gian và nhiệt độ khác nhau. Sau
giai đoạn này enzym lipase cố định đƣợc làm lạnh khô trong máy sấy thăng hoa sau đó rửa lại
vài lần bằng n-hexan. Điều kiện cố định tối ƣu đạt đƣợc ở nhiệt độ 13,3
o
C trong thời gian
2,3h và hoạt tính cao nhất đạt đƣợc là 1196 U/g-chất mang [9].
Lipase từ Candida Antarctica cũng đƣợc cố định trên agarose và chitosan, sử dụng
các chất hoạt hóa glycidol, glutaraldehyde và epichlorohydrin. Khi dùng chất mang là
agarose với chất hoạt hóa glycidol đạt đƣợc hoạt tính cao nhất là 845U/g gel trong sau 72h cố
định. Khi sử dung chất mang là agarose và chitosan với chất hoạt hóa là glutaraldehyde thì
hoạt tính cao nhất đạt đƣợc tƣơng ứng là 1209U/g gel và 2716U/g gel sau 5h cố định. Sự ổn
định nhiệt tăng đáng kể khi so sánh với enzym hòa tan, gấp 20 lần khi sử dụng agarose-
glyoxyl và gấp 18 lần khi sử dụng chitosan-glutaraldehyde và gấp 21 lần khi sử dụng
agarose-glutaraldehyde. Dẫn xuất tốt nhất có độ ổn định gấp 58 lần so với enzym tự do, thu
đƣợc khi cố định trên chitosan đƣợc hoạt hóa qua 2 bƣớc, sử dụng glycidol và
glutaraldehyde, thời gian cố định là 72h. Mức độ ổn định của dẫn xuất cố định tăng lên theo
thời gian cố định, điều này cho thấy liên kết cộng hóa trị đa điểm giữa chất mang và enzym
đã thực sự xảy ra [10].
Copyright: Tài liệu đại học ©