BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHỊ ĐỊNH THƯ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH
SINH HỌC DÙNG TRONG NÔNG NGHIỆP
BẰNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRÊN TẾ BÀO
CÂY THÔNG (Larich desidue) VÀ BÈO TẤM (Lemna
sp wolffia sp) Chủ nhiệm đề tài: LÊ HUY HÀM


1.4.1. Bệnh Gumboro ở gia cầm 25
1.4.2. Chiến lược nghiên cứu và thử nghiệm ứng dụng vaccine thế hệ mới 26
1.4.3. Gen kháng nguyên VP2 trong chiến lược phát triển vaccine thế hệ mới 27
1.5. Nghiên cứ
u sản xuất vaccin qua đường miệng 29
1.6. Tình hình nghiên cứu trong nước 30
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
2.1. Mục tiêu của đề tài 32
2.2. Nội dung nghiên cứu cần thực hiện 32
2.3. Vật liệu 33
2.3.1. Vật liệu thực vật 33
2.3.2. Vật liệu vi khuẩn 33
2.3.3. Hoá chất 35
2. 4. Phương pháp 35
2.4.1. Phương pháp thiết kế vector biểu hiện ở thực vật 35
2.4.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế
bào 44
2.4.3. Phương pháp biến nạp gen 45
2.4.4. Phương pháp đánh giá cây chuyển gen 49
2.4.5. Thử nghiệm khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên gà 57
CHƯƠNG3:NHỮNG NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐÃ THỰC HIỆN 58
1.
THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN Ở THỰC VẬT 58
1.1. Kết quả khuyếch đại gen mã hoá protein của virus VP2 bằng phương pháp PCR 58
1.2. Kết quả tạo dòng gen mã hoá protein VP2 của virus Gumboro 58
1.2.1. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vectơ pCR
đ
2.1 58
1.2.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli chủng InV
α

gây chết bèo tấm Woffia australiana 90
3.2. Xây dựng qui trình chuyển gen đạt hiệu quả cao vào bèo tấm Lemna 92
3.2.1. Xây dựng quy trình chuyển gen nguyên cây và callus sử dụng vi khuẩn
Agrobacterium tumerfaciens 92
3.2.2. Xây d
ựng quy trình chuyển gen nguyên cây và callus sử dụng súng bắn gen 99
4. CHUYỂN GEN VỎ VIRUS GUMBORO VÀO WOLFFIA/LEMNA 104
4.1. Chuyển gen vỏ virus Gumboro vào Wolffia australiana 104
4.2. Chuyển gen vỏ virus Gumboro vào Lemna 106
4.2.1. Chuyển gen nguyên cây bèo LA 106
4.2.2. Tạo callus và vật liệu chuyển gen 107
4.2.3 Chuyển gen VP2 vào callus dạng I và dạng II 108
5. PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CÂY CHUYỂN GEN 109
THỬ NGHIỆM SẢN PHẨM CHUYỂN GEN TRÊN GIA CẦM 109
5.1. Phân tích đánh giá cây chuyển gen 109
5.1.1. Đánh giá biểu hiện gen gus trong các dòng bèo tấm chuyển gen 110
5.1.2. Tách chiết và kiểm tra ADN tổng số của bèo tấm 111
5.1.3. Phân tích PCR các dòng bèo tấm chuyển gen VP2 111
5.1.4. Phân tích lai Southern 113
5.1.5. Xác định protein trong bèo tấm chuyển gen 113
5.2. Thử nghiệm sản phẩm chuyển gen trên gia cầm 116
5.2.1. Thu mẫu huyết thanh gà 116
5.2.2. Phát hiện kháng thể kháng protein VP2 bằng ELISA 117
CHƯƠNG 4: TỔNG QUÁT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC 121
4.1. Dạng sản phẩm kết quả tạo ra 121
4.2. Kết quả về khoa học 121
4.3. Kết quả nổi bật và khả năng áp dụng 122
4.4. Trình độ công nghệ 122
4.5. Khả năng áp dụng 123
4.6. Nhu cầu kinh tế, xã hội và

