TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
Ngành công nghệ sinh học

Môn: CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA SINH HIỆN ĐẠI
ĐỀ TÀI: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ
NẤM MỐC MYCOTOXIN TRONG THỨC ĂN GIA SÚC
GVHD: Phùng Võ Cẩm Hồng
Lớp: 07SH1D
MSSV Họ và tên
072379
S
072375
S
072408
S
072492
S
Trần Hòang Đạt
Võ Hùynh Hồng Ân
Chu Ngọc Thùy Dung
Nguyễn Mai Thảo Ly
Tháng 12/2010
MỤC LỤC
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực thực phẩm (Ban hành kèm theo
quyết định số 867/1999/QĐ-BYT của Bộ trưởng Bộ Y tế ngày 4/4/1998).
2. Official Methods of Analysis of AOAC International 1997, Volume 2, chapter 49, P
2 – 34.
3. Tiêu chuẩn Việt Nam: Ngũ cốc – Phương pháp xác định aflatoxin – TCVN 5617 –

trữ). Mycotoxin cũng xuất hiện trong thức ăn hoàn chỉnh khi không được bảo quản
trong điều kiện thích hợp. Nấm mốc không chỉ sản xuất mycotoxin mà chúng còn phá
hoại mùa màng. Tổ chức lương thực và nông nghiệp thế giới (FAO) ước lượng rằng
có khoảng 25% cây trồng trên toàn thế giới có chứa mycotoxin.
3
− Độc tố nấm mốc được sản sinh trong quá trình chuyển hóa chất dinh
dưỡng trong thức ăn gia súc-mycotoxin được sản sinh ra từ Aspergilus,Furasium
,Penicilla và Elaviceps. Mycotoxin do nấm sinh ra như sản phẩm phụ của quá trình
trao đổi chất trong quá trình tiêu hóa và đồng hóa dinh dưỡng từ ngũ cốc và các
nguyên liệu TĂCN khác. Trong số này, lọai nguy hiểm nhất là aflatoxin (được tiết ra
từ nấm Aspergillus và A.parasiyicus).Aflatoxin bao gồm 6 lọai khác
nhau(B1,B2,G1,G2,M1 VÀ M3). Aflatoxin B1 là lọai cực độc. Một lượng 0,03 ppm
aflatoxin B1 từ khô lạc gây ra u gan.
− Aflatoxin được sản xuất trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp và môi
trường thuận lợi cho sự phát triển (khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới,điều kiên lưu
trữ ẩm ướt). Aflatoxin thường hiện diện trong các lạoi hạt ngũ cốc (lúa mạch, bắp,
kê,yến mạch, gạo, lúa miến,lúa mì),hạt bông vải ,đậu phộng,cây đậu và đậu nành.
Aflatoxin xuất hiện trước khi thu họach, nhưng cũng xuất hiện trong thời gian lưu trữ
nếu các hạt ngũ cốc không được lưu trữ đúng cách (Tangendjaja, 2002).
− Nói chung,khi aflatoxin sinh ra,khó có thể làm gì để lọai bỏ chúng khỏi ngũ
cốc hay TĂCN. Các lọai độc tố này có cấu tạo hóa học rất ổn định và không dễ bị
phá hủy bởi nhiệt, ánh sáng, a-xit, kiềm,hay kéo dài thời gian lưu trữ.
− Những lọai nấm mốc này có thể phát triển trong lúc canh tác, lúc thu
họach, lúc dự trữ, lúc sản xuất chế biến thức ăn và trong qúa trình cho ăn khi điều
kiện thuận lợi.Trên tòan thế giới không có khu vực nào tránh khỏi vận nạn do
mycotoxn gây ra, ảnh hướng của chúng lên mức sản xuất của vật nuôi và sức khỏe
của con người. Theo số liệu của Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO) thì khỏang
25% tổng số lượng ngũ cốc nhiễm mycotoxin.
− Nhiều năm trước, người ta cho rằng, độc tố nấm mọc ở mỗi nơi thì khác
nhau do điều kiện địa lý của từng khu vực. Chẳng hạn như: Aflatoxin thì thường

