6

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HƯƠNG
NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VÀ ỨNG DỤNG TRONG LÊN
MEN ETANOL TỪ RỈ ĐƯỜNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP LIÊN TỤC LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Hà Nội – Năm 2014

1

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Những kết quả trình bày trong luận án
này chưa được một tác giả nào khác công bố

Nghiên cứu sinh
Nguyễn Thị Hương
2

MỤC LỤC
NỘI DUNG Trang
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Một số nét chấm phá về cồn etylic
1.1.1. Định nghĩa
1.1.2.Sơ đồ quy trình sản xuất etylic từ rỉ đường
1.1.3.Yêu cầu chất lượng và các vấn đề về nấm men trong sản xuất cồn etylic
1.1.4. Rỉ đường dùng để sản xuất cồn etylic.
1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cồn trên thế giới và Việt Nam
1.3. Vấn đề cố định nấm men trên giá thể và các phương pháp cố định
1.3.1. Định nghĩa về cố định tế bào
1.3.2. Các phương pháp cố định tế bào nấm men
1.3.3. Các kỹ thuật cố định tế bào
1.3.4. Chất mang alginate
1.3.5. Một số chất mang khác
1.4. Các phương pháp lên men và một số yếu tố ảnh hưởng đến qúa trình lên
men
1.4.1. Phương pháp lên men gián đoạn
1.4.2. Phương pháp lên men bán liên tục
1.4.3. Phương pháp lên men liên tục
1.5. Tình hình nghiên cứu về công nghệ sản xuất cồn trên thế giới và ở
Việt nam
1.5.1.Tình hình nghiên cứu về công nghệ sản xuất cồn trên thế giới

46

46
49
52
52
52
52
52
4 2.1.4. Môi trường nuôi cấy
2.2.Thiết bị và phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết bị
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3. Phân tích
2.2.3.1. Quan sát trạng thái nấm men
2.2.3.2. Xác định tế bào nấm men nhờ buồng đếm Thomas
2.2.3.3. Xác định lượng tế bào sống
2.2.3.4. Xác định số lượng tế bào sống, chết
2.2.3.5. Xác định pH
2.2.3.6. Xác định hàm lượng chất khô
2.2.3.7. Xác định nồng độ cồn
2.2.3.8. Xác định mật độ tế bào nấm men bằng máy so màu
2.2.3.9. Xác định lượng vi khuẩn hiếu khí có trong dịch lên men
2.2.3.10. Phân tích đường khử theo phương pháp Graxianop

57
57
58
58
58
58
58
58
59
59
59
61
61 61
62

65

71
71
73 5


Danh mục các công trình đã công bố
Tài liệu tham khảo
80

80
82

84
86
88

88
91
93

95

95
96
98

106
107
107

108

115
117


NỘI DUNG Trang
Bảng 1.1. Sản xuất ethanol trên thế giới 23
Bảng 1.2. Tiêu thụ ethanol cho nhiên liệu của thế giới 23
Bảng 1.3.ứng dụng của nấm men cố định 30
Bảng 1.4. Năng suất sinh cồn trong quá trình lên men dịch nho 49
Bảng 2.1. Môi trường nhân giống sinh khối, lên men, môi trường hoạt hoá tế bào
cố định trong hạt gel
52
Bảng 3.1. Thành phần hoá học và mức độ nhiễm tạp vi sinh vật của 4 loại rỉ
đường
62
Bảng 3.2. Khả năng lên men của các chủng nấm men 63
Bảng 3.3. Năng lực lên men của các chủng nấm men trong điều kiện cố định tế
bào.
64
Bảng 3.4. Sự sinh trưởng của chủng CNTP 7028 trên các nguồn ni tơ khác nhau 66
Bảng 3.5. ảnh hưởng của các loại chất mang đến quá trình lên men 72
Bảng 3.6. ảnh hưởng của chất mang đến khả năng lên men 72
Bảng 3.7. ảnh hưởng của nồng độ Na- Alginate đến quá trình lên men 73
Bảng 3.8. ảnh hưởng của nồng độ Na- Alginate đến các chỉ tiêu của dịch sau lên
men
74
Bảng 3.9. ảnh hưởng của nồng độ dung dịch tạo gel đến quá trình lên men 75
Bảng 3.10. ảnh hưởng của nồng độ dung dịch tạo gel đến các chỉ tiêu dịch sau lên
men
75
Bảng 3.11. ảnh hưởng của tỷ lệ giống nấm men đến quá trình lên men 76
Bảng 3.12. ảnh hưởng của tỷ lệ giống nấm men đưa vào dung dịch chất mang đến
chỉ tiêu của dịch sau lên men
77

