NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH TINH DỊCH NGỰA
DẠNG CỌNG RẠ
Vũ Đình Ngoan,
1
Đào Đức Thà, Đặng Đình Hanh, Nguyễn Hữu Trà,

Nguyễn Văn Đại, Dương Thị Thư
Trung tâm Nghiên cứu và PTCN miền Núi
1
Bộ môn Sinh lý Sinh hoá và Tập tính Vật nuôi
Tóm tắt
Ở Việt Nam thụ tinh nhân tạo cho ngựa là công việc còn rất mới mẻ. Trung tâm nghiên cứu và phát triển
chăn nuôi miền núi đang củng cố, nâng cao chất lượng đàn giống, phổ biến giống mới và làm tươi máu những đàn
giống hiện có cũng như bảo tồn phát triển các giống ngựa quý hiếm. Nhằm đáp ứng nhu cầu khai thác tiềm năng di
truyền của con đực và nguyên liệu cho TTNT ngựa chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài với mục tiêu sản xuất tinh
đông lạnh cọng rạ ngựa có hoạt lực tinh trùng (A) sau giải đông ≥35%.
Tinh dịch ngựa có hoạt lực >70% được đưa vào sử dụng trong nghiên cứu. Trong thí nghiệm chúng tôi
nghiên cứu chế độ ly tâm, môi trường đông lạnh, phương pháp cân bằng, chế độ cân bằng, thời gian đông lạnh trong
hơi nitơ và chế độ giải đông để đánh giá hoạt lực tinh trùng sau giải đông.
Tinh dịch ngựa được lọc bỏ keo phèn, pha loãng môi trường ly tâm và được làm lạnh đến 150C trong 1.5
giờ sau đó được ly tâm trong 15 phút ở 50C (1.500v/p). Tinh ngựa đậm đặc sau ly tâm được cân bằng 2 bước: Tinh
dịch được pha lần thứ nhất với môi trường A theo tỷ lệ pha loãng là ½ thể tích cuối cùng cần đạt được (cân bằng lần
1), tinh dịch được hạ nhiệt độ từ 150C xuống đến 50C trong thời gian 1.5 giờ. Tiếp theo tinh dịch được bổ sung
thêm môi trường đông lạnh B vào 3 thời điểm là 1.5h; 2h và 2.5h. Sau đó cân bằng trong 1.5 giờ tiếp theo. Tinh
dịch sau cân bằng được tiến hành nạp tinh vào cọng rạ. Tinh dịch sau cân bằng có mật độ tinh trùng khoảng 160
triệu/ml sau đó được nạp tinh vào cọng rạ (0.5ml/cọng) để tiến hành đông lạnh. Đông lạnh ở 20 phút trong hơi nitơ
sau đó đông lạnh sâu trong nitơ lỏng. Giải đông ở 450C trong 5 giây, sau đó chuyển sang 370C trong 30 giây cho
kết quả hoạt lực tinh trùng sau giải đông tốt nhất (A 35.60%). Hoạt lực tinh trùng sau giải đông được đánh giá bằng
phần mềm Sperm Vision 3.0.

C trong 2 giờ.
Phương pháp ly tâm: Tinh dịch sau khi được làm lạnh đến 15
0
C, tinh pha được ly tâm
trong 15 phút ở 5
0
C với 2 chế độ ly tâm 1.500v/p và 2000 v/p. Bỏ phần dung dịch trên ống ly
tâm, lấy phần đậm đặc lắng ở đáy ống.
Tinh dịch sau ly tâm được pha môi trường đông lạnh A, B, mật độ tinh trùng có khoảng
80 triệu tinh trùng/cọng rạ sau đó nạp tinh vào cong rạ và tiến hành đông lạnh. Khi pha loãng
tinh dịch môi trường A và môi trường B phải bằng nhau về thể tích khi cân bằng. Trong 1 một
môi trường đông lạnh chúng tôi chia làm 2 loại môi trường: Môi trường A không có thành
phần glyceryl. Môi trường B có thêm thành phần glyceryl.
Cân bằng 1 bước:
Tinh dịch đậm đặc thu được sau ly tâm được pha ngay với môi trường đông lạnh A,B rồi
hạ nhiệt độ từ 15
0
C xuống 5
0
C trong 1.5giờ và tiếp theo để cân bằng trong 2.5giờ ở 5
0
C sau đó
tiến hành nạp tinh vào cọng rạ.
Cân bằng 2 bước: (bổ sung MT đông lạnh B vào 1 lần)
Tinh dịch đậm đặc thu được sau ly tâm được bổ sung môi trường A theo tỷ lệ pha loãng
là ½ thể tích cuối cùng cần đạt được (cân bằng lần 1) hạ nhiệt độ từ 15
0
C xuống đến 5
0
C trong