vật.
− Nấm mốc và độc tố nấm gây bệnh nấm (viêm giác mạc, viêm màng trong
tim…)còn gây bệnh dị ứng do tiếp xúc bào tử nấm, gây bệnh độc tố nấm do ăn, uống
(dẫn đến ngộ độc,nhiễm độc, tổn thương gan, ung thư gan).Những lọai độc tố trong
nấm như trên không bị diệt ở nhiệt độ cao (160-170
0
c),do đó, trong trườn hợp nấu
chin thì độc tố aflatoxin vẫn tồn tại mà không bị phân hủy.
− Aflatoxin đặc biệt ảnh hưởng đến gan. Khi ăn vào 1 lượng lớn có thể gây
ung thư gan, viêm gan mãn tính,vàng da và xơ gan. Tiếp xúc với liều thấp trong 1
thời gian dài thì cũng có thể mang lại 1 số rủi ro.
− Ở heo nhiễm độc tố aflatoxin được quan sát trên các giai đoạn: heo theo
mẹ, heo choai, heo vỗ béo và đàn heo giống. Một vài triệu chứng điển hình như là
giảm lượng ăn vào, tăng FCR, giảm tăng trọng, viêm gan do độc tố, hoại tử và cơ
thể bị xuất huyết. Aflatoxin có thể truyền từ tử cung của heo nái qua heo con và làm
ảnh hưởng đến heo con mới sinh.
− Aflatoxin cũng làm tăng sự nhạy cảm của heo đối với bệnh lỵ (Joens và
cộng sự, 1981). Trong thí nghiệm này, những heo không bị bệnh được thí nghiệm
cho tiếp xúc với heo bị mắc lị sau đó cho ăn thức ăn có mức aflatoxin B1 (0.07 đến
0.14 mg/kg). Thời kì ủ bệnh thì ở heo vừa nhiễm aflatoxin và Serpulina
hyodysenteriae thì ngắn hơn heo chỉ nhiễm Serpulina hyodysenteriae. Thêm vào đó,
số ngày mà heo bị nhiễm bệnh và độc tố có dấu hiệu tiêu chảy và bệnh lị dài hơn ở
nhóm heo chỉ bị Serpulina hyodysenteriae. Tỷ lệ chết ở nhóm thứ nhất nhiều hơn
nhóm thứ hai.
− Trong những điều kiện nhất định, nấm mốc sẽ sinh ra aflatoxin. Tuy
nhiên, số lượng aflatoxin tạo ra không đủ để gây ngộ độc nặng. Các triệu chứng
kéo dài như tốc độ tăng trưởng chậm, tiêu tốn thức ăn, khả năng chống bệnh ,
dịch giảm. Nhìn chung, aflatoxin làm giảm khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng và
do đó ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng và các quá trình sử dụng dinh dưỡng
của gia súc. Aflatoxin ảnh hưởng quá trình trao đổi chất béo và sinh ra mỡ trong

1 heo không đáp
ứng miễn dịch
2 heo miễn dịch 1
phần
4 heo không đáp
ứng miễn dịch
5 heo không đáp
ứng miễn dịch
1 heo miễn dịch 1
phần
6 heo không đáp
ứng miễn dịch
− Ảnh hưởng của Aflatoxin B1 (khi thí nghiệm trên thú) đến đáp ứng miễn
dịch của heo heo con đã được chủng ngừa với erysipelas bacterin và cho nhiễm sau
21 ngày với dòng virus Erysipelothrix rhusiopathiae (theo Cysewski và cộng sự,
1978).
 Độc tính trên động vật thí nghiệm:
Nhiễm độc các aflatoxin gây ra một lọat các triệu chứng cấp và mãn tính.
Nhiễm độc cấp thường biểu hiện bằng cái chết của các động vật thí nghiệm với các
triệu chứng thường gặp là họai tử nhu mô gan, chảy máu ở gan và viêm cầu thận
cấp. Nhiễm độc mãn tính thường biểu hiện bằng ăn kém ngon, chậm lớn, gan tụ
máu, chảy máu và họai tử nhu mô. Lọai mãn tính tác động tới yếu tố di truyền tương
ứng với 3 kiểu gây ung thư, gây quái thai và gây đột biến.
Cho đến nay, người ta tạm thời công nhận lên khả năng tác động lên tế bào gan của
aflatoxin qua 5 giai đọan:
− Tác động qua lại với ADN và ức chế các polymeraza chịu trách nhiệm
tổng hợp ADN và ARN.
− Ngừng tổng hợp ADN.
− Giảm tổng hợp ADN và ức chế tổng hợp ARN truyền tin.
− Biến đổi hình thái nhân tế bào.

