Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật
Đề tài
Thu nhận enzyme
Protease từ vi sinh vật
và những ứng dụng
của enzyme Protease
SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 1
Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật
MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU
Protease là một trong những enzyme được ứng dụng rất nhiều trong mọi lĩnh vực,
trong đó, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm Protease đã có những đóng góp rất to lớn trong
việc phục vụ, nâng cao đời sống của con người. Hiện nay trên thế giới công nghệ thu nhận
Protease từ vi sinh vật hiện còn đang phát triển, tìm tòi nghiên cứu về khả năng ứng dụng
vô vàn của enzyme Protease. Ở Việt Nam cũng có nhiều công trình công bố về việc nghiên
cứu sử dụng Protease chủ yếu tập trung vào các Protease thực vật và động vật còn Protease
vi sinh vật chỉ được nghiên cứu trong hơn chục năm trở lại đây.
Công nghệ enzyme ở nước ta hiện còn rất mới mẽ, đang trong giai đoạn hưởng ứng
và ngày hoàn thiện dần lĩnh vực này trong tương lai. Do vậy việc đi sâu và tìm hiểu enzyme
Protease, nguồn thu nhận Protease từ vi sinh vật cũng như những ứng dụng của nó là một
đề tài mang tính thời đại, cấp thiết trong tình hình Việt Nam đang hội nhập mạnh mẽ với
nền kinh tế thế giới.
Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp
Protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy
nhiên giá thành Protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme
trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là
SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 2
Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật
chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chiếm 20-30% [6]. Vì vậy, việc nghiên cứu cải
tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất
cần thiết.

vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ Protease vi sinh vật là một hệ thống
rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng
phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên Protease vi sinh vật thường
có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng.

1.1.2 Đặc điểm và tính chất của Protease vi sinh vật [7]
Các công trình nghiên cứu Protease vi sinh vật ngày càng nhiều. Các kết quả nghiên
cứu cho thấy ngay cả các Protease của cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác nhau về
nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động thích hợp,… các nhà khoa học
đã phân loại các Protease vi sinh vật thành bốn nhóm như sau:
P-xerin; P-thiol; P-kim loại; P-acid
SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 4
Hình 1.2. Cấu trúc không gian enzyme Protease
Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật
Một số tác giả khác chia Protease ra ba nhóm, dựa vào hoạt động pH của chúng bao
gồm: Protease-acid; Protease trung tính;
Protease kiềm.
Trong bốn Protease kể trên, các
Protease-xerin và Protease-thiol có khả
năng phân giải liên kết este và liên kết
amide của các dẫn xuất acid của aa.
Ngược lại các Protease kim loại,
Protease acid thường không có hoạt tính
esterase của các dẫn suất của aa.
Nhiều Protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân
tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng
phân tử của các enzyme này tương đối bé, nhất là các P-xerin.
Các P-xerin có trọng lượng phân tử thấp vào khoảng 20.000 – 27.000 Dalton. Tuy
nhiên, cũng có một số P-xerin có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme của

Ps.cloromer-
curbenzoat
-SH 7,5
7,0
P kim
loại
Bac.subtilus
Bac.subtilus NRRL B3411
Bac. Subtilisamy
Losaccarilicis
Bac. Megaterium
Psuedomonasaeruginoa
Atreptomeces naraensis
Asp. Oryzae
Acremonium kiliense
Clostridiumhisttolytium
EDTA
++
1,10octa-
fenantrolin
Kim loại hóa
trị hai
Trung
tính
P Acid Asp.niger
Asp.Awamori
Sailoi,penicillium
Janthinellum
Rhizopus chinensis
Mucor pucillus

: Là sản
phẩm đầu tiên của phản ứng, P
2
: Là sản phẩm thứ hai của phản ứng.
1.2. Nguồn thu nhận Protease [3]
- Enzyme là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc tác
cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi sinh vật đều được xem là nguồn thu nhận để
sản xuất enzyme. Nhưng vẫn chủ yếu là ba nguồn chính: Động vật, thực vật và vi sinh vật.
- Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi
sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ
khuẩn… có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở
quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống [3].
- Enzyme Protease từ nguồn động vật và thực vật được loài người khai thác và ứng
dụng hàng ngàn năm để sản xuất và phục vụ trong cuộc sống. Nhưng hiện nay lượng
enzyme thu nhận từ thực vật và động vật được thay thế dần bằng enzyme vi sinh vật.
enzyme thu nhận từ các nguồn này thường rất khó và hiệu quả kinh tế không cao. Nguồn
SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 7
E + S enzyme – S enzyme – S + P
1
enzyme + P
2
Hình 1.4 Cơ chế xúc tác TTHĐ Enxyme
Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật
enzyme từ vi sinh vật dần dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật do hàng loạt những
ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và về kỹ thuật sản xuất được liệt kê như sau:
+ Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối lượng cơ
thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm.
+ Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao.
+ Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu được lượng
sinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu được một lượng enzyme