C trong 5 giây sau đó chuyển sang 37
0
C trong 30 giây.
Đánh giá hoạt lực tinh trùng sau giải đông: Dùng micropipet hút 0.23l tinh dịch sau giải
đông (đã được pha loãng bằng môi trường MTS) nhỏ lên phiến kính chuyên dụng (dùng riêng cho
phần mềm Sperm Vision) có nhiệt độ ổn định 37
0
C và đánh giá bằng phần mềm Sperm Vision 3.0
(hãng Minitub , Đức).
Phương pháp xử lý số liệu: Một số chỉ tiêu tinh dịch được đánh giá bằng phương pháp
thường quy và phần mền Sperm Vision 3.0. Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê
miêu tả (Display Descriptive Statistics) qua phương pháp kiểm tra ANOVA của phần mềm
Minitab 13. Số liệu được hiển thị dạng MeanSE, với P<0.05 có sai khác về ý nghĩa thống kê.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Chất lượng tinh nguyên
Tinh nguyên sau khi khai thác được đánh giá các chỉ tiêu sinh học: Thể tích tinh dịch (V,
ml), mầu sắc tinh dịch, hoạt lực tinh trùng (A, %), nồng độ tinh trùng (C, triệu/ml), tổng số tinh
trùng tiến thẳng (VAC, tỷ/lần), pH tinh dịch, áp suất thẩm thấu (ASTT), tỷ lệ tinh trùng kỳ hình.
Kết quả được đánh giá ở bảng 1. Bảng 1. Một số chỉ tiêu tinh dịch ngựa
Chỉ tiêu
ĐVT
Ngựa Cabardin
n
X  SE
V
ml
10

mOsm/kg
10
308,67  2,91
Mầu tinh nguyên
Trắng, trắng nhạt
(n là số mẫu tinh nguyên khai thác ở các lần trên cùng một cá thể ngựa)

Qua bảng 1 cho thấy: Thể tích tinh dịch mỗi lần khai thác với ngựa 62ml, Hoạt lực đều
>70%, tổng số tinh trùng là 132 triệu/ml. Keo phèn tinh ngựa là ~16ml/lần khai thác (20%). Kết
quả nghiên cứu về tinh dịch ngựa của một số tác giả :
Theo Mann (1981) tinh dịch ngựa có nồng độ: 100-150 trệu/ml.
Theo kết quả bảng 1 cho thấy, tinh ngựa đủ tiểu chuẩn trước khi tiến hành các bước đông
lạnh tinh dịch.
3.2. Ảnh hưởng của chế độ ly tâm đến một số chỉ tiêu sinh lý của tinh trùng
Theo Vidament (1997) tinh dịch ngựa sau khi khai thác được lọc bỏ keo phèn và đánh giá
hoạt lực phải được pha loãng ngay sau 2-15 phút với nồng độ tinh trùng đạt khoảng 60triệu/ml
rồi hạ nhiệt độ để ly tâm.
Ly tâm là một khâu rất quan trọng trong quy trình đông lạnh tinh dịch ngựa. Chế độ ly tâm
tốt sẽ loại bỏ được nhiều nhất tinh thanh, thu được lượng tinh trùng tối đa trong tinh dịch, đồng
thời không gây những tổn thương đến cấu trúc của tinh trùng. Tinh ngựa sau khi khai thác lọc bỏ
keo phèn và để ở nhiệt độ 5
0
C trong 1.5h đến 2h sau đó ly tâm. Kết quả cho thấy ảnh hưởng của
chế độ ly tâm đến một số chỉ tiêu của tinh trùng được thể hiện ở bảng 2 như sau:
Bảng 2. Một số chỉ tiêu tinh dịch ngựa trước và sau ly tâm ở 2 tốc độ ly tâm
Chỉ tiêu
ĐVT
Sau khi pha môi
trường ly tâm
Sau ly tâm