87
Bảng 3.27. Khả năng lên men của tế bào cố định trong quá trình lên men liên tục
(tỷ lệ giữa hạt tế bào cố định: thể tích dịch lên men là 30% w/v)
88
Bảng 3.28. Khả năng lên men của tế bào cố định trong quá trình lên men liên tục
(tỷ lệ giữa hạt tế bào cố định: thể tích dịch lên men là 40% w/v)
89
Bảng 3.29. Khả năng lên men của tế bào cố định trong quá trình lên men liên tục
(tỷ lệ giữa hạt tế bào cố định: thể tích dịch lên men là 50% w/v)
89
Bảng 3.30. Khả năng lên men của tế bào nấm men cố định trong quá trình lên
men liên tục
90
Bảng 3.31. Khả năng lên men của tế bào nấm men cố định trong quá trình lên
men liên tục
92
Bảng 3.32. ảnh hưởng của thời điểm hoạt hoá đến khả năng lên men của hạt tế
bào nấm men cố định
96
Bảng 3.33. ảnh hưởng của dung dịch rửa hạt đến quá trình lên men trong hệ thống
lên men liên tục
97
Bảng 3.34. ảnh hưởng của nguồn ni tơ trong dịch hoạt hoá đến khả năng lên men
của hạt tế bào nấm men cố định.
98
Bảng 3.35. ảnh hưởng của nguồn ni tơ bổ sung vào dịch hoạt hoá đển tốc độ sinh
CO2 trong bình engol của hạt tế bào nấm men cố định
100
Bảng 3.36. ảnh hưởng của nồng độ ure đến khả năng lên men của hạt tế bào nấm
men cố định

2
trong bình engol
của hạt tế bào nấm men cố định
104
Bảng 3.42. ảnh hưởng của phương pháp hoạt hoá tới tốc độ sinh CO
2
trong bình
engol của hạt tế bào nấm men cố định
105
Bảng 3.43. ảnh hưởng của phương pháp hoạt hoá tới quá trình lên men của hạt tế
bào nấm men cố định
106
Bảng 3.44. Danh mục thiết bị trong mô hình thiết bị lên men liên tục qui mô 500
lit ethanol/ngày
108
Bảng 3.45. Kết quả theo dõi quá trình lên men liên tục trong hệ thống thiết bị
1200 lít (mẻ 1)
110
Bảng 3.46. Kết quả theo dõi quá trình lên men liên tục trong hệ thống thiết bị
1200 lít (mẻ 2)
111
Bảng 3.47. Kết quả theo dõi quá trình lên men liên tục trong hệ thống thiết bị
1200 lít (mẻ 3)
112
Bảng 3.48. Kết quả phân tích một số thành phần của cồn được sản xuất từ rỉ
đường theo quy trình công nghệ lên men liên tục nhờ cố định tế bào
Bảng 3.49. Đánh giá hiệu quả kinh tế của hai phương pháp lên men
114

