2/8/12
1
S!C K" L#NG
HI$U N%NG CAO
HIGH PERFORMANCE
LIQUID
CHROMATOGRAPHY
N&I DUNG
•  Ngun t!c
•  Các b" ph#n c$a HPLC
•  %ng d&ng c$a HPLC
1. NGUN T!C
•  Là phương pháp tách dựa trên 2 quá trình
•  * Hấp phụ
•  * Giải hấp phụ
•  Xảy ra liên tục giữa 2 pha:
•  * Pha tónh : thường là rắn hoặc lỏng
•  * Pha động : chất lỏng (một chất hoặc hỗn
hợp nhiều chất)
2. CÁC B& PH'N C(A HPLC
•  Ngu'n cung c(p pha )"ng
•  B*m cao áp
•  B" ph#n b*m m+u vào máy (b,ng tay/t- )"ng)
•  C"t s!c k.
•  /0u dò
•  B" ph#n ghi tín hi1u
2/8/12
2
Heä thoáng HPLC
Bình ch)a dung môi
gi*i ly c+t

một thành phần pha động (do tương tác của các chất
cần tách với pha động và pha tónh giống nhau)
•  + Nếu thay đổi thành phần pha động: tương tác giữa
chất phân tích và pha tónh, pha động sẽ thay đổi. Vì
vậy sẽ tách được các chất.
2/8/12
4
BBng: m"t sE dung môi và tính ch(t c$a chúng
Tên dung môi Nhi/t .+
sôi (
0
C)
0+ nh1t
(mN.S.m
-2
)
B21c sóng h-p
thu UV (nm)
Pentan 36 0.24 210
Cyclohexan 69 0.98 210
Tetraclorua
carbon
77 0.97 265
Toluen 111 0.59 286
Diethyl ether 35 0.25 218
Chloroform 62 0.57 245
Dichloromethane 40 0.44 235
Tetrahydrofuran 66 0.55 220
N:?c 100 1.0 -
BBng: m"t sE dung môi và tính ch(t c$a chúng (tt)

2.3. B" ph#n tiêm m+u vào c"t
•  Ing chJa m+u (sample loop)
•  Dung tích c$a loop: 5 – 100 KL
•  Th$ công/t- )"ng
2.4. C"t s!c k. (pha tFnh)
•  N*i xBy ra quá trình phân tách
•  Thép không rL dài 10 – 30 cm, ø
trong
: 1 –
10mm

•  Di1n tích bêM m>t: 50-250 m
2
/g

•  Nguyên li1u nh'i c"t: h3t có l= r=ng siêu nhN
(microporous particle) v?i kích th:?c, d3ng và
)" r=ng khác nhau
– Silica: h3t có kích th:?c nhN, di1n tích bD m>t
l?n (200 – 300 m
2
/g) và chGu )-ng ):<c áp
su(t t:*ng )Ei cao
• Silica gel (pha thu#n)/silica gel )ã ):<c
silan hóa (pha )Bo)
– Alumine, zirconium, nguyên li1u trao );i ion
2.4. C"t s!c k. (pha tFnh) (tt)
2/8/12
6
2.4. C"t s!c k. (pha tFnh) (tt)

khi ra khNi c"t
•  n6u n3p m+u phân tích g'm h=n h<p ch(t
phân tích A, B, C,… vào c"t phân tích thì
các ch(t A, B, C,… sQ ):<c tách ra khNi
nhau sau khi )i qua c"t
Minh h%a quá trình tách các ch!t A và B trong
c$t tách s&c k' Th(i gian A
B
Pha
#$ng
2.4.1.Nguyên t!c c$a quá trình
s!c k. trong c"t
•  Pha tFnh là ch(t h(p ph&: s!c k. h(p ph& pha
thu#n ho>c pha )Bo
•  Pha tFnh là ch(t trao );i ion: s!c k. trao );i
ion
•  Pha tFnh là ch(t lNng: s!c k. phân bE/chi6t
•  Pha tFnh là gel: s!c k. gel/rây phân t$
Lo3i c+t Tính ch-t c4a h5p ch-t có th6
phân tích
C"t pha th:9ng, pha
)Bo, pha t3o nEi
MW < 2000, không mang )i1n tích,
phân c-c ho>c không phân c-c, hòa
tan trong dung môi hHu c*/n:?c
C"t trao );i ion MW < 2000, mang )i1n tích, hòa tan
trong n:?c

ACN, …
•  Các ch(t có c-c sQ di chuyAn nhanh h*n các
ch(t không c-c, do )ó sQ thoát ra ngoài c"t
tr:?c.
Reverse Phase Chromatography
Core Bead
Silica or Copolymer
Hydrocarbon Phase Coating
Hydrocarbon Phase Coating
can be different chain lengths
usually 18C, 8C or 2C
OH
OH
OH
OH
Free -OH groups
on Silica
2/8/12
9
Reverse Phase Chromatography
C 18
C 2 / C 18
End Capped
C 8
C 2
Strongly
Hydrophobic
Mildly
Hydrophobic
Weakly