• Hư hại các cơ quan nội tạng (gan, thận, bộ phận sinh dục)
• Năng suất sản xuất kém (giảm tỷ lệ thụ thai, sẩy thai, âm hộ
sưng to,động dục giả)
• Mối nguy hại cho sức khỏe người tiêu dùng khi thực phẩm có
nhiễm mycotoxin.
 Một số lọai mycotoxin và tác hại cụ thể:
Mycotoxin Triệu chứng
T2 and Diacetoxycripenol Lở loét miêng, mất tính ngon miệng, da
và ruột bị bong tróc,sưng tấy.
Zearaleuone Rối lọan sinh sản
Vomitoxin and Fusarie acid Bỏ ăn ,da hay bị nhiễm nấm
Fumoni and Momlifosumin Gây rối lọan thần kinh, gan bị hư nát
Aflatoxin and Cyclopiazonic acid Gan bị nhiễm độc tố, suy yếu hệ thống
miễn nhiễm
Dehratoxin and Citrinin Thận nhiễm độc , bệnh Gout
4. Cách quản lý mycotoxin:
Cách quản lý mycotoxin hữu hiệu là trung hòa (bằng cách hấp phụ) khi chúng
được hấp thu qua đường ruột. Các nhà sản xuất thức ăn gia súc đặt ra câu hỏi
là:”Chất hấp phụ nào có hiệu quả cao nhất cho mycotoxin?”.Đặc điểm “lý tưởng” mà
chất hấp phụ cần có là :
− Có kết quả hấp phụ nhiều lọai mycotoxin.
− Liều dùng thấp.
− Phân tán nhanh ra đồng đều khi trộn.
− Bền với nhiệt trong suốt quá trình viên ép, ép đùn và dự trữ.
7
− Không hấp phụ các lọai vitamin, khóang và các dưỡng chất khác.
− Độ pH không thay đổi.
− Có khả năng phân hủy sinh học khi lọai thải ( theo phân vật nuôi).
5. Chế phẩm có tác dụng hấp phụ độc tố nấm mốc trong thức ăn
chăn nuôi - Condition ADE 200 HPC

% tổng diện tích bề mặt. Thể tích thẩm thấu này cho phép hạt nhỏ Condition Ade
200 HPC hút nước như là một miếng xốp.
− Tốc độ hút bám của độc tố Aflatoxin của Condition Ade 200 HPC
Condition Ade sẽ kết dính nhanh độc tố Aflatoxin trong bộ máy tiêu hóa của vật
nuôi khi thức ăn nhiễm nấm mốc. Khi trộn Condition Ade 200 HPC vào thức ăn
nhiễm nấm mốc nó làm vô họat tác hại của độc tố nấm mốc có trong đó.
II. THỪƠNG QUY KỸ THUẬT ĐỊNH TÍNH VÀ BÁN ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ VI
NẤM AFLATOXIN
1. Nguyên lý của phương pháp:
Aflatoxin được chiết tách từ mẫu thử bằng clorofoc. Dịch chiết này được lọc
và một phần dịch lọc được làm sạch qua cột silicagen. Làm bay hơi dung dịch rửa
giải và hòa cặn với clorofoc hoặc hỗn hợp benzene-axetonitril. Sau đó chấm một
phần xác định mẫu thử lên bản mỏng, chạy sắc ký và so sánh Rf, màu sắc vết sắc
ký của mẫu phân tích với vết aflatoxin chuẩn dưới đèn tử ngọai có bước sóng
8
365nm. Lượng aflatoxin có thể xác định bằng mắt hay bằng máy đo mật độ hùynh
quang.
2. Đối tượng áp dụng của phương pháp:
Xác định hàm lượng Aflatoxin B1, B2, G1 , G2 trong các sản phẩm ngũ cốc
đậu đỗ, hạt có dầu.
3. Dụng cụ , hóa chất, thuốc thử:
 Dụng cụ:
− Máy xay nghiền mẫu
− Máy lắc hoặc máy khuấy từ
− Cân phân tích
− Máy cất quay chân không
− Bếp cách thủy
− Đèn tử ngọai có bước sóng 365nm.
− Quang phổ kế UV-VIS.
− Máy đo mật độ hùynh quang.