115

Hình 1.6: Cấu trúc của alginate
Hình 1.7. Mô hình tạo gel dạng vi trứng của alginate canxi
Hình 1.8. Sự liên kết của ion Ca
2+
với các gốc guluronic
Hình 1.9. Quy trình tạo hạt gel ca-alginate
Hình 1.10: Cấu trúc của xanthan gum
Hình 1.11: Cấu trúc của carrageenan
Hình 2.1. Sơ đồ tạo hạt tế bào cố định
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí hệ thống lên men liên tục
Hình 2.3. Bộ cất cồn ở phòng thí nghiệm
Hình 3.1. ảnh hưởng của nồng độ glucoza tới khả năng tạo sinh khối của
chủng CNTP7028
Hình 3.2. ảnh hưởng của nồng độ (NH
4
)
2
SO
4
đến khả năng tạo sinh khối của
chủng CNTP 7028
Hình 3.3. ảnh hưởng của nồng độ MgSO
4
.7H
2
O đến khả năng tạo sinh khối
của chủng CNTP 7028
Hình 3.4. ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men tới sư sinh trưởng của chủng
CNTP7028
Hình 3.5. ảnh hưởng của nồng độ K


67

67

68

69

69
70
71
91

93
11hệ thống lên men liên tục
Hình 3.12. Nồng độ cồn thu đựoc trong hệ thống lên men liên tục theo thời
gian lên men
Hình 3.13. Hình ảnh tế bào nấm men trong hạt gel canxi alginate trong một
chu kỳ lên men
Hình 3.14. Sự phát triển của tế bào nấm men Sacchromyces cerevisiae CNTP
7028 trong hạt gel đựơc chụp trên kính hiển vi điện tử quét
Hình 3.15. Thời gian sinh CO
2
12
MỞ ĐẦU
Ethanol (rượu cồn) chiếm một vị trí khá quan trọng trong công nghiệp thực phẩm nói
riêng và các ngành kinh tế nói chung. Ngoài công dụng làm đồ uống, ethanol còn được dùng
làm nguyên liệu cho một số ngành công nghiệp khác như: làm dung môi hữu cơ, nhiên liệu,
dùng trong y tế, trong mỹ phẩm pha nước hoa, trong dược phẩm để trích ly các hoạt chất sinh
học, sản xuất axit axetic và giấm ăn, sản xuất các loại este có mùi thơm, trong cao su tổng hợp
và nhiều hợp chất khác v.v… Đặc biệt trong bối cảnh nguồn nhiên liệu hóa thạch đang ngày
càng cạn kiệt thì ethanol được coi như nguồn nhiên liệu sinh học thay thế đầy hứa hẹn.
Việt Nam nằm ở vùng khí hậu nhiệt đới, thích hợp cho việc trồng mía tạo thuận lợi
cho công nghiệp mía đường phát triển. Cùng với sản phẩm chính là đường kính, hàng năm các
nhà máy đường thải ra khoảng 600.000 - 700.000 tấn rỉ đường [17]. Đây là nguồn nguyên liệu
dồi dào để cung cấp cho ngành công nghiệp lên men, đặc biệt là công nghiệp sản xuất rượu
cồn. Theo báo cáo công tác tháng 9 năm 2013 của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn
ngày 04/10/2013 số 3580/BC-BNN-VP thì tổng diện tích cây công nghiệp ngắn ngày tính đến
trung tuần tháng 9 đạt 565,5 ngàn ha, bằng 97,3% so với cùng kỳ năm trước và trong đó mía

