NGHIÊN CỨU ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG BÒ THÀNH THỤC IN VITRO BẰNG
PHƢƠNG PHÁP THUỶ TINH HOÁ VI GIỌT
Nguyễn Khánh Vân, Vũ Thị Thu Hƣơng, Nguyễn Thị Thoa,
Đỗ Văn Hƣơng, Quản Xuân Hữu
Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Động vật
Tóm tắt
Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá khả năng sống, tạo phôi sau đông lạnh-giải đông của tế bào trứng
bò thành thục in vitro được đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt. Trứng thu từ buồng trứng lò mổ được
lựa chọn, nuôi thành thục in vitro trong môi trường IVM từ 22-24h ở 38.50C, 5% CO2. Sau đó lựa chọn những tế
bào trứng thành thục in vitro loại A chuyển vào môi trường trước cân bằng (TCM 199 có bổ sung 1M EG và 20%
FCS) ở nhiệt độ phòng. Tiếp theo tế bào trứng được chuyển vào và rửa 3 lần trong môi trường đông lạnh ( TCM 199
có bổ sung 5.5M EG + 20% FCS + 1.0M sucrose). Hút 5-8 tế bào trứng/giọt cho trực tiếp vào trong dung dịch ni tơ
lỏng. Chuyển các giọt này vào trong ống chịu lạnh, bảo quản trong ni tơ lỏng. Trứng đã thủy tinh hóa được giải đông
trong môi trường giải đông (TCM 199 + 20% FCS + 1M sucrose), sau đó được nuôi in vitro từ 1-3h ở 38.5oC 5%
CO2 để đánh giá khả năng sống, tạo phôi. Tỷ lệ tế bào trứng sống sau đông lạnh-giải đông trong nghiên cứu này là
47.86%. Tỷ lệ thụ tinh đạt 13.21%, tỷ tạo phôi dâu đạt 2.86%. Tỷ lệ này thấp hơn so với đối chứng tương ứng là
56.13% và 34.78%, P < 0.05.
1. Đặt vấn đề
Công nghệ sinh học lạnh là nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thấp lên những cơ thể
sống. Trong một thời gian dài con người cho rằng nhiệt độ thấp có ảnh hưởng không tốt đến tế
bào và mô, nhưng ngày nay dựa trên những nguyên tắc cơ bản về sinh học lạnh tế bào, các nhà
nghiên cứu đã tìm ra những biện pháp đông lạnh tế bào sinh sản với mục đích bảo tồn nguồn gen
vật nuôi và những động vật quý hiếm có nguy cơ bị tuyệt chủng. Đồng thời đó cũng là nguồn
nguyên liệu cho các nghiên cứu cơ bản khác như thụ tinh ống nghiệm (IVF), Cloning, chuyển
nhân, chuyển gen… Trong chăn nuôi, quá trình sinh sản sẽ duy trì được nguồn gen từ con cái và
tế bào trứng sẽ thay thế phôi khi được lựa chọn làm con giống mang tính thương mại. Hiện nay
trên thế giới có thể đông lạnh phôi và trứng động vật có vú bằng phương pháp đông lạnh chậm
hoặc đông lạnh nhanh. Tuy nhiên so với phôi thì đông lạnh tế bào trứng của động vật có vú là
khó thành công hơn. Fuku năm 1992 và Otoi năm 1993 có báo cáo đầu tiên tạo ra bê từ trứng bò

những nang trứng có đường kính 3-8mm, sau đó để lắng rồi soi dưới kính hiển vi soi nổi để tìm
tế bào trứng.
Tế bào trứng được 2 lần trong môi trường nuôi tế bào IVM. Các tế bào trứng bò (COCs)
có từ 3 lớp màng tế bào cumulus chặt chẽ trở lên được đưa vào môi trường nuôi thành thục in
vitro trong 22-24 giờ ở 38.5
o
C, 5% CO
2

