LỜI MỞ ĐẦU
Ngay từ thời cổ xưa, vi sinh vật đã được con người sử dụng để chế biến và sản xuất thực
phẩm, nó là một bộ phận trong khẩu phần ăn của con người và các loài vật nuôi. Ngày nay
việc sản xuất protein từ nguồn vi sinh vật không chỉ nhằm mục đích sử dụng để làm thức
ăn, mà sản xuất protein từ vi sinh vật được trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Protease là enzyme hiện nay được sử dụng nhiều nhất trong một số ngành sản xuất như:
Chế biến thực phẩm ( đông tụ sữa dùng làm phomat, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng
chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…),
sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…
Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã
được cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Protease
phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú
nhất và có nhiều ưu điểm nhất như: có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc, xạ
khuẩn…, có hoạt tính mạnh chỉ cần một lượng nhỏ có thể chuyển hóa một lượng cơ chất
lớn, có cường độ sinh sản rất mạnh và tổng hợp enzyme với tốc độ rất nhanh chóng, trong
một thời gian ngắn có thể thu được một lượng enzyme lớn….Có thể nói vi sinh vật là
nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ
và đời sống. Đây cũng chính là lý do em chon đề tài “ Nghiên cứu quy trình sản xuất
enzyme protease từ vi sinh vật”
Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về enzyme
1.1.1. Định nghĩa enzyme[1] co thanh nga
Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học, là
chất xúc tác sinh học có ý nghĩa đặc biệt quan trọng như: cường lực xúc tác lớn, sự
chuyển hóa cơ chất mạnh….
1.1.2. Thành phần cấu tạo của enzyme[2]co thanh nga
Cũng như protein, enzyme có thể là protein đơn giản hoặc protein phức tạp. Trên cơ sở đó,
người ta phân enzyme thành hai nhóm: Enzyme một thành phần (enzyme một cấu tử) và
enzyme hai thành phần (enzyme hai cấu tử).
Phần protein của enzyme hai thành phần được gọi là apoprotein hay apoenzyme, còn phần
không phải protein gọi là nhóm ngoại hoặc coenzyme. Phần không phải protein thường là

dụ:calcineurin . Các ức chế miễn dịch thuốc FK506 và Cyclosporin A là những chất
ức chế calcineurin.
4. Lyases xúc tác sự phân tách của CC, CO, CS và CN trái phiếu bằng các phương
tiện khác hơn so với thủy phân hoặc quá trình oxy hóa. Tên gọi thông thường bao
gồm decarboxylase, aldolase.
5. Isomerase xúc tác tái sắp xếp nguyên tử trong một phân tử . Ví dụ như rotamase,
isomerase disulfide protein (PDI), epimerase và racemase.
6. Ligases xúc tác cho phản ứng mà tham gia hai phân tử. Các ví dụ bao gồm các
enzym tổng hợp peptide, aminoacyl-tRNA synthetase, DNA ligase và RNA ligase.
1.1.4. Trung tâm hoạt động của enzyme[2]co thanh nga
Trung tâm hoạt động của enzyme là phần của phân tử enzyme trực tiếp kết hợp với
cơ chất, tham gia trong việc tạo thành và chuyển hóa phức chất trung gian giữa
enzyme và cơ chất để tạo thành sản phẩm phản ứng. Trung tâm hoạt động bao gồm
nhiều nhóm chức năng khác nhau của amino acid, phân tử nước liên kết và nhiều
khi có cả cofactor hữu cơ (coenzyme) và vô cơ.
Theo quan niệm của Fisher thì trung tâm hoạt động của enzyme đã được hình thành
sẵn với một cấu tạo nhất định chỉ cho phép cơ chất có cấu tạo tương ứng kết hợp
vào. Do đó có thể ví sự tương ứng đó như ”ổ khóa với chìa khóa”.
Còn theo Koshland thì đặc điểm của vùng trung tâm hoạt động là rất mềm dẻo và
linh hoạt , các nhóm chức năng của trung tâm hoạt động của enzyme tự do chưa ở
tư thế sẵn sàng hoạt động, khi tiếp xúc với cơ chất, các nhóm chức năng ở trong
phần trung tâm hoạt động của phân tử enzyme thay đổi vị trí trong không gian, tạo
thành hình thể khớp với hình thể của cơ chất. Cũng vì vậy, người ta gọi mô hình
này là mô hình “tiếp xúc cảm ứng” hoặc “khớp cảm ứng”.
Giữa cơ chất và trung tâm hoạt động tạo thành nhiều tương tác yếu, do đó có thể dễ
dàng bị cắt đứt trong quá trình phản ứng để giải phóng ezyme và sản phẩm phản
ứng.
1.1.5. Tính đặc hiệu của enzyme[2] co thnah nga
Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất
định theo một kiểu phẩn ứng nhất định. Đặc tính tác dụng lựa chọn cao này gọi là

cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các phần tham gia tạo thành
mối liên kết đó.
Ví dụ: Lipase có khả năng thủy phân được tất cả các mối liên kết este.
d) Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể)
Hầu như tất cả các enzyme đều có tính đặc hiệu không gian rất chặt chẽ,
nghĩa là enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân không gian
của cơ chất.
Ví dụ: Phản ứng khử nước của malic acid để tạo thành fumaric acid dưới tác
dụng của fumarathydratase chỉ xảy ra đối với L-malic acid mà không tác
dụng lên D-malic acid.
1.2. Tổng quan về enzyme protease
1.2.1.Giới thiệu chung về protease
1.2.1.1. Định nghĩa về enzyme protease
Protease là enzyme thủy phân các liên kết peptid (-CO-NH-)n trong phân tử protein giải
phóng các acid amin, pepton hoặc ditripepton.
Hình 1.2. Cấu trúc không gian enzyme protease
1.2.1.2. Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của Protease [7]
Trong TTHĐ của Protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trưng cho từng nhóm
còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của một số
Protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau:
- TTHĐ của Protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và trong một số trường hợp
còn có cả cofactơ kim loại.
+ Các Protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 21
0
A, có thể phân biệt thành
sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương ứng với mỗi gốc aa trong
phân tử cơ chất.
+ Đối với các Protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của các tinh thể
Protease acid của Phizopus chinenis và Endothia parasilica đã cho thấy phân tử các
Protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 20

2
Hình 1.4 Cơ chế xúc tác TTHĐ Enxyme
Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase đươ
̣
c phân chia tha
̀
nh hai
loa
̣
i:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:
+ Serin proteinase: là những proteinase chư
́
a nhóm –OH của gốc serine trong trung
tâm hoạt động va
̀
có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của
enzyme.
+ Cysteine proteinase: Các proteinase chư
́
a nhóm –SH trong trung tâm hoạt động.
Như: papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng.
+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Có chứa
nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung
tính.

Protease từ ruột cá Basa (Pangasius bocourti). Dịch chiết protease kiềm thu được từ ruột có
tổng hoạt tính cao nhất là 15,79UI/gCKNT (chất khô nội tạng) trong điều kiện chiết: tỷ lệ
mẫu/dung môi 1/1(w/w); pH 9,5; nhiệt độ 35oC; thời gian chiết 10 phút. [14].
+ Tối ưu một số điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6
sinh tổng hợp Prơtease được thực hiện của Quyền Đình Thi, Trần Thị Quỳnh Anh,
Nguyễn Thị Thảo (2007), viện CNSH đã chứng minh các điều kiện thuận lợi nhằm nuôi
cấy với hiệu suất cao nhất đối với chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6 sinh tổng
hợp Prơtease [15].
+ Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn, Phạm Thị Ánh
Hồng, Đại học Cần Thơ, Trường ĐHKH Tự nhiên, ĐH Quốc Gia TP Hồ Chí Minh đã tiến
hành “Tinh sạch và khảo sát đặc điểm của các Serine Protease từ Trùn Quế” ( 2007).
Bước đầu khảo sát hệ enzyme Protease từ trùn quế (Perionyx excavatus) cho thấy phần lớn
các protease trong dịch chiết enzyme thô có thể tinh sạch sơ bộ bằng tủa phân đoạn với
ammonium sulfat nồng độ trong khoảng 30-80%. Nhiệt độ và pH tối ưu cho enzyme thô
hoạt động trên cơ chất casein là 55
0
C và pH trong khoảng kiềm 10 -12. [16],[4].
+ “Nghiên cứu ứng dụng Protease bacillus subtilis trong sản xuất bột đạm thủy
phân từ cá Mối”, Vũ Ngọc Bội, trường Đại học thủy sản Nha Trang. Qua nghiên cứu cho
thấy protease B. subtilis có thể thủy phân mạnh mẽ cơ thịt cá mối và hoàn toàn có thể sử
dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân. Khi bổ sung protease B. subtilis với
nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp cơ thịt cá mối và thủy phân ở 50
0
C.
+ Nghiên cứu ứng dụng Protease trong sản xuất Bia, thực hiện trong các năm 1993-
1994, Thực hiện: TS.Trương Thị Hòa và các công tác viên Viện Công nghiệp thực phẩm.
Protease của Aps. oryzae đươ
̣
c du
̀