Hỡnh 2.4: Vector nh phõn pCAMBIA1301 34
Hỡnh 2.5: Cu trỳc Vector pPAM-VP2 34
Hỡnh 3.1. Kt qu
sn phm PCR 58
Hỡnh 3.2. Kt qu bin np gen mó hoỏ protein VP2 vo InV F
59
Hỡnh 3.3. Kt qu tỏch chit ADN plasmid 60
Hỡnh 3.4. Kt qu kim tra cỏc dũng ADN plasmid sau khi x lớ bng EcoRI 61
Hỡnh 3. 5. Trỡnh t nucleotit ca on ADN tỏch dũng mang gen VP2 63
Hỡnh 3.6. Phõn ct gen VP2 v vect pPAMksGFP vi enzym ct gii hn. 64
Hỡnh 3.7. Thit k plasmid pPAM- VP2 65
Hỡnh 3.8. Xỏc nh s cú mt ca gen VP2 trong chng Agrocaterium GV3101pMp90 65
Hỡnh 3.9. Mt s hỡnh nh bốo tm LA tỏi sinh sau kh trựng 70
Hỡnh 3.10. Bốo nhõn trờn mụi trng H/5 + 1,5% sucrose, pH=6,0 74
Hỡnh 3.11. Callus to c trờn nn N6/2 vi k
t hp 2,4D +BAP 75
Hỡnh 3.12. Mụ callus dng II 76
Hỡnh 3.13. To callus dng I t callus dng II 81
Hỡnh 3.14. Nhõn callus dng I trờn mụi trng cú 2,0 mg/l 2,4D + 6,0 mg/l BAP 82
Hỡnh 3.15. Tỏi sinh cõy t callus dng II 82
Hỡnh 3.16. Bốo tỏi sinh t callus dng I trờn mụi trng khụng cú cht HST 83
Hỡnh 3.17. Tỏi sinh bốo t callus dng I 85
Hỡnh 3.18. Kt qu thớ nghim th chng VK W. australiana 87
Hỡnh 3.19. Xỏc nh thi gian ly tõm chõn khụng thớch hp 87
Hỡnh 3.20: nh hng ca mt VK v thi gian ng nuụi cy 88
Hỡnh 3.21: Kt qu thi nghim thi gian ng nuụi cy v m
t VK ln 2 89
Hỡnh 3.22: ỏnh giỏ nh hng ca mụi trng ng nuụi cy 90
Hỡnh 3.23: nh hng ca geneticin n kh nng sng ca W. australiana 91
Hỡnh 3.24: nh hng ca Paramomycin n kh nng sng ca W. australiana 92

8
Bng 2.1. Trỡnh t cỏc on mi s dng trong nghiờn cu
51
Bng 3.1: nh hng ca hm lng khoỏng khỏc nhau n kh nng sinh trng ca W. australiana
66
Bng 3.2: Nghiờn cu kh nng sinh trng v phỏt trin ca W. australiana trong cỏc iu kin nuụi
khỏc nhau
67
Bng 3.3: nh hng ca pH n sinh trng ca W. australiana
68
Bng 3.4: To ngun vt liu khi u in vitro
69
Bng 3.5. Hiu qu kh trựng ca cỏc loi hoỏ cht khỏc nhau 70
Bng 3.6. nh hng ca hm lng khoỏng Hutner ti s cỏnh bốo nhõn sau mi ngy nuụi cy 71
Bng 3.7. nh hng ca pH mụi trng nuụi ti s cỏnh bốo nhõn sau mi ngy nuụi cy 72
Bng 3.8. nh hng ca sucrose ti s cỏnh bốo nhõn sau mi ngy nuụi cy 73
Bng 3.9. nh hng ca cỏc nn khoỏng v cht i
u ho sinh trng khỏc nhau n s to callus 75
Bng 3.10. nh hng ca hm lng khoỏng trong mụi trng N6 n hiu qu to callus 76
Bng 3.11. nh hng ca 2,4D v BAP n hiu qu to callus (%) 77
Bng 3.12. nh hng ca hm lng ng (g/l) n t l to callus 78
Bng 3.13. nh hng ca hm lng CH n s hỡnh thnh callus 79
Bng 3.14. Kt qu to callus trờn cỏc mụi trng cú pH khỏc nhau 79
Bng 3.15. Kt qu
to callus dng I t dng II 80
Bng 3.16. nh hng ca cỏc cht iu ho sinh trng n cht lng callus 81
Bng 3.17. Kt qu tỏi sinh callus dng II 82
Bng 3.18. Hiu qu tỏi sinh cỏc cụng thc cú hm lng BAP khỏc nhau 83
Bng 3.19. nh hng ca IAA v kinetin ti kh nng tỏi sinh cỏnh bốo 84
Bng 3.20. nh hng ca CH ti kh nng tỏi sinh cõy bốo t callus 85

B
ng 3.40. nh hng ca x lý ỏp sut thm thu n biu hin gen gus tm thi bốo nguyờn cõy 102
Bng 3.41. nh hng ca x lý ỏp sut thm thu n biu hin gen gus tm thi callus 102
Bng 3.42. nh hng hm lng ht vng n biu hin tm thi ca gen gus bốo nguyờn cõy 103
Bng 3.43. nh hng hm lng ht vng n biu hin tm th
i ca gen gus callus 103
Bng 3.44. Tng hp cỏc thớ nghim chuyn gen VP2 vo bốo tm Wolffia australiana 105
Bng 3.45. Tng hp cỏc thớ nghim chuyn gen VP2 vo bốo tm L.aequinoctialis 106
Bng 3.46: Tng hp cỏc thớ nghim chuyn gen ch th vo bốo tm LA v W. australiana 110
Bng 3.47. Xỏc nh protein tng s trong dch chit bốo tm chuyn gen 114
Bng 3.48. Kt qu phõn tớch ELISA 6 dũng bốo tm chuyn gen VP2 115
Bng 3.49. Danh sỏch cỏc mu huyt thanh g thu c 116
Bng 3.50: Kt qu xột nghi
m ELISA trờn cỏc mu huyt thanh g ó c gõy ỏp ng min dch 117
Bng 3.51: Kt qu xột nghim ELISA dng tớnh ca cỏc mu huyt thanh g ó c gõy ỏp ng
min dch
118
Bng 3.52: ỏnh giỏ mc to khỏng th khỏng protein VP2 trong cỏc mu huyt thanh ca g n bốo
tm chuyn gen
119
.

