Các phương pháp sắc kí
Nội dung
lGiới thiệu chung về sắc kí
lSắc kí khí
lSắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc kí là gì?
Vấn đề: Hỗn hợp các chất: Vitamin B1, B2, B3, B6,
B12 trong mẫu sữa bột à xác định hàm lượng từng
chất xem có đáp ứng đúng yêu cầu và số lượng đưa
ra trên bao bì của sản phẩm?
Cách giải quyết:
l Tách riêng từng chất sau đó xác định hàm lượng các
chất bằng cách đo mật thụ quang của các chất.
l Phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC): xác định
đồng thời các chất.
Hệ máy HPLC
Sắc kí đồ của mẫu gồm B1, B2, B3, B6, B12
Sơ đồ khối của
HPLC
Bình
chứa
dung môi
Bơm tạo
áp suất
cao
Bơm mẫu
Cột sắc kí
Nước thải
Xử lí và
hiển thị tín
hiệu

Cơ sở lý thuyết
F1 và F2 giữ vai trò quyết định, F3 là yếu tố ảnh hưởng không
lớn.
à Các chất khác nhau thì F1 và F2 sẽ khác nhau à di
chuyển trong cột với tốc độ khác nhau à tách khỏi nhau khi
đi ra khỏi cột .
Quá trình tách sắc kí
Nếu ghép nối cột với detector: ghi lại tín hiệu theo
thời gian, thu được sắc kí đồ̀̀
Các loại tương tác trong sắc kí (a) hấp phu trên bề
mặt rắn; (b) tương tác phân bố; (c) tương tác trao
đổi ion; (d) (size exclusion) sàng lọc kích thước
Phân loại sắc kí
l Theo pha động
¡Sắc kí khí: pha động là khí
¡Sắc kí lỏng: pha động là lỏng
¡Sắc kí chất lỏng siêu tới hạn: CO
2
lỏng
l Theo cơ chế:
¡Sắc kí hấp phụ
¡Sắc kí phân bố
¡Sắc kí ion
¡Sắc kí rây phân tử
l Theo không gian:
¡Sắc kí cột
¡Sắc kí lớp mỏng
¡Sắc kí giấy
Các đại lượng đặc trưng cho sắc kí
Thời gian lưu

l Để xác định được các
chất, peak của các chất
phải tách khỏi nhau.
(đánh giá mức độ tách
như thế nào?)
l Hệ số tách α (hệ số lưu
giữ tương đối)
R > 1.5 tách tốt!
Tăng độ phân giải?
l Tăng khoảng cách giữa các pic sắc kí, tăng thời
gian lưu thông qua k.
l Làm giảm độ rộng pic : tăng hiệu suất tách.
l Retention factor
: Hệ số lưu k
l V
S
: thể tích pha tĩnh; V
m
: thể tích pha động
l Ý nghĩa của k: k lớn, thời gian lưu dài
l Tính k từ sắc kí đồ
m
R
t
t
k
'
=
Bài tập
l1) Tính hệ số lưu của acid butyric, biết







=
w
t
w
t
N
RR
Độ rộng chân pic
Độ rộng nửa pic
Thời gian lưu
N
L
H =
Chiều dài cột
Bài tập
l Tính số đĩa lý thuyêt (n) của cột sắc kí và chiều cao đĩa
lý thuyết (H). Biết thời gian lưu: t
RA
= 280s, t
RB
= 300s,
độ rộng pic: w
A
= 14s, w

N
R
6400
15
300
1616
22
=






=






=
w
t
N
R
)(05.0
6400
320
cm

DB
γ
2=
ms
CCC
+
=
sfs
DKdC /
2
=
m
p
m
D
d
C
2
β
=
Kích thước
hạt nhồi
Hệ số khuếch
tán trong pha
động
Chiều dày pha
tĩnh
Hệ số khuếch tán
trong pha tĩnh
Tìm chiều cao đĩa lý thuyết cực tiểu

tốc độ pha động khác nhau, cho các số liệu sau:
Tốc độ (cm/s) Số đĩa lý thuyết
0.5 150 000
1 120 000
Xác định vận tốc tối ưu, chiều cao đĩa lý thuyết và số đĩa lý
thuyết ở vận tốc tối ưu đó.
Giải:
Tính chiều cao đĩa lý thuyết trong 2 thí nghiệm
Thí nghiệm 1: H
1
= 30000/150 000 = 0.02 cm
Thí nghiêm 2: H
2
= 30 000/120 000 = 0.025 cm