–  VD: mJc h(p thu UV, chL sE khúc x3,…
•  MJc )" )áp Jng c$a )0u dò tL l1 v?i sE
l:<ng m=i ch(t phân tích hi1n di1n trong
h=n h<p m+u
2.5. /0u dò (detector) (tt)
/0u dò l. t:Png
•  /" bDn cao, không làm h: h3i m+u phân tích
•  Có )" nh3y cao và cho k6t quB có tính l>p lai
(reproducible)
•  Cho )áp Jng t:*ng )'ng )Ei v?i nhHng ch(t
phân tích có c(u trúc t:*ng )'ng
•  Không thay );i khi có s- thay );i nhi1t )" ho>c
áp su(t
•  Có th9i gian )áp Jng ng!n, )"c l#p v?i v#n tEc
dòng chBy c$a dung môi giBi ly
•  DR s2 d&ng
Phân lo3i )0u dò
•  Theo dõi 1 tính ch(t hóa h5c )>c tr:ng c$a các
ch(t (dung môi giBi ly không có tính ch(t này),
phát hi1n s- hi1n di1n c$a ch(t tan trong dòng
chBy: UV, huSnh quang
•  Theo dõi s- hi1n di1n c$a 1 khEi v#t ch(t trong
dung môi giBi ly: chL sE khúc x3, h,ng sE )i1n
môi
•  …
2.5.1. /0u dò )o h(p thu tia t2
ngo3i (ultraviolet detector)
•  H1 thEng )0u dò = ngu'n sáng + thi6t bG l-a
ch5n b:?c sóng + Eng quang )i1n (phototube)
+ Eng chJa dung dGch m+u phân tích


2.5.3. /0u dò phát huSnh quang
(flourescence detector)
•  H(p thu bJc x3 c$a 1 b:?c sóng và h1 quB là
phát ra bJc x3 có b:?c sóng dài h*n có tính
phát huSnh quang
2.5.3. /0u dò phát huSnh quang
(flourescence detector)
•  H(p thu bJc x3 c$a 1 b:?c sóng và h1 quB là
phát ra bJc x3 có b:?c sóng dài h*n có tính
phát huSnh quang
–  EtBr, Acridine orange, flourescein, clorua dansyl
•  Nh3y h*n )0u dò UV, có thA phát hi1n h<p ch(t
P hàm l:<ng 1ng/ml
•  Có tính ch5n l5c cao h*n (chL cho peak khi m+u
phân tích là h<p ch(t huSnh quang)
•  Vitamin, aflatoxin, hydrocarbon th*m
2.5.4. /0u dò chL sE khúc x3
(Refractive index detector)
•  ChL sE khúc x3 = v#n tEc ánh sáng trong chân
không/v#n tEc ánh sáng trong môi tr:9ng
•  >1
2/8/12
13
•  1 tia sáng )i ngang qua 2 Eng, ):<c cho t#p
trung vD 1 m>t phUng nh3y sáng. Khi cB hai
ngCn chJa )Du có chJa pha )"ng tinh khi6t, vG
trí c$a tia t?i trên bD m>t cBm quang ):<c xem
nh: là )iAm )Ei chJng (=0)
•  Khi pha )"ng chJa h<p ch(t giBi ly v4a ra khNi

 
RI UV/VIS Fluor MS
Response Universal Selective Selective Selective
Sensitivity
4
microgram
5 nanogram 3 picogram 1 picogram
Linear
Range
10 10 10 10
Flow
Sensitive
Yes No No Yes
Temp.
Sensitive
Yes No No No
L;A CH<N DETECTOR
2.6. B" ph#n ghi tín hi1u
•  Th6 h1 cW: vQ s!c k. )', th9i gian l:u, S
peak
,
chiDu cao peak
•  Th6 h1 m?i: ph0n mDm l:u thông sE: tính
)Ei xJng, h1 sE phân giBi, x2 l., tính toán
theo yêu c0u
CHXN /IYU KIZN S[C K\
2/8/12
15
CHXN /IYU KIZN S[C K\
•  C"t

ch(t phân c-c có thA t3o c>p ion
–  Trên bD m>t ho3t )"ng: các nhóm –OH )ã bG
alkyl hóa (thay th6 -H b,ng m3ch C thUng/
vòng)
–  VD: c"t Lichrospher RP 8
–  Pha )"ng: dung môi phân c-c (MeOH, ACN,
n:?c, dung dGch )1m, h=n h<p dung môi-)1m)
Pha )"ng
2/8/12
17
Pha )"ng
•  Thành ph0n và t7 l1, pH, tEc )" dòng, nhi1t
)",… n6u là ch:*ng trình r2a giBi isocratic
•  Thành ph0n và t7 l1, pH, tEc )" dòng, nhi1t
)", và ch:*ng trình dung môi… n6u là
ch:*ng trình r2a giBi gradient
Pha .+ng ph*i th=a các yêu c>u
•  Tr* v?i pha tFnh
•  Hòa tan ):<c các ch(t phân tích (phBi r2a
c"t b,ng dung môi phù h<p )A không làm
t$a các ch(t có trong c"t/pha )"ng có s]n
trong c"t)
–  VD: )1m phosphate r2a ngay b,ng ACN hay
MeOH sQ gây k6t t$a trên c"t
•  PhBi bDn vHng theo th9i gian
•  Có )" tinh khi6t cao
•  Nhanh )3t cân b,ng trong quá trình s!c k.
Pha .+ng ph*i th=a các yêu c>u
•  PhBi phù h<p v?i lo3i )0u dò
–  VD: dung môi không ):<c h(p th& quang n6u