1
DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA ĐỀ TÀI

TT Họ và tên Cơ quan công tác
A
Chủ nhiệm đề tài
PGS.TS. Lê Huy Hàm
Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ

2
BÀI TÓM TẮT
Hiện nay số lượng các tác nhân gây bệnh cho người và gia súc gia cầm ngày càng
tăng, hiện tượng nhờn thuốc đối với các tác nhân gây bệnh cũ bắt buộc con người phải
ưu tiên quan tâm trước hết đến các phương pháp phòng bệnh. Việc phòng bệnh bằng
vaccine đã trở thành hoạt động quan trọng và là mục tiêu hàng đầu của ngành y tế và
thú y của các nước. Đối với lĩnh vực chăn nuôi gia súc, gia cầm, do giá thành vaccine
cao, ngành chăn nuôi tại các nướ
c đang phát triển gặp nhiều rủi ro hơn nhiều so với các
nước phát triển. Vì vậy, việc tìm ra phương pháp sản xuất vaccine mới, với giá thành
hạ là một trong những tìm kiếm sôi động trên thế giới những năm gần đây.
Các nghiên cứu trong thập niên vừa qua đã cho thấy tiềm năng ứng dụng của
vaccine uống sản xuất thông qua hệ thống thực vật chuyển gen là rất lớn, không nh
ững
góp phần giảm giá thành vaccine mà còn mở ra những triển vọng mới của việc ứng
dụng CNSH thực vật trong nông nghiệp và y học. Trong các loài thực vật được nghiên
cứu để sử dụng làm hệ thống sản xuất vaccine, các loài họ bèo tấm (Lemnaceae) đang
được đặc biệt chú ý bởi các đặc tính sau: có tốc độ nhân vô tính rất nhanh, có hàm
lượng các chất dinh dưỡng cao, rất dễ nuôi trồng, không cần các điều kiệ
n đặc biệt như:
bảo quản lạnh, chế độ vô trùng Do các đặc điểm trên, việc nghiên cứu sản xuất
vaccine bằng các đối tượng này là hết sức hấp dẫn và hứa hẹn nhiều triển vọng.
Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nông nghiệp
bằng kỹ thuật di truyền trên tế bào cây thông (Larich desidue) và bèo tấm (Lemna sp/
Wolffia sp.)“, được thực hiện trên cơ sở hợp tác khoa họ
c với Viện Sinh lý phân tử và
Công nghệ sinh học, ĐHTH Bonn (CHLB Đức) là một trong những cố gắng góp phần
giải quyết các vấn đề trên để tiến tới ứng dụng thành công kỹ thuật di truyền vào việc
sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ chăn nuôi thú y và bảo vệ sức khoẻ
con người.

bằng các phương pháp sinh học phân tử (PCR, Southern). Đã nhận được 06 dòng
bèo tấm Wolffia australiana chuyển gen VP2. Protein VP2 đã được tách chiết từ
các dòng bèo tấm chuyển gen. Thử nghiệm bước đầu cho thấy 01 dòng bèo tấm
chuyển gen có khả n
ăng gây đáp ứng miễn dịch trên gà.
Phía đối tác (CHLB Đức) Viện Sinh lý phân tử và công nghệ sinh học thực vật (Đại
học tổng hợp Bonn) đã thực hiện các nghiên cứu trên đối tượng cây thông (Larich
desidue) và đã thu được kết quả sau: i) Đã nghiên cứu tạo huyền phù, xác định các điều
kiện tạo huyền phù và nhân nhanh tế bào thông; ii) Tối ưu hoá quy trình chuyển gen
vào Larich desidue thông qua Agrobacterium; iii) Chuyển gen kháng virus Gumboro
VP2 vào mô sẹo và đánh giá giá biể
u hiện của protein VP2 ở các dòng thông chuyển
gen.
Nói tóm lại, đề tài đã thực hiện tốt các nội dung nghiên cứu đặt ra và thu được
những kết quả rất khả quan. Các kết quả nghiên cứu đạt được mang tính khoa học và
thực tiễn cao. Thành công của đề tài là tiền đề cho việc nghiên cứu tạo vaccine kháng
Gumboro giá rẻ dùng trong chăn nuôi gia cầm và xa hơn là sản xuất các hoạt chất sinh
học khác cho nông nghiệp và y học bằng kỹ thu
ật di truyền thực vật.