biệt nó chưa được nghiên cứu trên đối tượng lên men cồn từ rỉ đường. Việc kết hợp giữa cố định tế
bào và quá trình lên men liên tục trong sản xuất cồn là hướng đi mới, có nhiều triển vọng và áp
dụng vào thực tiễn sản xuất để giúp nâng cao năng suất và giảm chi phí sản xuất cồn từ rỉ đường.
Với những ý nghĩa đó chúng tôi đã thực hiện đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu cố định tế bào
và ứng dụng trong lên men etanol từ rỉ đường bằng phương pháp liên tục”.
Mục tiêu cần đạt của đề tài là:
1. Xác định được công nghệ thích hợp tạo giá thể để cố định tế bào nấm men và các
điều kiện thích hợp lên men dịch rỉ đường bằng nấm men cố định.
2. Xác định được các thông số công nghệ cơ bản của quá trình lên men liên tục, sử
dụng nấm men cố định.
3. Xây dựng mô hình và sản xuất thử nghiệm cồn etylic bằng phương pháp lên men
liên tục nhờ tế bào cố định trên mô hình thiết bị.
Để đạt được các mục tiêu trên, đề tài cần nghiên cứu các nội dung:
1. Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men bằng phương pháp cố
định tế bào trên môi trường rỉ đường để đạt hiệu suất lên men cao
- Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men tốt trên môi trường rỉ đường từ các
chủng nấm men có trong sưu tập giống công nghiệp của Viện CNTP.
- Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men tốt trong điều kiện bị nhốt trong
lớp chất mang từ các chủng đã được chọn ở trên.
- Lựa chọn nguồn nguyên liệu rỉ đường.
2. Nghiên cứu quy trình công nghệ cố định tế bào
- Khảo sát ảnh hưởng của một số loại chất mang đến quá trình cố định tế bào.
- Nghiên cứu phối hợp sử dụng các chất mang khác nhau để đạt hiệu quả cố định và
lên men tốt.
- Lựa chọn nồng độ chất mang.
- Nồng độ dung dịch tạo gel cho độ bền cơ học của hạt tế bào cố định cao.
- Lựa chọn tỷ lệ giống thích hợp trong chất mang cho khả năng giữ tế bào và độ bền
cơ học cao nhất.
- Lựa chọn tốc độ dòng chảy tạo hạt tế bào cố định .


cho quy mô sản xuất 500 lít ethanol/ngày.
- Thử nghiệm lên men liên tục ở qui mô pilot .
- Đánh giá hiệu quả kinh tế.
15
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Một số nét chấm phá về cồn etylic
1.1.1. Định nghĩa ethanol
Ethanol là chất lỏng trong suốt, có công thức phân tử là C
2
H
5
OH, phân tử gam
46,07g/mol, khối lượng riêng (0,789g/cm
3

), điểm sôi (78.4
0
C), điểm bắt lửa ( 13
0
C),
nhiệt độ tự cháy (425
0
C) [17]. Ethanol tan vô hạn trong nước, tan trong ete và


Hình 1.1. Quy trình sản xuất cồn etylic từ rỉ đường

Rỉ đường (chất khô :80-85%)
chs

Pha loãng (đến chất khô 53-54%)
Cặn
Nhân men giống
Lên men
Cồn etylic>=96%v
Xử lý rỉ đường (loại bỏ chất keo, diệt
vi sinh vật)
Axit hóa hoặc gia nhiệt
Chưng cất
Tách cặn
Rỉ đường sạch cặn
Pha loãng đến nồng độ
nhân men giống (12-
15% ch
ất khô)

Pha loãng đến nồng độ lên
men (24-25% chất khô)