cách sấy khô ở 105
0
C trong 1 giờ, sau đó trút vào bình tam giác nút nhám,
thêm nước với tỷ lệ 1ml nước cho 1gam silicagen, đậy nút, lắc đến khi trộn
hòan tòan đều, bảo quản 15 giờ trong bình kín.
9
16.Chuẩn bị dung dịch aflatoxin chuẩn (điều kiện tiến hành: trong phòng mát,
tránh ánh sáng):
16a. Dung dịch aflatoxin chuẩn gốc (dung dịch A):
− Dùng ống chuẩn 1 mg, mỗi lọai aflatoxin chuẩn B1, B2, G1, G2 lần lượt
cho vào 4 bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng hỗn hơp toluene-
axetonitril 98:2 (v/v) ( nồng độ dung cịch aflatoxin chuẩn là 10mg/ml).
16.b .Dung dịch aflatoxin chuẩn làm việc (dung dịch B):
− Cho vào một bình định mức 10ml lần lượt 0,5 ml aflatoxin B1; 0,5 ml
aflatoxin G1; 0,1ml aflatoxin B2; 0,1 ml aflatoxin G2 (từ dung dịch A ở trên ), định
mức đến 10 ml bằng hỗn hợp toluene-axetonitril 98:2 (v/v), nồng độ dung dịch là 0,5
mg/ml đối với B1, G1, và 0,1 mg/ml đối với B2,G2.
16.c.Cần kiểm tra lại nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn ( dung dịch A mg/ml)
bằng quang phổ hấp phụ phân tử UV-VIS, bước sóng 350 nm, tính kết quả theo
công thức:
C (mg/ml)=1000.m.A/e
Trong đó:
− m- Khối lượng phân tử Aflatoxin
− A- Mật độ quang ở bước sóng hấp thụ.
− E-Độ hấp thụ phân tử của aflatoxin
Aflatoxin m Dung môi
Benzene-axetonitril (v/v)
l max
(nm)
e