4

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D: 2,4 Dichlorophenoxyacetic acid
2iP: 6-(ó,ó-Dimethylallylamino) Purin
AS: acetosyringone
BAP: 6-Benzyl Amino Purin
bp: base pair
CaMV35S- P: Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter

TDZ: Thidiazuron
Ti- Plasmid: Tumor inducing plasmid= plasmid gây khối u thực vật
X-Gluc: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid
5
LỜI MỞ ĐẦU
Thập niên cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 chứng kiến những thành tựu vượt bậc trong
lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Một trong những thành tựu đó là tạo ra các giống
cây trồng chuyển gen có các đặc tính hoàn toàn khác biệt như chống chịu sâu, bệnh,
kháng thuốc diệt cỏ Đến cuối năm 2008 diện tích cây chuyển gen toàn cầu đã đạt 125
triệu ha. Một loạt các giống cây tr
ồng với các đặc tính hoàn toàn mới như: chịu hạn,
mặn, tăng cường khả năng hấp thụ nitơ, chịu úng, tăng cường sinh trưởng, hoặc tăng
cường chất lượng dinh dưỡng, chất lượng chế biến, tăng cường hoạt chất sinh học đã
được nghiên cứu và đang chuẩn bị đưa vào ứng dụng trong sản xuất (Jame, 2008).
Sự phát triển hứa hẹn sáng s
ủa nhất của công nghệ sinh học thực vật là sử dụng cây
chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamin, các hợp chất chữa
bệnh, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế như: kháng nguyên, kháng
thể, interferon, vaccine (Mason et al, 1998).
Có nhiều hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp cần thiết cho các mục đích khác nhau
của con người. Đó là hệ thống sử dụng tế bào động v
ật bậc cao, vi khuẩn, nấm men
Gần đây tế bào côn trùng, thực vật biến đổi gen được sử dụng để khắc phục các nhược
điểm của hệ thống sản xuất protein sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn và nấm
men. Do đó nhiệm vụ to lớn đặt ra cho các nhà khoa học là tìm kiếm hệ thống sản xuất
protein tái tổ hợp khác, rẻ tiền, dễ s
ử dụng và không mang nguy cơ lây nhiễm các bệnh

và 3’ và thành phần amino acid, nhưng lại có một vùng khoảng gần 500 nucleotide ở
chính giữa của gen rất thay đổi trong các chủng khác nhau, nên được gọi là vùng “siêu
biến đổi”. Vùng này quyết định tính độc lực và tính kháng nguyên của virus, do vậy,
được chọn để so sánh, chẩn đoán, giám định và lập phả hệ các chủng virus cường độc
Gumboro (Yamaguchi và cs, 1996; Scherbacova và cs, 1998; Jackwood và cs, 2008).
Xuấ
t phát từ những cơ sở khoa học và đòi hỏi của thực tế trên, Viện Di truyền
Nông nghiệp đã được Bộ Khoa học Công nghệ cho phép thực hiện đề tài “Nghiên cứu
sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nông nghiệp bằng kỹ thuật di truyền
trên tế bào cây thông (Larich desidue) và bèo tấm (Lemna sp/ Wolffia sp.)”. Đây là một
trong những đề tài thuộc chương trình hợp tác khoa học công nghệ giữa Việt Nam và
CHLB Đức, đề tài vừ
a có định hướng ứng dụng lại vừa có ý nghĩa tiếp thu công nghệ,
xây dựng tiềm lực tiến tới làm chủ lĩnh vực công nghệ ADN tái tổ hợp.

7
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
1.1. Tổng quan về bèo tấm
1.1.1. Cây phân loại bèo tấm
Theo Landolt (1986), bèo tấm thuộc giới thực vật, ngành Magnoliophyta, lớp
Liliopsida, bộ Arales, họ Lemnaceae, chi Lemna, Spirodela, Wolffia, Wolffiella với
trên 40 loài khác nhau.
Les và cộng sự, 2002 đã dựa trên đặc điểm về hình thái, nhiễm sắc thể và vi
phân tử (DNA của nhân và lục lạp) đề ra giả thiết về cây phân loại của bèo tấm gồm có
5 chi t
ức là thêm một chi mới là Landoltia (Les và cs, 2002).
Một số nghiên cứu gần đây của Rothwell và cộng sự, 2004 dựa trên sự so sánh
trình tự đoạn intron nằm giữa locus trnL và trnF của bộ gen lục lạp đã xác định rằng họ
Lemnaceae và Pistia cùng thuộc họ ráy Araceae (Rothwell và cs, 2004).