C
triệu/ml
66,30 2,41

2297,5
a
 80,30

2384,5
b
 76,60

K
%
12,50  0,17

14,60
a
 0,16

14,98
a
 0,13

R

3200,3  49,12

n
Hoạt lực A (%)
Kỳ hình K (%)
Môi trường 1
10
64,86  0,29

17,60  0,28

Môi trường 2
10
68,80  0,43

17,73  0,32

Môi trường 3
10
62,53  0,37

18,20  0,27Với tinh ngựa trong thí nghiệm này, sau ly tâm chúng tôi pha với môi trường đông lạnh
để đạt nồng độ cuối cùng là ≥160 triệu tinh trùng/ml.
Qua bảng 3 cho thấy: Hoạt lực tinh trùng của tinh dịch ngựa ở môi trường đông lạnh 2
cho kết quả tốt nhất (68,8%). Tỷ lệ kỳ hình tinh trùng ở 3 môi trường đông lạnh không khác biệt
nhiều (17,6-18,2%).
3.4. Ảnh hưởng của chế độ cân bằng đến hoạt lực của tinh trùng trước, và sau giải đông
Sử dụng phương pháp ly tâm 1 và môi trường đông lạnh 2 để nghiên cứu ảnh hưởng của
chế độ cân bằng đến hoạt lực tinh trùng. Kết quả thể hiện bảng 4

bước (bổ sung MT đông lạnh B vào 3 lần) cho kết quả tốt nhất (35,60%). Có sự sai khác rõ rệt về
hoạt lực tinh trùng sau giải đông ở 3 phương pháp cân bằng nói trên.
Vidament (1997). Với tinh dịch ngựa trước khi ly tâm, tốc độ làm lạnh vừa phải từ 37
0
C
đến 4
0
C trong 1h cho kết quả hoạt lực tinh trùng sau giải đông (45%) so với khi sử dụng làm
mát chậm 37
0
C đến 4
0
C trong 4 giờ cho A sau giải đông là 39%; (P <0,05)
3.5. Ảnh hưởng của thời gian đông lạnh trong hơi nitơ đến hoạt lực tinh trùng và tỷ lệ kỳ
hình sau giải đông
Giai đoạn đông lạnh trong hơi nito là bước đông lạnh trung gian giữa 5
0
C với đông lạnh
sâu (-196
0
C). Trong hơi nitơ nhiệt độ khoảng -80
0
C.
Sử dụng phương pháp ly tâm 1, môi trường đông lạnh 2, CB 2 bước bổ sung môi trường
B vào 3 lần để nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đông lạnh trong hơi nitơ đến hoạt lực tinh
trùng. Kết quả nghiên cứu thời gian đông lạnh trong hơi nitơ đến hoạt lực tinh trùng và tỷ lệ kỳ
hình sau giải đông được thể hiện trong bảng 5 như sau:
Bảng 5. Ảnh hưởng của thời gian đông lạnh trong hơi nitơ đến hoạt lực tinh trùng và tỷ lệ kỳ
hình sau giải đông
Thời gian đông lạnh


Theo Boyle (1996) tinh ngựa có hoạt lực sau giải đông >35% là đạt, 30-35% có thể chấp
nhận được, hoạt lực <30% là kém.
Theo Vidament (1997). Có một mối quan hệ mạnh mẽ về hoạt lực tinh trùng giữa chất
lượng tinh dịch trước đông lạnh và sau đông lạnh (P <0,001).
Theo Davies (1999) tốc độ hạ nhiệt được tổng kết cho quy trình đông lạnh tinh ngựa đạt
kết quả tốt nhưa sau:
Giai đoạn nhiệt độ (
0
C)
5 đến -10
-10 đến -100
-100 đến -140
Đông lạnh sâu
trong nitơ lỏng
(-196
0
C)
Tốc độ hạ nhiệt (
0
C/phút)
10
20
60

3.6. Ảnh hưởng của chế độ giải đông đến hoạt lực tinh trùng
Chế độ giải đông là khâu quan trọng làm ″thức tỉnh″ khả năng hoạt động của tinh trùng.
Một chế độ giải đông tốt sẽ đánh thức được nhiều tinh trùng hoạt động trở lại với khả năng hoạt
động với chức năng cao nhất.
Sử dụng phương pháp ly tâm 1, môi trường đông lạnh 2, CB 2 bước bổ sung môi trường