đến 2/3 cột. Sau đó cho 10g silicagel dùng cho sắc kí cột (3-15) ,vừa cho vừa gõ nhẹ
vào thành cột cho silicagel lắng đều, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ để tránh bọt khí.
Mở khóa cho clorofoc chảy xuống từ từ. khi tốc độ lắng của silicagel chậm lại, rút hết
clorofoc chỉ để lại một lớp 5cm phía trên lớp silicagel. Thêm từ từ 15g natri sunfat
khan, sau khi rút bớt clorofoc đến gần sát lớp natri sunfat khan trên. Cột silicagel thu
được phải mịn, không có bọt khí và chú ý không để cột bị khô kể từ lớp natri sunfat
khan trên.
− Trộn 50ml dịch lọc trên (5-3) với 150ml n-hexan, đổ cẩn thận vào cột sắc kí
đã chuẩn bị như trên. Loại bỏ dung dịch chảy ra. Cho tiếp 150ml ete etylic khan,loại
bỏ dung dich chảy ra.Chú ý không để cột bị khô,lưu lượng dòng chảy khoảng 8-12
ml/phút.
− Dung dịch rửa giải aflatoxin trên bằng 150ml hỗn hợp metanol-clorofoc(3 :
97). Lấy toàn bộ dịch chảy ra từ khi bắt đầu cho dung dịch rửa giải cho đến hết. Lưu
lượng dòng chảy như trên. Làm bay hơi dung dịch rửa bằng máy cất quay chân
không ở nhiệt độ thấp hơn 50
o
C cho đến khi còn khoảng 2 – 3 ml. Chuyển sang ống
nghiệm 10ml, tráng rửa bình cầu clorofoc và làm bay hơi đến khô trên nồi cách thủy
ở nhiệt độ thấp hơn 50
o
C, tốt nhất dưới luồng khí nitow nhẹ cặn còn lại trong ống
nghiệm là mẫu phân tích. Đậy kín ống nghiệm có cặn để chạy sắc kí lớp mỏng.
c. Sắc kí lớp mỏng một chiều:
Chuẩn bị:
Hòa cặn thu được ở trên bằng 0,5 ml hỗn hợp benzen-axetonitril (98:2) và lấy
dịch này để chấm lên bản sắc ký.
Với bản mỏng tráng sẵn trước khi chấm sắc ký phải cạo sạch lớp silicagel ở
hai cạnh bên tấm sắc kí với chiều rộng 0,5cm. Sau đó cách cạnh đáy 2cm, dùng mao
quản hay micropipet chấm các vết dung dich chuẩn aflatoxin và dung dịch mẫu thử
như sau:

2. 10ml dịch chiết
3. 10ml dịch chiết với 10ml dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2)
4. 10ml dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2)
Phần 2: Bên phải, chấm 4 vết như sau:
5. 10ml dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2)
6. 10ml dịch chiết
7. 10ml dịch chiết với 10ml dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2)
8. 10ml dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2)
− Chấm xong dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay hết. Nhỏ lên 4 vết chấm ở
phần 1 bên trái, mỗi vết một giọt axit trifluoraxetic. Che phần 1 (bên trái) bằng một
tấm thủy tinh khác, phun lên phần 2 (bên phải) dung dịch axit sunfuric 50% (v/v).
Dùng máy sấy nhẹ làm khô các vết chấm rồi mới cho vào bình khai triển.
Dung môi khai triển: Nước/metanol/ ete etylic - 1/3/96 (v/v).
− Khi dung môi lên khoảng 13cm, lấy bản sắc ký ra để khô ở nhiệt độ
phòng, tránh ánh sáng, soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365nm, cách đèn 10cm.
 Đánh giá kết quả:
- Nửa bên trái: Các vết huỳnh quang aflatoxin của dung dịch aflatoxin chuẩn
và của vết dịch chiết (nếu có) sẽ cùng có trị số Rf ngắn hơn bình thường, vẫn giữ
nguyên màu huỳnh quang xanh.
- Nửa bên phải: Các vết huỳnh quang aflatoxin của dung dịch aflatoxin chuẩn
và của vết dịch chiết (nếu có) sẽ cùng có trị số Rf bình thường, và màu huỳnh quang
xanh chuyển sang màu vàng.
 Định lượng
a. Bằng mắt:
−
Xác định hàm lượng aflatoxin trong dịch chiết bằng cách so sánh mật độ
huỳnh quang của vết dịch chiết với mật độ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn.
Vết huỳnh quang của vết chấm dung dịch aflatoxin chuẩn chồng lên vết dịch chiết
phải mạnh hơn huỳnh quang của vết 10ml dịch chiết và phải trùng nhau. Nếu mật độ
huỳnh quang của vết 10ml dịch chiết đậm hơn mật độ huỳnh quang của vết 20ml

W – Khối lượng của mẫu thử, tương ứng với thể tích dịch chiết khi tiến hành làm
sạch qua cột, (g).
 Độ nhạy của phương pháp: 5mg/kg (5ppm)
- Hệ số thu hồi của phương pháp: 90 ±