Sợi thô 5,7 - 16,2
Đường 14,1 - 43,6
Tro 12,0 - 27,6

Bèo sinh trưởng trong điều kiện tối ưu về dinh dưỡng và các điều kiện nuôi cấy
thì hàm lượng protein có thể đạt tới 45% trọng lượng chất khô (Leng và cs, 1994).
Hàm lượng protein này rất cao so với các loài thực vật khác và tương đương với hàm
lượng protein có trong đậu tương
1.1.4. Đặc điểm sinh học
1.1.4.1. Khái niệm cơ bản về cánh bèo
Dạng thân giống lá của các loài Lemnaceae được gọi là “frond” (cánh bèo), là
một tậ
p hợp của các mô có sự biệt hoá hạn chế. Mức độ tổ chức của mô cánh bèo trong
họ Lemnaceae giảm từ Spirodela tới Lemna, Wolffiella và Wolffia (Landolt, 1986).
1.1.4.2. Hình dạng và kích thước cánh bèo
Đa số bèo tấm có cánh mỏng giống lá. Một số loài có cánh không dẹt do có
xoang khí lớn. Cánh bèo có hình ovan (hay tròn) dài tới 1,5 cm và rộng tới 1 cm (S.
polyrrhiza, L. trisulca). Loài nhỏ nhất có cánh đạt kích thước 3 mm ở điều kiện tối ưu.
Ở điều ki
ện thường có thể nhỏ hơn 1 mm.
Kích thước và hình dạng của cánh bèo phụ thuộc nhiều vào các điều kiện bên
ngoài và kiểu gen của chúng. Các yếu tố ngoại cảnh này bao gồm: ánh sáng, hàm lượng
đường, hàm lượng nitơ, phospho, kali, canxi và magie, nhiệt độ (Landolt, 1986).
1.1.4.3.Hình thức sinh sản của bèo tấm
Bèo tấm có hai hình thức sinh sản chính: sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính.
Sinh sản vô tính chiếm ưu thế so với sinh sản hữu tính. Hình thức sinh sản hữu tính của
bèo tấm chỉ xảy ra khi chúng gặp điều kiện bất thuận để bảo tồn nòi giống (Landolt,
1986; Landolt và Kandeler, 1987).
*Sinh sản vô tính


thì cánh bèo b
ị tổn thương và chết nhanh hơn bình thường (Landolt, 1986).
*Sinh sản hữu tính
10
+Ra hoa + Quả và hạt
Khoảng 2 - 5 tuần sau khi thụ tinh thì quả chín. Mỗi quả có lá bao khô và
thường có 1 hạt. Ở hầu hết các loài quả gần như đối xứng ngoại trừ L. valdiviana và L.
perpusilla. Quả dài từ 0,35 mm – 2,75 mm. Hạt bèo tấm có dạng hình trứng với 1 vảy
đen ở đỉnh. Khi quả có nhiều hơn 1 hạt thì quả có dạng hình trứng hoặc tam giác. Kích
thước hạt bi
ến đổi trong cùng 1 loài và giữa các loài từ 0,3 - 2 mm về chiều dài và 0,2 -
0,8 mm về đường kính. Hạt có vỏ hạt ngoài và vỏ trong, nội nhũ và phôi. Vỏ ngoài
gồm 2 - 11 lớp tế bào của biểu bì ngoài, ở đỉnh có nhiều lớp tế bào hơn ở giữa và cuối
hạt (Landolt, 1986).
1.1.4.4. Đặc điểm sinh học của Wolffia australiana
W. australiana là loài thực vật hạt kín có hoa nhỏ bé nhất. Chúng không có rễ,
cây dạng hình trứng hoặc hình elip, có chiều dài từ 0,4 mm đến 0,9 mm. Chúng s
ống

- Cải tạo môi trường nước, đặc biệt nó còn làm giảm sự phát triển của muỗi
Anopheles.
- W. australiana là hệ thống mới cho sản xuất các loại vacxin và những kháng
thể đơn.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng phát triển W. australiana
Cũng giống như các loài cây khác,nhiệt độ, môi trường, ánh sáng, chất dinh
dưỡng, độ pH là các yếu tố tác động lên sinh trưởng và phát triển của W. australiana.
W australiana có th
ể sinh trưởng trong các ao hồ, các môi trường nước nhân
tạo, các bình nuôi. Việc thay nước thường xuyên là rất quan trọng, tránh được sự mất
nước do bay hơi. W. australiana cần được nuôi trong môi trường sạch. Khi lấy bèo từ
các ao hồ sẽ bị lẫn nhiều các sinh vật khác: vi khuẩn, nấm, tảo, vi sinh vật, thậm chí các
tế bào động vật rất nhỏ, những ấu trùng. Do đó phải làm sạch bèo trước khi nuôi bằng
cách chuyển các cá thể riêng l
ẻ vào môi trường nước sạch, việc này được làm hết sức
cẩn thận bởi các tế bào bèo rất dễ bị tổn thương.
Môi trường nuôi
Cây sinh trưởng và phát triển tốt hay không phụ thuộc rất nhiều vào môi trường
nuôi. Nhu cầu dinh dưỡng tối ưu cho các loài cây là không giống nhau, tuỳ thuộc vào
loài, giống, thậm chí các mô được lấy từ các cơ quan khác nhau trên cùng một cơ thể
sinh vật.
Cho đến nay người ta đã tìm ra nhiều lo
ại môi trường dinh dưỡng cơ bản như:
môi trường MS, môi trường Knop, môi trường B5. Trong đó, môi trường MS được sử
dụng cho nhiều loại cây trồng. Môi trường MS rất giàu thành phần khoáng đa lượng,
đặc biệt là nitrat và amonium. Tuy nhiên đối với một số loài thì hàm lượng khoáng MS
tỏ ra quá cao và có trường hợp gây độc cho mô nuôi cấy.
Vì thế, với mỗi đối tượng, ta cần tìm ra môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng
và phát triển của chúng. Riêng đối vớ
i W. australiana môi trường nuôi nhân tạo thường