2.2.2. ĐL-GĐ tế bào trứng bò thành thục in vitro, nhuộm nhân tế bào
2.2.2.1. Đông lạnh tế bào trứng bò thành thục in vitro
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt của Kikuchi
và cs., 2006. Sau nuôi in vitro 22-24 giờ, lựa chọn những tế bào trứng thành thục in vitro loại A
rửa 3 lần trong môi trường TCM 199 rồi chuyển vào môi trường TCM 199 + 20% FCS + 1M
ethylene glycol (EG) trong 15 phút.
Tiếp sau đó chuyển tế bào trứng vào môi trường đông lạnh chứa 5.5 M EG + 20% FCS +
1.0 M Sucrose, hút 5-8 trứng /giọt (6-8μl/giọt) cho trực tiếp vào dung dịch nitơ lỏng trong vòng
30 giây. Các giọt chứa tế bào trứng đã đông lạnh được cho vào ống chịu lạnh và bảo quản trong
nitơ lỏng -196°C.
2.2.2.2. Giải đông tế bào trứng bò thành thục in vitro
Các tế bào trứng sau khi được bảo quản lạnh trong ni tơ lỏng từ 2-3 tuần sẽ được giải
đông để đánh giá tỷ lệ sống sau đông lạnh-giải đông và TTON.
Các giọt chứa trứng được lấy ra và đưa vào môi trường giải đông TCM 199 chứa 20%
FCS và 1 M Sucrose. Sau đó tế bào trứng được nuôi invitro trong môi trường IVM sau thời gian
1-3 giờ ở 38.5
o
C, 5% CO
2
.


hiện ở bảng 2. Bảng 1. Kết quả nuôi thành thục in vitro tế bào trứng bò
Đợt
TN
Số buồng
trứng (n)
Số tế bào trứng thu
được (A, B, C, D) (n)
Số tế bào trứng nuôi
thành thục in vitro
(A, B) (n)
Số tế bào trứng
thành thục in vitro (n)
A
B
C
D
1
6
62
51
35
5
1
1
2
8
82

12
124
100
72
12
2
1
7
10
106
87
55
12
2
1
8
8
78
62
44
7
3
1
9
10
102
85
58
12
2

Tế bào trứng sống (%)
1
105
42 (40)
2
92
47 (51.08)
3
90
42 (46.67)
4
84
41 (48.81)
5
108
50 (46.3)
6
106
58 (54.71)
Tổng
585
280 (47.86)

Kết quả cho thấy, tỷ lệ tế bào trứng bò thành thục in vitro sống là 47.86% (280/585). Các
tế bào trứng sống là những tế bào có lớp màng cumulus sáng và giãn nở trở lại, nhiễm sắc thể
còn nguyên vẹn không bị đứt gãy, phân tán.
Những tế bào trứng bò thành thục in vitro sống sau đông lạnh-giải đông được thử nghiệm
thụ tinh in vitro. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.
Bảng 3. Khả năng thụ tinh, tạo phôi sau ĐL-GĐ của tế bào trứng bò thành thục in vitro được
đông lạnh bằng PP thủy tinh hóa vi giọt

a
5/42 (11.9)
b
38/95 (40)
c
1/42 (2.38)
d
4
51/98 (52.04)
a
4/41 (9.76)
b
29/98 (29.6)
c
1/41 (2.44)
d
5
62/103 (60.2)
a
7/50 (14)
b
36/103 ( 34.95)
c
1/50 (2.0)
d
6
55/ 98 (56.12)
a
10/58 (17.24)
b

