LỜI MỞ ĐẦU
Ngay từ thời cổ xưa, vi sinh vật đã được con người sử dụng để chế biến và sản xuất thực
phẩm, nó là một bộ phận trong khẩu phần ăn của con người và các loài vật nuôi. Ngày nay
việc sản xuất protein từ nguồn vi sinh vật không chỉ nhằm mục đích sử dụng để làm thức
ăn, mà sản xuất protein từ vi sinh vật được trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Protease là enzyme hiện nay được sử dụng nhiều nhất trong một số ngành sản xuất như:
Chế biến thực phẩm ( đông tụ sữa dùng làm phomat, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng
chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…),
sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…
Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã
được cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Protease
phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú
nhất và có nhiều ưu điểm nhất như: có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc, xạ
khuẩn…, có hoạt tính mạnh chỉ cần một lượng nhỏ có thể chuyển hóa một lượng cơ chất
lớn, có cường độ sinh sản rất mạnh và tổng hợp enzyme với tốc độ rất nhanh chóng, trong
một thời gian ngắn có thể thu được một lượng enzyme lớn….Có thể nói vi sinh vật là
nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ
và đời sống. Đây cũng chính là lý do em chon đề tài “ Nghiên cứu quy trình sản xuất
enzyme protease từ vi sinh vật”
Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về enzyme
1.1.1. Định nghĩa enzyme[1] co thanh nga
Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học, là
chất xúc tác sinh học có ý nghĩa đặc biệt quan trọng như: cường lực xúc tác lớn, sự
chuyển hóa cơ chất mạnh….
1.1.2. Thành phần cấu tạo của enzyme[2]co thanh nga
Cũng như protein, enzyme có thể là protein đơn giản hoặc protein phức tạp. Trên cơ sở đó,
người ta phân enzyme thành hai nhóm: Enzyme một thành phần (enzyme một cấu tử) và
enzyme hai thành phần (enzyme hai cấu tử).
Phần protein của enzyme hai thành phần được gọi là apoprotein hay apoenzyme, còn phần
không phải protein gọi là nhóm ngoại hoặc coenzyme. Phần không phải protein thường là

ức chế calcineurin.
4. Lyases xúc tác sự phân tách của CC, CO, CS và CN trái phiếu bằng các phương
tiện khác hơn so với thủy phân hoặc quá trình oxy hóa. Tên gọi thông thường bao
gồm decarboxylase, aldolase.
5. Isomerase xúc tác tái sắp xếp nguyên tử trong một phân tử . Ví dụ như rotamase,
isomerase disulfide protein (PDI), epimerase và racemase.
6. Ligases xúc tác cho phản ứng mà tham gia hai phân tử. Các ví dụ bao gồm các
enzym tổng hợp peptide, aminoacyl-tRNA synthetase, DNA ligase và RNA ligase.
1.1.4. Trung tâm hoạt động của enzyme[2]co thanh nga
Trung tâm hoạt động của enzyme là phần của phân tử enzyme trực tiếp kết hợp với
cơ chất, tham gia trong việc tạo thành và chuyển hóa phức chất trung gian giữa
enzyme và cơ chất để tạo thành sản phẩm phản ứng. Trung tâm hoạt động bao gồm
nhiều nhóm chức năng khác nhau của amino acid, phân tử nước liên kết và nhiều
khi có cả cofactor hữu cơ (coenzyme) và vô cơ.
Theo quan niệm của Fisher thì trung tâm hoạt động của enzyme đã được hình thành
sẵn với một cấu tạo nhất định chỉ cho phép cơ chất có cấu tạo tương ứng kết hợp
vào. Do đó có thể ví sự tương ứng đó như ”ổ khóa với chìa khóa”.
Còn theo Koshland thì đặc điểm của vùng trung tâm hoạt động là rất mềm dẻo và
linh hoạt , các nhóm chức năng của trung tâm hoạt động của enzyme tự do chưa ở
tư thế sẵn sàng hoạt động, khi tiếp xúc với cơ chất, các nhóm chức năng ở trong
phần trung tâm hoạt động của phân tử enzyme thay đổi vị trí trong không gian, tạo
thành hình thể khớp với hình thể của cơ chất. Cũng vì vậy, người ta gọi mô hình này
là mô hình “tiếp xúc cảm ứng” hoặc “khớp cảm ứng”.
Giữa cơ chất và trung tâm hoạt động tạo thành nhiều tương tác yếu, do đó có thể dễ
dàng bị cắt đứt trong quá trình phản ứng để giải phóng ezyme và sản phẩm phản
ứng.
1.1.5. Tính đặc hiệu của enzyme[2] co thnah nga
Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất
định theo một kiểu phẩn ứng nhất định. Đặc tính tác dụng lựa chọn cao này gọi là
tính đặc hiệu hoặc tính chuyên hóa của enzyme. Tính đặc hiệu là một trong những

mối liên kết đó.
Ví dụ: Lipase có khả năng thủy phân được tất cả các mối liên kết este.
d) Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể)
Hầu như tất cả các enzyme đều có tính đặc hiệu không gian rất chặt chẽ,
nghĩa là enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân không gian
của cơ chất.
Ví dụ: Phản ứng khử nước của malic acid để tạo thành fumaric acid dưới tác
dụng của fumarathydratase chỉ xảy ra đối với L-malic acid mà không tác
dụng lên D-malic acid.
1.2. Tổng quan về enzyme protease
1.2.1.Giới thiệu chung về protease
1.2.1.1. Định nghĩa về enzyme protease
Protease là enzyme thủy phân các liên kết peptid (-CO-NH-)n trong phân tử protein giải
phóng các acid amin, pepton hoặc ditripepton.
Hình 1.2. Cấu trúc không gian enzyme protease
1.2.1.2. Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của Protease [7]
Trong TTHĐ của Protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trưng cho từng nhóm
còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của một số
Protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau:
- TTHĐ của Protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và trong một số trường hợp
còn có cả cofactơ kim loại.
+ Các Protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 21
0
A, có thể phân biệt thành
sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương ứng với mỗi gốc aa trong
phân tử cơ chất.
+ Đối với các Protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của các tinh thể
Protease acid của Phizopus chinenis và Endothia parasilica đã cho thấy phân tử các
Protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 20
0

* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai
loại:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:
+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung
tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của
enzyme.
+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động.
Như: papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng.
+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Có chứa
nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung
tính.
+ Metallo proteinase: Là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng
như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH
trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
- Protease acid: pH 2-4 có nhiều ở tế bào động vật, nấm men, nhưng ít thấy ở vi
khuẩn.
- Protease trung tính có pH 7-8 như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa.
- Protease kiềm có pH 9-11.
* Ngoài ra có thể phân thành 2 loại khác:
- Enzyme protease nội bào là những enzyme được tiết ra từ bên ngoài hoặc ngoại biên
màng protein và được trích ly vào môi trường bằng kỹ thuật trích ly
- Enzyme protease ngoại bào được thu nhận từ quá trình lên men, như quá trình lên men
trên môi trường rắn. Enzyme được thu nhận khi quá trình lên men hoàn tất hoặc ngay
khi quá trình lên men đang diễn ra.
1.2.3. Tình hình nghiên cứu enzyme protease />enzyme-protease-trong-san-xuat-bia-30369/?langid=1

phân từ cá Mối”, Vũ Ngọc Bội, trường Đại học thủy sản Nha Trang. Qua nghiên cứu cho
thấy protease B. subtilis có thể thủy phân mạnh mẽ cơ thịt cá mối và hoàn toàn có thể sử
dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân. Khi bổ sung protease B. subtilis với
nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp cơ thịt cá mối và thủy phân ở 50
0
C.
+ Nghiên cứu ứng dụng Protease trong sản xuất Bia, thực hiện trong các năm 1993-
1994, Thực hiện: TS.Trương Thị Hòa và các công tác viên Viện Công nghiệp thực phẩm.
Protease của Aps. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện
xử lý bia tốt hơn. [8]
1.2.3.2. Tình hình sản xuất enzyme Protease trên thế giới
Trong các Protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn cả. Năm
1857, Corvisart tách được tripxin từ dịch tụy, đó là Protease đầu tiên nhận được ở dạng chế
phẩm. Năm 1861 Brucke cũng đã tách được Pepxin từ dịch dạ dày Chó ở dạng tương đối
tinh khiết. Ngoài các enzyme của hệ tiêu hóa, người ta cũng đã quan sát đầu tiên về các
Protease trong máu [11].
Các Protease thực vật được phát hiện muộn hơn. Năm 1879 Wurtz được xem là
người đầu tiên tách được Protease thực vật. Đến nay người ta đã nghiên cứu được khá đầy
đủ về cấu trúc phân tử của nhiều Protease như: papain, tripxin, kimotripxin, subtilizin…
[11].
Các Protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950, mặc dù
từ năm 1918- 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải Protein của Xạ khuẩn.
Trong hơn 10 năm nay số công trình nghiên cứu Protease vi sinh vật tăng lên đáng kể nhiều
hơn các Protease của động và thực vật. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực này đã góp
phần mở rộng quy mô sản xuất chees pha enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế [11].
Trong CNTP, người ta sử dụng Protease để sản xuất phomat từ sửa (Mohanty et
al.,1999), xản xuất bánh từ bột mì (Hozova et al., 2003) hay chế biến các sản phẩm giàu
protein từ đậu tương (Ghazi et al., 2003; Ma et al., 2004); trong công nghiệp thuộc da,
Protease được dùng để thủy phân một số thành phần phi collagen của da và loại bỏ các
protein phi fibrin như albumin, globulin (Gupta, Rammani, 2006); trong chất tẩy rửa,

“rennin” có trong ngăn thứ tư dạ cỏ bê non dưới 5 tháng tuổi
Tuy nhiên, để sử dụng rộng rãi trong công nghiệp, protease động vật ít thuận lợi do
sản xuất chúng bị hạn chế và nguồn nguyên liệu thu nhận enzyme không lớn lắm
- Thực vật : Từ các thực vật bậc cao người ta cũng thu được một số chế phẩm
enzyme quan trọng
Vd : Papain thu từ mủ đu đủ xanh, Bromelin từ than cây dứa… Lượng enzyme thu
được từ các nguyên liệu thực vật không lớn lắm so với lượng nhiên liệu tiêu hao
- Vi sinh vật :Hai nguồn nguyên liệu trên không thể dùng dùng nguyên liệu trong
sản xuất công nghiệp qui mô lớn do những hạn chế về nguyên liệu và công nghệ. Vì vậy,
dùng enzyme từ vi sinh vật sẽ khắc phục được các hạn chế trên.
+ Nguồn nguyên liệu vô hạn
+ Hệ enzyme phong phú
+ Hoạt tính mạnh
+ Có khả năng tăng cường sinh tổng hợp enzyme nhờ chọn giống
+ Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực nhanh
+ Thức ăn nuôi dễ kiếm, rẻ riền.
1.2.4. Ứng dụng của enzyme protease />enzyme-protease.206830.html