Nhiệt độ tối ưu cho bèo sinh trưởng khoảng từ 20
0
- 30
0
C, ở nhiệt độ 35-40
0
C
ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng của bèo. Dưới nhiệt độ lạnh bèo hình thành
các chồi ngủ, vì thế bèo có thể sống qua mùa đông ở ao hồ dưới dạng những chồi ngủ.
Ánh sáng
Ánh sáng trực tiếp là điều kiện tự nhiên cho bèo, tuy nhiên, ánh sáng trự tiếp có
thể là một vấn đề nếu ta nuôi bèo trong một vật đựng nhỏ, ánh sáng sẽ làm nước tăng
nhiệt độ và bốc hơi làm cho cây chế
t. Chính vì vậy thay nước thường xuyên và tránh
mất nước là điều rất quan trọng.
Ánh sáng đèn huỳnh quang là loại ánh sáng dùng phổ biến nhất vì nó phát ra tia
hồng ngoại cung cấp đầy đủ ánh sáng cho quang hợp và cây sẽ không bị nóng lên.
Độ pH
Độ pH ảnh hưởng đến quá trình hút chất dinh dưỡng trong cây tương đối phức
tạp, ở các nồng độ pH khác nhau thì quá trình hút chất dinh dưỡng cũng khác nhau. W.
globosa có thể sinh trưởng trong một phạm vi pH rộng, nhưng sống tố
t trong khoảng
pH=4,5 đến pH=7,5.

Hình 1.3. Bèo tấm W. australiana nuôi trên đĩa thạch
1.2.
Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh ở bèo tấm
Có rất ít các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh trên bèo tấm được công bố từ
trước tới nay. Theo các tài liệu mà chúng tôi có được từ năm 1978 Chang và Hsing đã
tạo được callus thành công trên L. aequinoctialis khi nuôi cấy các cánh trưởng thành

1.3. Nghiên cứu chuyển gen vào bèo tấm Woffia sp, Lemna sp.
1.3.1. Thiết kế vector biểu hiện ở thực vật
1.3.1.1. Vectơ tách dòng

Để tách dòng một đoạn ADN, đoạn đó cần phải được đính vào vectơ tách dòng.
Có nhiều loại vectơ: plasmid, phage, cosmid, YAC… Người ta chọn sử dụng vectơ dựa
vào kích thước của đoạn ADN cần tạo dòng và mục đích tạo dòng. Một vectơ được sử
dụng cho mục đích tách dòng cần có những đặc điểm sau đây:
• Vectơ phải có khả năng sao chép tích cự
c trong tế bào chủ, không phụ thuộc vào
sự sao chép hệ gen tế bào chủ.
• Vectơ phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lượng ADN
tối đa. Hơn nữa, kích thước vectơ càng nhỏ thì càng dễ dàng xâm nhập vào tế
bào vi khuẩn và càng được sao chép nhanh và đạt hiệu quả.
• Vectơ phải có các đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng tế bào vi khuẩn có chứa
vectơ, các đặc tính này được mã hoá bởi các gen ch
ọn lọc. Thông thường đó là

14
các đặc tính kháng kháng sinh giúp vi khuẩn có mang vectơ sống được trên môi
trường có chất kháng sinh chọn lọc, hoặc có khả năng sản sinh một enzyme
chuyển hoá một cơ chất tạo mầu, dễ dàng phát hiện trên môi trường thạch.
• Vectơ phải tồn tại được trong vi khuẩn qua nhiều thế hệ và phải gây ít xáo trộn
nhất cho tế bào chủ.
• Vectơ phải mang những vị trí nhận biết duy nhất củ
a một số lượng tối đa
enzyme giới hạn. Điều này mở rộng khả năng xây dựng các vectơ tái tổ hợp.
Hơn nữa các vị trí nhận biết này thường đặt vào giữa các gen chọn lọc. Nhờ vậy
mà khi trình tự ADN gắn xen vào một vị trí cũng sẽ gắn xen vào chính giữa gen
và làm bất hoạt gen đấy. Cho đến nay đã có nhiều thế hệ plasmid khác nhau ra