18- Kích thước tế bào nấm men cũng khác nhau và phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy, dao
động trong khoảng 2,5-10 m chiều rộng và 5-50 m chiều dài. Tế bào có hình dạng hình
oval là chủ yếu ( Hình 1.2.a) nên đễ cố định trong chất mang. Ngoài ra nó thuộc tế bào
eucariote ( Hình 1.2.b) tế bào nhân thực hay có nhân, nhân được bao bọc bởi màng nhân nên
tính ổn định đặc tính di truyền trong thời gian dài thực hiện lên men liên tục bằng có định tế
bào hiệu quả hơn. Sinh sản bằng phương pháp nẩy chồi trong thời gian 90-120 phút để tạo
thành tế bào mới. Tế bào mới có thể dính vào tế bào mẹ hay tách khỏi tế bào mẹ ( Hình 1.2.b;
1.2.c và 1.2.d ).
- Có hoạt tính tạo cồn cao.
- Nấm men dùng trong sản xuất cồn etylic ngoài khả năng biến đường thành rượu và khí
CO
2
còn có khả năng lên men các đường nhanh và càng triệt để càng tốt. Chịu được sự biến
đổi của môi trường trong điều kiện nhiệt độ, pH, nồng độ đường, đặc biệt chịu được nồng độ
ethanol cao.
* Đặc điểm của quá trình lên men ethanol
- Dịch đường lên men đục.
- Nhiều cặn lơ lửng - ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm.
- Lên men ở nhiệt độ cao.
Sau một chu kỳ lên men thì nấm men ít kết lắng, tỷ lệ tế bào chết nhiều, dẫn đến tốc độ thoái
hoá nhanh, dịch huyền phù có nấm men kết lắng cũng không sạch. Vì vậy trong sản xuất
ethanol không thể tái sử dụng nấm men của mẻ trước cho lên men mẻ sau. Lên men mẻ nào
thì phải nhân giống cho các mẻ đấy, không tái sử dụng được – đó chính là sự bất lợi của lên
men cổ điển. Nó có nhiều rủi ro:
- Nếu mẻ lên men nào bị nhiễm khuẩn - cả dây chuyền bị nhiễm
- Hiệu quả thấp, tiêu tốn nhiên liệu và nhân công lao động

Hợp chất hữu cơ gồm các chất chứa nitơ, cacbon, oxy và hydro. Hợp chất hữu cơ chứa
nitơ phần lớn là ở dạng amin như glutamic, lơxin, alanin v.v…Lượng nitơ trong rỉ đường mía
chỉ khoảng 0,5 đến 1%, ít hơn so với rỉ đường củ cải (1,2 – 2,2%). Do chứa ít nitơ nên khi lên
men dịch rỉ đường chúng ta phải bổ xung nguồn nitơ từ ure hoặc amoni sunfat[11], [17].
Chất hữu cơ không chứa ni tơ gồm có pectin, chất nhầy furfurol và oxymetyl furfurol, axit
v.v…Ngoài ra còn chứa các chất khử nhưng không lên men được như caramen, chất màu.
+Các hợp chất màu: rỉ đường thường có mầu nâu sẫm hay nâu đen, chủ yếu là do
hỗn hợp các chất mầu tạo thành.
+ Hợp chất caramen: tạo thành do sự mất nước của đường saccaroza dưới tác
dụng của nhiệt độ. Khi pH không đổi thì cường độ mầu tỉ lệ thuận với nhiệt độ và thời gian
đun nóng.
+ Phức chất phenol-Fe
+2
: có mầu vàng xanh và không thể loại hết ở giai đoạn làm
sạch nước mía và đi vào rỉ đường.
+ Melannoidin: là sản phẩm ngưng tụ của đường khử với axit amin là chủ yếu là
axit asparagin.
+ Mêlanin: là sản phẩm oxi hoá khử các axitamin ở dạng vòng có trong rỉ đường
dưới sự xúc tác của enzim polyphenoloxydaza khi có mặt của oxy và Cu
2+
, chủ yếu là tyrozin.
20 + Chất keo: chủ yếu là các chất pectin, chất sáp, chất nhờn. Các chất này có ảnh
hưởng xấu tới nấm men vì nó tạo màng nhầy bao bọc quanh tế bào ngăn cản quá trình hấp thụ
chất dinh dưỡng, làm giảm hoạt tính sinh học, ức chế quá trình lên men, hạn chế tạo sinh khối.

2
SO
4
cho vào phụ thuộc vào phương pháp xử lý có gia
nhiệt hay không gia nhiệt và phụ thuộc pH của rỉ đường. Khi bổ sung axit H
2
SO
4
vào dưới tác
21dụng của nhiệt thì một số axit bay hơi thoát ra làm một vài chất độc đối với nấm men cũng bị
oxi hoá [12], [17].
Ví dụ:
CaSO
3
+ H
2
SO
4
 CaSO
4
+ H
2
O + SO
2

