THU NHẬN ENZYME PECTINASE TỪ VI
SINH VẬT
Chương I.TỔNG QUAN:
I. Bản chất của enzyme pectinase :
Enzyme pectinse là một nhóm enzyme thủy phân pectin , sản phẩm của
quá trình này là axit galcturonic , galactose , arabinose , methanol … đây là
một nhóm ezymw được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chỉ đứng sau
amylase và protease . Enzyme này ban đầu được phát hiện trong các dịch
chiết trái cây như cà rốt , cà chua hay đại mạch . Đầu tiên phải kể đến là
phất hiện của E.fremi ( 1840 ) trên đối tượng cà rốt .
1) Phân loại và danh pháp quốc tế
Enzyme pectinase được chia thành những loại enzyme khác nhau.
Việc phân loại enzyme pectinase dực vào tính đặc hiệu , cơ chế tác
dụng , kiểi phản ứng , pH tối ưu của enzyme . Năm 1996 , Koller và
Neukom chia enzyme pectinase thành hai nhóm chủ yếu :
a) Hydrolase : Xúc tác cho quá trình thủy phân
bao gồm pectimetylesterase ( pectinehydrolase , mã
số EC 3.1.1.11) và polygalacturonase ( plygalacturonit
– gluconohydrolase , mã số EC 3.2.1.15 ) :
 Pectimetylesterase , là các enzyme
xúc tác sự thủy phân lien kết este trong phân tử pectine hoặc
axit pectinic ( các axit polygalacturonic được este hóa nhờ rượu
metylic ở mức thấp).
 Polygalacturonase , là các enzyme
xúc tác sự thủy phân lien kết 1-4 glucozit trong phân tử pectine .
Có nhiều polygalacturonase có tính đặc hiệu rất khác nhau :
Polymetyl galacturonase tác dụng chủ yếu lên các este
metylic của các axit polygalacturonase . Các enzyme này
được chia thành hai nhóm :
 Endo – glucozidaze – polymetylgalacturonase I : Xúc tác sự
thủy phân các lên kết gucozit nội mạch của các phân tử axit

Enzyme pectinase cũng như hầu hết các enzyme khác là
chất xúc tác sinh học có bản chất là protein , co khả năng xúc
tác đặc hiệu cơ chất cao . Các ezyme này thường có cấu trúc
rất phức tạp và để đảm bảo tính tác thì chúng có cấu trúc bậc
IV . Trong cấu trúc bậc IV hình thành nên trung tâm hoạt động
enzyme pectinase chứa một vùng
8-10 vòng xoắn kép. Người ta nhận thấy rằng trung tâm hoạt
động chứa 2 axit amin là aspartate va lysine .
3) Pectine và cơ chế tác dụng của enzyme pectinase
a. Cấu tạo pectin
Pectin là polysaccharide dị thể , chủ yếu là một mạch chính , gồm các
gốc axit – α – D – 1,4 galacturonic , liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 – O
, glucozit ; còn gọi là axit polygalacturonic hay axit pectic . Pectine hòa tan
trong tự nhiên là ester metylic của axit pectic , dang tổng quát là :
Trong thực tế không phải bao giờ, tất cả các nhóm –COOH ở C6 của đường
galacto cũng bị metyl hóa (tạo ester metylic), mà đôi khi một số nhóm –COOH bị
decacboxyl hóa (khử CO2), một số nhóm –COOH d9u7o75v thay thế -H bằng
kim loại, cũng co lúc giữ nguyên dạng –COOH … Người ta cho rằng
protopectine là hợp chất giữa pectine và araban, galacto hay tinh bột.
b) Cơ chế tác dụng của enzyme pectinase:
 Pectinemathyllestarase [mã số E.C.3.1.1.11] là các enzyme xúc tác sự
thủy phân lien kết este trong phân tử pectine hay axit pectinic. Khi toàn bộ
các nhóm metoxyl đều bị tách ra khỏi cơ chất thì sản phẩm tạo thành là
H
OH
H
H
OH
H
COOH