Not I, Ava I, PaeR7 I, Xho I, Xba I, Apa I. Trong đó EcoR I, BstX I có hai vị trí cắt, các
enzyme còn lại chỉ có một vị trí cắt. Với vị trí của vùng MCS như vậy, sản phẩm
β
-
galactosidase có thể được tạo ra (nếu vectơ không được đính đoạn ngoại lai) hoặc
không được tạo ra (nếu vectơ được đính đoạn ngoại lai). Dựa vào dấu chuẩn đó, người
ta có thể lựa chọn được những tế bào mang vectơ tái tổ hợp với tần suất cao. Ngoài ra,
vectơ pCR
đ
2.1 có chứa gen kháng kháng sinh là Ampicillin và Kanamycin, nhờ đó có
thể sinh trưởng bình thường trên môi trường có chứa Ampicillin và Kanamycin với

15
nồng độ ức chế tối thiểu. Phần trình tự trên biểu thị vectơ pCR
đ
2.1 được đính kèm sản
phẩm PCR bởi liên kết TA.
1.1.3.2. Vectơ biểu hiện
Để có thể thu nhận protein tái tổ hợp thì gen mã hoá cho protein phải được gắn
vào vectơ biểu hiện. Có rất nhiều vectơ biểu hiện tương ứng với nhiều loại tế bào biểu
hiện khác nhau. Ở đây để biểu hiện gen VP2 mã hoá một phần kháng nguyên vỏ của
virus gumboro, chúng tôi chọn vectơ pPAMksGFP (6496 bp) để thiết kế pPAM-VP2.
Các vect
ơ này được điều khiển bởi promotor 35S promoter và gen chỉ thị nptII kháng
với geneticin (Hình 1.4). Vùng nhận biết gắn gen kháng kháng sinh giúp cho việc chọn
lọc chính xác dòng plasmid tái tổ hợp. Những plasmid này được TS. J.Schillberg
(Fraunhofer, Viện sinh học phân tử và kinh tế ứng dụng, Aachen, CHLB Đức cung
cấp).
biểu hiện gus tạm thời đã tăng từ 100-1400 lần ở các tế bào đậu tương, đậu đũa, cây
vân sam trắng, lúa mỳ và ngô sau khi biến nạp với Agrobacterium theo phương pháp
SAAT (Trick và Finer, 1997).
* Ly tâm tế bào
Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium kết hợp với ly tâm đã được
áp dụng thành công khi biến nạp vào huyền phù tế bào phôi hoá nhận được từ hoa
chuối đực nuôi cấy in vitro của hai gi
ống chuối thương mại Cavendish và Lady Finger.
Tần số chuyển gen đã được cải thiện đáng kể bằng cách áp dụng chế độ ly tâm tế bào
thực vật trong quá trình nuôi cấy cộng sinh với vi khuẩn (Khanna và cs, 2004).
Hệ thống chuyển gen thông qua Agrobacterium in vivo
Phương pháp này dựa trên cơ sở của việc chuyển gen vào nguyên cây (in planta)
và rất phổ biến đối với loài A. thaliana, một trong những loài cây mô hình đối với các
nghiên cứu về hệ gen h
ọc. Phương pháp chuyển gen này tốn ít thời gian, bỏ qua công
đoạn nuôi cấy mô và tái sinh sau biến nạp, vì thế loại bỏ được các biến dị soma và số
lượng cây chuyển gen thu được lớn hơn. Kỹ thuật này đã được mô tả ở các cây trồng
khác nhau như: đậu tương, Arabidopsis, hoa hướng dương, hoa rum và cây lạc (Rohini
và Rao, 2000).
* Phương pháp chuyển gen vào hạt
Hạt Arabidopsis được lây nhiễm với Agrobacterium sau đó đem tr
ồng và thu
được cây trưởng thành với tần số biến nạp 1%. Hạt Arabidopsis chuyển gen đã được
tạo thành từ các cụm hoa mới xuất hiện sau khi lây nhiễm Agrobacterium tại những
vùng bị tổn thương khi cắt bỏ cụm hoa (Katavic và cs, 1994).
* Phương pháp ngâm cụm hoa

17
Một số nghiên cứu chuyển gen đã được tiến hành ở cây Arabidopsis bằng cách
ngâm các thể giao tử cái của hoa non, cụm hoa trong dịch vi khuẩn Agrobacterium

liệu thực vật khác nhau. Nhược điểm chính là tỉ lệ chuyển gen không cao, gây tổn
thương tế bào dẫn đến khả năng tái sinh kém và cần phải tuân thủ qui trình cảnh báo
nghiêm ngặt khi làm trong phòng thí nghiệm, nếu hít phải sợi Silicon Carbide, đặc biệt
là sợi amiăng có thể bị bệ
nh nghiêm trọng.
Có một số kết quả đã đạt được của phương pháp này như thu được dạng chuyển
gen-dòng tế bào hay cây ở ngô, lúa mì, thuốc lá…
Chuyển gen bằng xung điện