đậm đặc (d=1,84)/1 tấn rỉ đường tới pH=4,5. Sau
đó bổ xung amonisunphat và supephotphat khuấy đều trong 30 phút và để lắng từ 6-12 giờ
cho tới khi rỉ đường trong hoàn toàn. Tách cặn lấy phần trong đem pha loãng tới nồng độ gây
men và lên men.
 Xử lý với axit gia nhiệt:
Tiến hành: rỉ đường được pha loãng giống phương pháp xử lý bằng axit không gia nhiệt
và chỉnh tới pH = 4,5. Sau đó dùng hơi nước sục trực tiếp vào tới nhiệt độ 85-90
O
C giữ trong
0,5-1h sau đó để lắng từ 2-4h rồi tắch cặn và đem pha loãng tới nồng độ gây men và lên men
[17].
b. Phương pháp xử lý rỉ đường bằng hợp chất polyme
Các chất rắn trong rỉ đường tồn tại ở trạng thái keo nên chúng nằm lơ lửng trong dịch
đường. Để kết lắng được các hạt keo này thì phải phá vỡ trạng thái ổn định của hệ bằng cách
phá vỡ lớp điện tích bảo vệ hạt keo. Khi đó các hạt keo sẽ tự kết hợp lại với nhau đến khi khối
lượng tăng dần và lắng xuống.
Bản chất hoá học của polyme kết lắng là các copolin của acrylamit, được chúng chia
làm 3 nhóm điện tích: cationic, anionic và nonionic
Hiện nay có rất nhiều loại polyme nhưng chỉ có polyme mang diện tích dương mới có
khả năng kết lắng các tạp chất trong rỉ đường. Polyme mang diện tích dương thấp có khả năng
kết lắng rỉ đường triệt để, thời gian kết lắng nhanh, dễ lắng cặn, không qua thiết bị lọc. Ở Việt
Nam hiện nay thường dùng hai loại polyme mang diện tích dương thấp là C510H và C300 của
hãng ARON Nhật bản trong hai loại này thì C510H có khả năng kết lắng tốt hơn.
c. Phương xử lý rỉ đường bằng cơ học
22
đối ethanol nhiên liệu ở Mỹ. Mỹ đã vượt Braxin và là nước sản xuất ethanol lớn nhất trên thế
giới hiện nay. Năm 2009, sản lượng ethanol lên tới 25,9 tỷ lít [7], [29], [66], [82].
Trung Quốc là quốc gia sản xuất và sử dụng cồn nhiên liệu lớn thứ 3 sau Braxin và
Mỹ. Năm 2004, nước này đã đưa vào hoạt động nhà máy sản xuất cồn lớn nhất thế giới với
công suất 600.000 tấn/năm tại Cát Lâm (mỗi năm tiêu thụ 1,9 triệu tấn ngô làm nguyên liệu),
23tăng lượng cồn ethanol cả nước trên 3,5 tỷ lít. Gần nước ta nhất là Thái Lan, một nước đã có
chính sách sản xuất nhiên liệu sinh học từ 10 năm nay. Từ năm 2002, Thái Lan đã xây dựng
thêm 4 nhà máy sản xuất cồn nhằm giảm chi phí nhập khẩu xăng dầu. Năm 2004, Thái Lan đã
sản xuất trên 280.000 m
3
cồn, đầu tư thêm 20 nhà máy để năm 2015 có trên 2,5 tỷ lít cồn
dùng làm nhiên liệu [7], [99], [100], [105].
Bảng 1.1 Sản xuất ethanol trên thế giới (tr.lít)
Nước/Khu vực 2009-2011 2012
Mỹ 47.167 82.610
Braxin 25.331 51.305
Trung Quốc 8.094 10.008
EU 6.424 15.747
Ấn Độ 1.796 4.194
Thái Lan 777 2.102
Việt Nam 209 493
Nguồn: OECD/FAO Agriculture Outlook, 2012
Bảng 1.2 Tiêu thụ ethanol cho nhiên liệu của Thế giới (tr.lít)
Nội dung 2009-2011 2012