methanol và các axit polygalacturonic. Sự thủy phân chỉ xảy ra ở các lien
kết este trong phân tử pectine và axit polygalacturonic có thể bị thủy phân
một phần hoặc hoàn toàn
 Polygalacturonase [mã số E.C.3.2.1.15] là các enzyme xúc tác sự thủy
phân liên kết 1-4 glucozit trong phân tử pectine.có nhiều
polygalacturonase có tính đặc hiệu rất khác nhau:
 Polymethulgalacturonase: là enzyme tác dụng trên axit polygalacturonic
đã được metoxyl hóa.chia làm 2 dạng nhỏ:
 Endo-glucosidase-polymethylesterase kiểu I xúc tác sự thủy phân liên kết
glucozit nội mạch của các phân tử axit polygalacturonic được este hóa ở
mức độ cao.
 Exo-glucosidase-polymethylesterase kiểu III: xt thủy phân liên kết glucozit
ở đầu mạch để tách từng gốc axit galacturonic ra khỏi phân tử pectine
,bắt đầu từ không khử .Enzyme nay có ái lực với gốc galacturonic đã
metoxyl hóa .
 Polygalactuironase là các enzyme tácdụng chủ yếu lên các axit pectic(axit
polygalacturonic không bị este hóa) và axit pectinic(các axit
polygalactironic bị este hóa ở mức độ thấp) và các enzyme này cũng chia
thành 2dạng nhỏ :
 Endo –glucosidase-polygalacturonase kiểu II:xúc tác sự thủy phân liên kết
glucozit ở giữa mạch các phân tử axit pectic và axit pectinic. Các enzyme
này tác dụng ở vị trí liên kết đầu nhóm cacboxyl tự do.
 Exo- glucosidase- polygalacturonase kiểu IV: xúc tác sự thủy phân các
liên kết glucozit ở đầu mạch của axit pectic và axit pectinic. Enzyme này
có ái lực với các liên kết glucozit ở đầu mạch gần với nhóm cacboxyl tự
do.
Ngoài các enzyme chủ yếu kể trên, tham gia sự phân giải các hợp chất pectine
còn có: enzyme protopectinase xúc tác sự thủy pâhn protopectine không tan
thành pectine hòa tan và enzyme transeliminase xúc tác sự pâhn cắt các hợp
chất pectine bằng con đường khác con đường thủy phân tạo thành galacturonit

Để tăng số emzym dựa vào sử dụng trong công nghiệp nước ta đồng thời đáp
ứng yêu cầu của cơ sở sản xuất, chúng tôi đã nghiên cứu phân lập nhiều chủng
nấm mốc có họat tính pectinase từ các nguồn khác nhau và chọn được 1 số
chủng Asp.niger có họat tính pectinase cao. Trong số đó đáng chú ý nhất là
chủng Asp.niger 72-32. Chế phẩm pectinase thô và tinh thu từ chủng này đã
được sử dụng làm trong một số nước quả và để khử pectin trong quá trình trích
ly một số dược liệu đông y.
1) Sử dụng pectinase để làm trong nước quả:
Xirô quả nhanh đóng cục là do chứa 1 hàm lượng pectinase đáng kể.Qua phân
tích hàm lượng pectinase trong 1 số quả như sau:
• Cirô mơ:0,107%
• Xirô mận:0.153%
• Nước mận:0.452%
Lượng pectin này làm cho xirô quả bị keo và đục,có độ nhớt khó lọc,nhất là khi
quả có độ axit và hàm lượng đường cao như các lọai xirô kể trên.
Để làm trong nước trong chúng,nên sử dụng chế phẩm enxyme có họat độ
1,950đvhđ/ 1g canh trường(theo phương pháp Cu-pectat) hoặc 0,768 đvhđ/ 1g
canh trường(theo phương pháp so màu).
2) Sử dụng pectinase để trích ly dược liệu đông y:
Mục đích để khử pectin có trong dược liệu tạo điều kiện trích lt nội chất nhanh
hơn và trích ly sau thời gian bào quản không bị vẫn đục
Đựoc liệu đựoc phân phân lọai theo hàm lượng pectin đáng kể:
• Nhiều nhất: 51,24%
• Ít nhất: 3,8%
• Trung bình: 10-30%
B.PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY:
I.Phương Pháp Nuôi Cấy Bề Mặt:
Nuôi cấy nấm mốc và một số vi khuẩn theo phương pháp bề mặt để sản xuất
enzim thường dung môi trường rắn, đôi khi dung môi trường lỏng.
Môi trường rắn thường là các nguyên liệu tự nhiên:cám mì, cám gạo, ngô mảnh,