18
Xung điện vào tế bào và mô thực vật rất giống về nguyên lí với xung điện tế bào
trần. Sự khác biệt ở chỗ vật liệu thực vật sử dụng là bao phấn, hạt phấn, mảnh lá, phôi,
callus, hạt hay chồi. Để chuyển gen cả DNA plasmid và vi khuẩn Agrobacterium đều
có thể được sử dụng.
Kĩ thuật này đã được sử dụng trên nhiều loài: thuốc lá, lúa gạo và lúa mì. Các thí
nghiệm để thu cây chuyển gen (bền vững) cũng bắt đầu từ đầu những năm 90. Kết quả
tốt nhất đạt được ở ngô: 6,25 % cây chuyển gen thu được thông qua chuyển vào phôi
và 54,6% với callus ( D’Halluin và cs, 1992). Các tác giả tính toán rằng cứ 10000 tế
bào thì có 1 nhận được gen chuyển. Ở lúa mì, tỉ lệ thu được cây chuyển gen chỉ đạt
0,28%. Mặc dù phương pháp này rất đơn giản và hiệu quả trên một số loài, nó vẫn ít
đượ
c sử dụng để chuyển gen thực vật.
Kỹ thuật vi tiêm
Biến nạp thông qua vi tiêm dựa trên việc chuyển DNA vào nhân hoặc bào tương
bằng các dụng cụ của một pipet có đầu vi mao dẫn thuỷ tinh (Morikawa và Yamada,
1985). Các bước vi tiêm cần được thực hiện trên một thiết bị vi thao tác. Trong quá
trình đưa DNA vào nhân, tế bào được cố định với một pipet giữ và hút cẩn thận. Cả hai
pipet đều chứa dầu khoáng hoạt động gi
ống như xilanh. Vi tiêm chủ yếu được sử dụng
cho chuyển gen vào các tế bào động vật lớn.

Cấu trúc và chứ
c năng của Ti-plasmid
Ti-plasmid được tìm thấy ở tất cả các chủng A. tumefaciens gây bệnh và tồn tại
bền vững ở nhiệt độ dưới 30
o
C. Đây là một phân tử DNA mạch vòng, sợi kép, có trọng
lượng phân tử bằng 3 - 5% so với trọng lượng phân tử của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Với
kích thước khoảng 200 kb, trong tế bào chúng tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập.
Có 2 dạng Ti-plasmid phổ biến. Octopine Ti là plasmid mang các gen cần để tạo
ra các khối u sần sùi sản sinh ra octopine trong khi nopaline Ti- plasmid mang các gen
gây khối u nhẵn sản sinh ra nopaline (Hooykaas và cs, 1979). Octopine Ti plasmid và
Nopaline Ti plasmid có các vùng cơ bản như sau: (i) Vùng T-DNA, (ii) vùng vir
-là
vùng điều khiển hoạt động cắt và chuyển T-DNA vào tế bào sinh vật chủ, (iii) vùng
rep-vùng cần thiết cho sự tái bản Ti-plasmid, (iv) các operon tra và trb-đóng vai trò
điều khiển sự chuyển liên hợp của Ti-plasmid và (v) các gen điều khiển sự hấp thu và
sử dụng các opine (hình 1.5) (Zhu và cs, 2000).

Hình 1.5. Cấu trúc Ti plasmid dạng octopine
Cấu trúc và chức năng của đoạn T-DNA
Kết quả phân tích trình tự gen trên T-DNA ở các Ti-plasmid khác nhau cho
thấy, T-DNA được giới hạn bởi hai đoạn trình tự lặp lại ở hai biên có kích thước 25bp
(Negrotto và cs, 2000; Lê Thị Thu Hiền, 2003).
Ở Ti-plasmid dạng nopaline, T-DNA xâm nhập vào genom thực vật là một đoạn
liên tục dài 22 kb. Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopin, T-DNA là một đoạn gen liên
tục dài 13 kb. T-DNA mang rất nhiều gen như: (l) Các gen mã hoá những enzym cần

20
thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) Các gen gây khối u như tms1, tms2, tmr mã
hoá cho các enzym liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin (Hooykaas

cây chủ. Quá trình tổ hợp T-DNA vào bộ gen cây chủ là quá trình phụ thuộc nhiều nhất
vào cây tế bào chủ (hình 1.6) (Bako và cs, 2003).
Sau khi kết hợp vào bộ gen cây chủ, các gen trên T-DNA, nhờ sự đi
ều khiển của
gen thực vật, bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opin gây nên sự phát
triển thái quá của hàng loạt tế bào lân cận dẫn đến sự hình thành khối u (Wie và cs,
2000; Lê Thị Thu Hiền, 2003).