45
0
C ở 5 giây, tiếp 37
0
C trong 30 giây
10
35,60  0,33Kết quả bảng 6 cho thấy: Ở phương pháp giải đông 45
0
C ở 5 giây, tiếp 37
0
C trong 30
giây cho kết quả cao nhất. Không có sự sai khác về hoạt lực tinh trùng sau giải đông ở nhiệt độ
37
0
C trong 50 giây, 39
0
C trong 30 giây và 50 giây. Ngược lại có sự sai khác về hoạt lực của tinh
trủng ở chế độ giải đông 37
0
C trong 30 giây so với các phương pháp khác trên.
Đào Đức Thà (2007). Hoạt lực tinh trùng ngựa trước khi đông lạnh là 69,14% và sau khi
tan băng trung bình đạt 33,78%.
Theo Kuisma (2006), nên giải đông cọng rạ 0.5ml/cọng nhiệt độ giải đông 37
0
C ít nhất
30 giây, cọng rạ 2.5ml/cọng ứng với 50
0

0
C ở 5 giây, tiếp 37
0
C trong 30 giây
(với cọng rạ 0.5ml/cọng) cho kết quả cao nhất (A=35,60%).
4.2. Đề nghị
Đề nghị công nhận đông lạnh tinh dịch ngựa dạng cọng rạ là tiến bộ kỹ thuật.
Tiến hành thụ tinh nhân tạo bằng tinh đông lạnh ngựa để đánh giá tỷ lệ thụ thai.
Tài liệu tham khảo
1. Đào Đức Thà, Vũ Đình Ngoan, Đặng Đình Hanh, Nguyễn Hữu Trà, Trịnh Văn Thân, Vũ Ngọc Hiệu, Phan
Văn Kiểm và Trần Văn Đường, 2007. Kết quả bước đầu nghiên cứu đông lạnh tinh dịch ngựa ở Việt Nam,
Tạp chí khoa học kỹ thuật chăn nuôi số 9 - Hội chăn nuôi Việt Nam.
2. Boyle, M. S, 1996. Essessing the potential fertility of frozen stallion semen. Stallion reproduction services.
143 Huntingdon Road, Cambridge CB3 ODH, UK.
3. Loomis, P. R., Amann, R. P., Sqires, E. L and Pickett, B. W, 1983. Fertility of unfrozen and frozen stallion
spermatozoa extended in EDTA-lactose-egg and packaged in straw. Journal of Animal Science 56, 687-
693.
4. Kuisma, P., Andersson, M., Koskinen. E and Katila. T, 2006. Fertility of frozen-thawed stallion semen
cannot be predicted by the currently used laboratory methods. Acta Veterinaria Scandinavica.
5. Mann, T & Lutwak-Mann, C., 1981. Male reproductive funtion and semen. New York, 193pp 1981.
6. Vidament, M., Dupere, A.M., Julienne, P., Evain, A, Noue, P,. Palmer, E, 1997. Equine frozen semen
freezability and fertility field results. Theriogenology. 1997 Oct 15. Horse Institute, National Studs and
I.N.R.A. 37380 Nouzilly, France.
7. Davies Morel. M. C. G, 1999. Equine artificial insemination, New York. N.Y, 10016 USA.
8. Cochran, J. D., Amann, R. P., Froman, D. P and Pickett, B. W, 1984. Effects of centrifugation, glycerol
level, cooling to 50C, freezing rate and thawing rate on the post thaw motility of equine spermatozoa.
Theriogenology: 1984 July: 22(1):25-38. Animal Reproduction Laboratory Colorado State University Fort
Collins, CO 80523 USA
Phụ lục. Môi trường ly tâm và môi trường đông lạnh tinh dịch ngựa
* Môi trường ly tâm tinh dịch ngựa trong thí nghiệm

ĐVT
MT 1
MT 2
MT 3
Sterile skimmed milk
ml
-
50
-
Nước cất
ml
100
50
100
Glucose
g
-
2.5
0,7
Lactose
g
11
0.15
6,6
Raffinose
g
-
0.15
-
Na-Citrate dihydrate

mg
1
1
1
Penicillin
IU
1000
1000
1000
Mannitol
g
-
-
2,1