hoặc sunfuric đến pH thích hợp, hay thêm một ít focmalin họăc một chất sát
trùng khác thì chỉ cần thanh trùng dưới áp lục hơi 0,2 – 0,3atm. Thêm axit giữ
môi trường ở pH nhất định sẽ giúp cho một vài enzim tạo thành được nhiều hơn.
Môi trường được trải mỏng ra các khay đã được thanh trùng với lớp dày khoảng
2 – 2,5cm và để nguội đến 30*C thì tiến hành cấy giống. Giống được nhân giống
cũng theo phương pháp bề mặt họăc bằng bào tử thu được theo phương phát
tách bào tử khỏi môi trường nhân giống và chứa vào các bình nút kín hoặc trong
các túi PE. Khi nuôi cấy nhân giống thường để cho mốc mọc già đến khi sinh ra
nhiều bào tử. Tỉ lệ nhân giống vào khỏang 0,2 – 2%. Mỗi gam bào tử mốc có thể
cấy vào 10kg môi trường.
Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng nuôi có sẳn các giá.
Phòng nuôi có thể điều chỉnh được nhiệt độ, độ ẩm và được thổi gió.
Nhiệt độ thích hợp với đa số mốc là 30 – 32*C. nến nhiệt độ xuống dưới 24*C
nấm mốc phát triển chậm, sinh bào tử yếu, thời gian nuôi cấy dài dẫn đến làm
giảm khả năng sinh tổng hợp enzim.
Qúa trình nuôi cấy nấm mốc trên bề mặt môi truờng được chia
thành 3 thời kì:
1) Khoảng 10 – 14h đầu: bào tử trương nở bắt đầu nảy mầm. Thời kì này
chưa hình thành enzim, không đòi hỏi phải thông khí nhiều chỉ cần làm
thoáng khoảng 2 – 3 thể tích không khí / thể tích phòng / giờ. Giống rất
nhạy cảm với nhiệt độ ở giờ này, nhiệt độ buồng nuôi cần giữ ở 29 –
31*C.
2) Thời kì giữa léo dài khoảng 14 – 18h: mốc phát triển nhanh, hô hấp
mạnh, sợi nấm có thể quan sát bằng mắt thường, lúc đấu là lớp long tơ
màu trắng – xám và ngày càng rõ, làm môi trường kết bánh lại. Có thể
phải lật môi trường, bẻ nhỏ ra để sợi nấm mọc tốt hơn.
Các chất dinh dưỡng trong môi trường tiêu hao nhanh để phục vụ cho các quá
trình trao đổi chất trong tế bào và giống hô hấp mạnh tỏa ra môi trường chung
quanh 80 – 90kcal/giờ. Làm nhiệt độ môi trường có thể tăng lên đến 37 – 40*C
hoặc lâu hơn nữa. Thời kì này cần phải thông khí mạnh tới 60 thể tích khí/1thể