tổng hoạt tính cao nhất là 15,79UI/gCKNT (chất khô nội tạng) trong điều kiện chiết: tỷ lệ
mẫu/dung môi 1/1(w/w); pH 9,5; nhiệt độ 35oC; thời gian chiết 10 phút. [14].
+ Tối ưu một số điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6
sinh tổng hợp Prơtease được thực hiện của Quyền Đình Thi, Trần Thị Quỳnh Anh, Nguyễn
Thị Thảo (2007), viện CNSH đã chứng minh các điều kiện thuận lợi nhằm nuôi cấy với
hiệu suất cao nhất đối với chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6 sinh tổng hợp
Prơtease [15].
+ Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn, Phạm Thị Ánh
Hồng, Đại học Cần Thơ, Trường ĐHKH Tự nhiên, ĐH Quốc Gia TP Hồ Chí Minh đã tiến
hành “Tinh sạch và khảo sát đặc điểm của các Serine Protease từ Trùn Quế” ( 2007).
Bước đầu khảo sát hệ enzyme Protease từ trùn quế (Perionyx excavatus) cho thấy phần lớn
các protease trong dịch chiết enzyme thô có thể tinh sạch sơ bộ bằng tủa phân đoạn với
ammonium sulfat nồng độ trong khoảng 30-80%. Nhiệt độ và pH tối ưu cho enzyme thô
hoạt động trên cơ chất casein là 55
0
C và pH trong khoảng kiềm 10 -12. [16],[4].
SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 9
Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật
+ “Nghiên cứu ứng dụng Protease bacillus subtilis trong sản xuất bột đạm thủy
phân từ cá Mối”, Vũ Ngọc Bội, trường Đại học thủy sản Nha Trang. Qua nghiên cứu cho
thấy protease B. subtilis có thể thủy phân mạnh mẽ cơ thịt cá mối và hoàn toàn có thể sử
dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân. Khi bổ sung protease B. subtilis với
nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp cơ thịt cá mối và thủy phân ở 50
0
C.
+ Nghiên cứu ứng dụng Protease trong sản xuất Bia, thực hiện trong các năm 1993-
1994, Thực hiện: TS.Trương Thị Hòa và các công tác viên Viện Công nghiệp thực phẩm.
Protease của Aps. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện
xử lý bia tốt hơn. [8]
2.2. Vấn đề sản xuất enzyme Protease trên thế giới

(Protease từ vi sinh vật chiếm tới 40% tổng doanh thu của enzyme toàn thế giới (Godfrey
west, 1996) [13]). Hiện nay, số lượng các enzyme được sản xuất hàng năm trên thế giới, ở
các nước phát triển nhất là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản vào khoảng 300.000 tấn với doanh
thu từ sản xuất enzyme ước tính vào khoảng 500 triệu USD. Trong đó khoảng 600 tấn
Protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vật bao gồm khoảng 500 tấn từ vi khuẩn và 100
tấn từ nấm mốc. Những nước có công nghệ sản xuất và ứng dụng Protease tiên tiến trên thế
giới là: Đan Mạch, Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đức, Áo. Các nước
này đã đầu tư thích đáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Protease từ VSV.
Chính vì thế nhịp độ sản xuất Protease ở quy mô công nghiệp tại các nước phát triển hàng
năm tăng vào khoảng 5%- 10%. Ngày nay người ta có thể sản xuất các enzyme cố định trên
các chất mang không tan cho phép có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần. Vì vậy mà việc
ứng dụng Protease ngày càng gia tăng[4],[1].
SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 11
Hình 3.1
Baccillus subtilis
Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật
Phần III - Đặc điểm nguồn vi sinh vật thu nhận enzyme protease
- Trong nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme có một số kỹ thuật chung và một số kỹ
thuật riêng. Những kỹ thuật chung bao gồm: [7]
+ Kỹ thuật tạo giống
+ Lựa chọn phương pháp nuôi cấy
+ Thiết kế thiết bị nuôi cấy
+ Kỹ thuật lên men
+ Tách, tinh chế thu nhận E.
- Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh Protease, các enzyme này có thể ở
trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy. Một số Protease ngoại bào đã sản xuất
quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, trong nông
nghiệp và trong y học.
- Nguồn vi sinh vật thu nhận enzyme Protease chủ yếu gồm: vi khuẩn, nấm mốc, xạ
khuẩn.

A. saitoi, Penicilliumchysogenum)…các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại
P: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các Protease acid, có khả năng
thủy phân protein ở pH 2,5-3 [2].
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có
khả năng tổng hợp Protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomát.
SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 13
Hình 3.2 Aspergillus
oryzae
Hình 3.3 Condium of Aspergillus oryzae

Trích đoạn Kỹ thuyật nuôi cấy Thu nhận sản phẩm: xuất thiết bị Trong sản xuất Bia

---