5%.
- Sai số trung bình của phương pháp: ±

10%.
III. GIỚI THIỆU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ NẤM MỐC MỚI
− Trong phân tích độc tố nấm mốc hiện nay thì các phương pháp dựa trên
nguyên tắc sắc ký khí vẫn chiếm giữ vị trí chủ yếu. Tuy nhiên, người ta cũng bắt đầu
nghiên cứu sử dụng thêm một số phương pháp khác như phương pháp phân tích
nhanh đa độc tố hay sử dụng một số kỹ thuật mới như cảm biến sinh học
(Rudofkrska và Elivira Welzig). Các phương pháp phân tích để xác định các độc tố
nấm mốc trong thực phẩm đã được phát triển và hoàn thiện từ những năm 1960.
Độc tố nấm mốc là những hợp chất có cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa khác
nhau nên cần những phương pháp kiểm tra đặc trưng riêng. Chính vì vậy đã xuất
hiện nhiều phương pháp xác định như các phương pháp dựa trên cơ sở sắc ký lỏng
(LC) hoặc sắc ký khí (GS) với detector thích hợp như detector huỳnh quang (FLD),
detector bắt điện tử UV, detector ion (FID), detector bắt điện tử (ECD), detector khối
phổ (MS). Các phương pháp này thường cho kết quả tối ưu với từng loại độc tố nấm
mốc nhất định hoặc một nhóm các độc tố nấm mốc có liên hệ gần gũi với nhau về
cấu trúc, ví dụ như nhóm trichothecenne B.
− Phương pháp phân tích độc tố nấm mốc bằng sắc ký vẫn thường gặp áp
dụng rộng rãi trong các quy trình vì chi phí đầu tư không cao. Các cột sắc ký, các
phương pháp làm sạch mẫu vẫn luôn có những cải tiến và đã đạt được những phát
triển đáng kể. Hiện nay, trên thị trường đã có các cột ái lực miễn dịch, vật liệu SPE
trong các ống nhựa sử dụng một lần và các cột Mycosep cho các loại độc tố nấm
mốc chính.

− Để góp phần làm giảm hơn chi phí và thời gian phân tích độc tố nấm mốc,
những kỹ thuật phân tích mới đang được nghiên cứu và áp dụng. Tất nhiên việc đưa
kỹ thuật từ phòng thí nghiệm trở thành sản phẩm thương mại hóa phương pháp
phân tích độc tố nấm mốc dựa trên cảm biến sinh học như: phương pháp xét nghiệm
miễn dịch huỳnh quang phân cực (FPI) và phương pháp cộng hưởng gen nguyên
sinh bề mặt (SPR).
− Phương pháp xác định độc tố gián tiếp khác rất đáng chú ý đang được
nghiên cứu là phương pháp sử dụng quang phổ trung hồng ngoại chuyển đổi chuỗi
Fourier với mức phản xạ toàn phần yếu (ATR) hay quang phổ cận hồng ngoại. Các
phương pháp này giảm việc chuẩn bị mẫu xuống mức tối thiểu. Tuy nhiên các kỹ
thuật quang phổ có những hạn chế lớn là mức độ phụ thuộc cao vào cấu trúc thành
phần mẫu và thiếu vật liệu kiểm chuẩn.
− Có thể thấy việc thiếu bộ mẫu tham khảo – vật liệu kiểm chuẩn hiện nay là
khó khăn lớn để các phòng thí nghiệm đảm bảo chất lượng phân tích độc tố nấm
mốc. Một số giải pháp hiện thời có thể áp dụng là:
Thường xuyên tham dự những kỳ kiểm tra độ thành thục tổ chức bởi những
cơ quan như FAPAS (www.fapas.com).
Sử dụng bộ các mẫu tham khảo (đã được chứng nhận) RM hoặc CRM. Cả
tập hợp mẫu RM lẫn mẫu CRM sử dụng cho việc phân tích độc tố aflatoxin và
Fusarium dù còn chưa hoàn chỉnh của các mẫu CRM đã có thể tìm thấy ở COMAR
(www.comar.bam.de), cho phép truy việc truy nguyên nguồn gốc và so sánh các kết
quả phân tích độc tố nấm mốc.
14
15