độ đông lạnh và giảm bớt nguy cơ hình thành tinh thể đá làm tổn thương tế bào trong quá trình
hạ nhiệt cũng như nâng nhiệt. Với các ưu điểm trên chúng tôi lựa chọn phương pháp thủy tinh
hóa vi giọt cho thí nghiệm của mình.
Trong nghiên cứu này, tỷ lệ tế bào trứng bò thành thục in vitro sống sau đông lạnh-giải
đông, tỷ lệ thụ tinh trong ống nghiệm và tỷ lệ tạo phôi của trứng bò thành thục in vitro sống sau
đông lạnh-giải đông tương ứng là 47.86%, 13.21% , 2.86% thấp hơn so với một số báo cáo
khác. Trong báo cáo của Dinnyes và cộng sự (2000), tỷ lệ sống của tế bào trứng bò sau đông
lạnh-giải đông là 79-85%. Còn theo Andreas Mavrides và cộng sự (2002), tỷ lệ sống của trứng
bò sau đông lạnh-giải đông là 90.5%. Tuy nhiên tỷ lệ trứng bò sống sau đông lạnh-giải đông của
nghiên cứu này cao hơn so với kết quả nghiên cứu của J.M.Lim, Y. Fukui and H. Ono năm
1991, trứng sống sau đông lạnh giải đông đạt 31.6%, tỷ lệ phôi phát triển đến 8 tế bào là 2.2 %.
Hiện nay, kết quả đông lạnh và bảo quản tế bào trứng của các giống vật nuôi như bò
(Doong-Hoon kim và cs., 2007), lợn (Tamas Somfai và cs., 1998), trâu (R.C.S YADAV và cs.,
2008), cừu (N. Grag, N.G. Purhit., 2007) đã được công bố, nhưng tỷ lệ tạo phôi từ trứng sau
đông lạnh-giải đông phát triển đến phôi nang còn rất thấp. Nguyên nhân chính là do sự tổn
thương của trứng trong suốt quá trình đông lạnh-giải đông như sự hóa rắn của màng
zonapellucida, sự đứt gãy nhiễm sắc thể…. Đa số các nghiên cứu về đông lạnh tế bào trứng bò
đều cho rằng khả năng sống và phát triển của trứng bò thành thục sau đông lạnh-giải đông cao hơn so với trứng chưa thành thục, các tác giả cho rằng nguyên nhân là do trứng bò thành thục có
khả năng thấm màng cao hơn trứng chưa thành thục. Chính vì vậy trong nghiên cứu này chúng
tôi dùng trứng bò thành thục in vitro loại A để đông lạnh. Kết quả của nghiên cứu này còn thấp
có rất nhiều lý do, có thể là do màng nguyên sinh chất bị tổn thương, sự tăng lên của tế bào chất
không bình thường trong trứng, sự tổn thương của thoi vô sắc hoặc sự thay đổi cấu trúc của vành
trong suốt trong quá trình đông lạnh, đây là vấn đề mà chúng tôi còn phải tiếp tục nghiên cứu.
Mặc dù kết quả đạt được của chúng tôi trong nghiên cứu này chưa cao nhưng cũng khẳng
định rằng khả năng đông lạnh tế bào trứng bò thành thục in vitro bằng phương pháp thủy tinh
hóa vi giọt của Viện Chăn nuôi bước đầu đã thành công.
4. Kết luận

12. Grag N, Purohit N.G 2007. Effect of different cryoprotectant concentrations for ultrarapid freezing of immature goat follicular oocytes on their subsequent maturation and fertilization invtrro.
Anim.Reprod.,V.4, n.3/4, p. 113-11813.
13. Hamano S, Koikeda A, Kuwayama M & Nagai T 1992. Full-term development of in vitro-matured,
vitrified and fertilized bovine oocytes. Theriogenology 38 1085–1090.
14. Otoi T, Tachikawa S, Kondo S, Suzuki T 1993. Developmental capacity of bovine oocytes frozen in
different cryoprotectants. Theriogenology; 40:801–807.
15. Tamas Somfai, Andras Dinnyes, Dagma Sage, Miklos Marosan, Joseph W, Carnwath, Manbu Ozawa,
Kazuhiro Kikuchi, Heiner Niemann 2006. Theriogenology; 66 : 415-422.
16. Vajta G, Kuwayama M, Booth PJ, Holm P, Greve T, Callesen H 1998. Open pulled straw (OPS)
vitrification of cattle oocytes. Theriogenology; 49:176.
17. Yadav R. C. S, Sharma A and Purohit G. N (2008). Survival of vitrified water buffalo cumulus oocytes
complexes and their subsequent development in vitro. Bulgarian Jounal of Veterinary Medicine, 11, No 1,
55-64.