(60%) (Rao et al., 1998) [13].
Từ năm 1950 trở lại đây trên thế giới có hàng loạt Protease động vật, thực vật và vi
sinh vật được tách chiết nghiên cứu. Thời gian gần đây các nhà khoa học trên thế giới tập
trung nghiên cứu về Protease vi sinh vật và đã đạt nhiều thành tựu to lớn về lĩnh vực này
(Protease từ vi sinh vật chiếm tới 40% tổng doanh thu của enzyme toàn thế giới (Godfrey
west, 1996) [13]). Hiện nay, số lượng các enzyme được sản xuất hàng năm trên thế giới, ở
các nước phát triển nhất là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản vào khoảng 300.000 tấn với doanh
thu từ sản xuất enzyme ước tính vào khoảng 500 triệu USD. Trong đó khoảng 600 tấn
Protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vật bao gồm khoảng 500 tấn từ vi khuẩn và
100 tấn từ nấm mốc. Những nước có công nghệ sản xuất và ứng dụng Protease tiên tiến
trên thế giới là: Đan Mạch, Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đức, Áo. Các
nước này đã đầu tư thích đáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Protease từ
VSV. Chính vì thế nhịp độ sản xuất Protease ở quy mô công nghiệp tại các nước phát triển
hàng năm tăng vào khoảng 5%- 10%. Ngày nay người ta có thể sản xuất các enzyme cố
định trên các chất mang không tan cho phép có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần. Vì vậy
mà việc ứng dụng Protease ngày càng gia tăng[4],[1].
1.2.3. Nguồn thu nhận enzyme protease TRƯ ỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐẠI HỌC QU ỐC GIA TP HCM KHOA KỸ
THUẬT HÓA HỌcBÀI BÁO CÁO MÔN HÓA SINH THỰC PHẨMNGUỒN THU NHẬN VÀ ỨNG DỤNG PROTEASE
Enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của sinh vật; nhưng để thuận lợi về kinh tế,
người ta chỉ dùng những vật liệu cho phép thu một lượng lớn enzyme với hiệu suất cao.
Hiện nay chúng ta sử dụng 3 nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản để thu nhận
protease :
- Động vật : Thông thường protease động vật có ở tuyến tiêu hóa (niêm mạc dạ dày,
niêm mạc ruột non, tuyến tụy…).
Vd: Pepsin từ niêm mạc dạ dày và dịch vị của động vật bậc cao. Chymosin
“rennin” có trong ngăn thứ tư dạ cỏ bê non dưới 5 tháng tuổi
Tuy nhiên, để sử dụng rộng rãi trong công nghiệp, protease động vật ít thuận lợi do
sản xuất chúng bị hạn chế và nguồn nguyên liệu thu nhận enzyme không lớn lắm
- Thực vật : Từ các thực vật bậc cao người ta cũng thu được một số chế phẩm
enzyme quan trọng