mang lưu hùynh và mangan. Môi trường được thanh trùng trong thiết bị riêng
hoặc trong thùng lên men dưới áp lực của hơi nóng trực tiếp ở 118 – 125*C
trong khoảng 45 – 60’.
Sau khi làm nguội môi trường đến nhiệt độ thích hợp sẽ tiến hành tiếp giống.
Giống được cấy từ ống nghiệm qua các bình tam giác, đặt trên máy lắc, rồi nuôi
ở thùng nhân giống có thể tích bằng 5- 10% thể tích thùng lên men trong khoảng
24 – 36h. Cấy giống mốc bào tử theo phương pháp chìm sẽ kéo dài thời gian
nảy mầm và cũng kéo dài toàn bộ quá trình nuôi cấy. Môi trường nhân giống có
thể dung các hợp chất nitơ dễ tiêu hóa đối với vi sinh vật mà trong quá trình nuôi
cấy vẫn nâng cao được họat lục sinh tổng hợp. Tỷ lệ giống nằm trong khoảng 2
– 5%, nhưng đối với một số chủng tỷ lệ này cón giảm hơn nhiều, có khi tới 0,5 –
0,6%.
Sinh tổng hợp enzim theo phương pháp chìm trong các thùng lên men có khí
thổi và khuấy liên tục kéo dài trong khoảng 2 – 4ngày. Đa số các enzim thủy
phân do nấm mốc, xạ khuẩn tạo thành được vào môi trường xung quanh, phần
còn lại trong hệ sợi sau 3ngày nuôi cấy khoảng 10 – 15%.
Sơ đồ công nghệ của việc nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp chìm trong sản
xuất enzim về nguyên lí giống như quá trình sản xuất các chế phẩm sinh học
khác (axit amin, vitamin, chất kháng sinh …). Quá trình tách chế phẩm sau khi
lên men có thể khác nhau, nhưng quá trình lên men với các thiết bị và qui định
về theo dõi các chế độ lên men là rất giống nhau.
Trong quá trình nuôi cấy nấm mốc sinh enzim theo phương pháp chìm pH môi
trường có một ý nghĩa rất lớn. Chỉ số pH thích hợp cho sinh tổng hợp pectinase
là 7 – 8. Trong môi trường khi dùng các muối amon làm nguồn nitơ môi trường
sẽ bị kiềm hóa. Để điều chỉnh pH trong quá trình nuôi cấy người ta dùng NaOH
và H
2
SO
4
.

Phương pháp tách chiết và làm sach enzim được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay
là phương pháp kết tủa enzim bằng dung môi hữu cơ (etanol, izopropanol và
axeton). Các dung môi hữu cơ này làm giãm hằng có điện môi của môi trường.
như ta đã biết, lực hút tĩnh điện tỉ lệ nghịch với hằng số điện mới. vì vậy các
enzim, các chất protein cũng như các chất có phân tử thấp trong hệ dung dịch
nước – dung môi hữu cơ sẽ tủa và lắng xuống.
Độ hòa tan cùa enzim vào dung dịch cồn – nước phụ thuộc vào nồng độ cồn,
nhiệt độ, lực hút ion của dung dịch và tính chất protein của enzim. Để tránh mất
họat tính của enzim tất cả phải được làm lạnh xuống 3 – 5*C. khi trộn phải khuấy
mạnh, khi các enzim kết tủa và lắng xuống dưới cần tách ly ngay.
SƠ ĐỒ TINH SẠCH ENZYME TỪ CANH TRƯỜNG NẤM MỐC
II.XÁC ĐỊNH HỌAT ĐỘ ENZYME:
1) Phương pháp nhớt kế:
Xác định độ họat đông pectinase của canh trường theo phương
pháp độ nhớt của dung dịch pectin 1% bằng nhớt kế Ot-van.
2) Phương pháp đông chung(Cu-pectat):
Nguyên tắc: thủy phân pectin dưới tác dụng pectinase.Sau đó dùng
CuS0
4
5% để kết tủa axit pectin dưới dạng đồng pectat(Cu-
pectat).Hòa tan kết tủa bằng NH
4
OH 25%. Xác địng lượng đồng
nhờ iốt.
Một đơn vị họat động pectinase theo phương pháp này là một
lượng emzym có khả năng xúc thủy phân hết 1 mg pectin trong
thời gian 1giờ ở điều kiện tiêu chuẩn.
3) Phương pháp so màu: Theo phương pháp này:Một đơn vị họat
động pectinase là một lượng emzym có khả năng xúc thủy phân
xác định họat độ

30 361
32 740
34 1150
36 1300
38 887
40 288
2) Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi:
Asp.niger 72-32 được nuôi cấy trên môi trường cơ bản có độ ẩm 50% ở nhiệt đô
khác nhau. Sau 2 giờ xác định họat độ pectinase của canh trường. Kết quả thu
được trình bày ở bảng 4.
Bảng 4.Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi đến sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger
72-32
Nhiệt độ
nuôi(
o
C)
Họat Động pectinase(đvhđ/1g canh
trường)
28 803
30 1134
32 1351
34 1688
36 764
48 520
Qua bảng 4 thấy nhiệt độ từ 30-32
o
C là thích hợp nhất cho sinh tổng hợp
pectinase của Asp.niger 72-32
3) Ảnh hưởng độ ầm ban đầu của môi trường nuôi cấy:
Asp.niger 72-32 được nuôi cấy trên môi trường có độ ẩm ban đầu tahy đổi từ 40-

bảng 6,7.
Qua bảng 6 và 7 thấy rằng khi thêm vào môi trường nguyên liệu chưa pectin
thích hợp họat động pectinase của Asp.niger 72-32 tăng rõ rệt từ 8-12 lần. Họat
độ pectinase tăng nhiều nhất(gần 12 lần) khi trong môi trường có 11% carốt, sau
đó đến của cải 12% và bã táo 13%.Điều này chứng tỏ một lần nữa pectinase là
một enzim cảm ứng.Ngòai ra cà rốt còn chứa một lượng muối vô cơ và vitamin
có thể ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh trưởng phát triển và sinh tổng hợp
enzym của nấm mốc.
Bảng 6. Ảnh hưởng của hàm lượng và nguồn nguyên liệu chứa pectin khác
nhau đến sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger 72-32(hương pháp đồng)
Lượng nguyên
liệu chứa
pectin(%)
Họat Động pectinase(đvhđ/1g canh
trường)
Môi trường
có cà rốt
Môi trường
có củ cải
Môi trường có
bã táo
0 142 142 142
3 302 296 202
5 621 532 496
7 980 820 600
9 1290 1050 726
11 1650 1265 850
12 1400 1500 970
13 1150 1300 1100
14 930 1180 900

muối amon sunfat thay đổi, nuôi ở 32
o
C và sau 36 giờ đem xác định họat độ
pectinase của canh trường.Kết quả thu được ghi ở bảng 8.
Qua bảng 8 nhận thấy muối amon sunfat trong môi trường có ảnh hưởng đến
tổng hợp pectinase của nấm mốc trên môi trường có cà rốt 11%. Khi thêm từ 1-
2.5%amon sufat họat độ pectinase của chùng Asp.niger có thể tăng từ 7- 10%.
Bảng 8. Ảnh hưởng của amon sunfat đến sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger
72-32
Hàm lượng
(NH4)
2
S04
trong môi
trường (%)
Thời gian chảy(s) của dung dịch pectin qua nhớt kế
Ôt-van trong các thí nghiệm
Tỷ lệ tăng họat độ
pectinase %
1 2 3 4 5
trung
bình
17 17 17 18 16.5 17.1 0
1 16.5 16.2 15.5 15.5 16.6 15.86 7.8
1.5 16 15.5 15.8 15 15 15.56 9.25
2 15.6 15.4 15.7 15.4 15.5 15.52 10.01
2.5 15.5 16 15.5 15 15.5 15.5 10.32
3 16.2 16 16 16 16 16.04 6.6
II. Kết luận về chủng Asp.niger72-32:
1) Thành phần để chủng sinh tổng hợp pectinase cao:

• Tỷ lệ etanol 1:2.5(tức là 1 nước chiết enzyme cho 2.5 etanol độ cồn 90-
96
o
)…
TÀI LIỆU THAM KHẢO:
1. LÊ VĂN NHƯƠNG,NGUYỄN CHỨC,NGUYỄN THỊ
TRỌNG.Nghiên cứu điều kiện và môi trường sinh tổng hợp
pectinase của Asp.niger .Lương thực thực phẩm số 7(46)Hà Nôi
1974.
2. TH.S LÊ HỒNG PHÚ(giáo viên hướng dẫn luận văn)-Đề Tài Sàn
Xuất Cà Phê.
3. PGS.TS.LƯƠNG ĐỨC PHẨM,Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp.Hà
Nội,2004.
Nhóm Đếm:
Nguyễn Anh Tuấn
Đào Thị Lệ Hằng
Nguyễn Trương Linh Phương