ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ HẢI YẾN

TÁCH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ PHẨM MÀU
TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO ( HPLC)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ HẢI YẾN

TÁCH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ PHẨM MÀU
TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO ( HPLC)
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. NGUYỄN XUÂN TRUNG


Tiếng Việt

AOAC

Association of Official Analytical
Community

Hiệp hội cộng đồng phân tích
chính thức

CAC

Codex Alimentarius Committee

Ủy ban mã thực phẩm

GMP

Good Manufacturing Practices

Thực hành sản xuất tốt

HPLC

High high performance
liquidchromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao


Limit of quantification

Giới hạn định lượng

MS

Mass spectrometry

Khối phổ

NP-HPLC

Normal phase- High high performance
liquidchromatography

Sắc ký pha thường

RP-HPLC

Revesed phase- High high performance
liquidchromatography

Sắc ký pha đảo

R(%)

Recovery

Hiệu suất thu hồi


Hình 2.1. Quy trình phân tích một số phẩm màu ......................................................... 27
Hình 3.1: Hình dạng phổ hấp thụ của các phẩm màu khi sử dụng detector PDA ........ 30
Hình 3.2. Sắc đồ chuẩn 10 phẩm màu phân tích trên cột X-Brigde C18....................... 31
Hình 3.3. Sắc đồ chuẩn 10 phẩm màu phân tích trên cột IntertSustain C18 ................. 32
Hình 3.4. Sắc đồ chuẩn 10 phẩm màu phân tích trên cột Symmetry C18 ..................... 33
Hình 3.5. Sắc ký đồ HPLC đối với các chế độ gradient thử nghiệm với hệ dung môi
NaH2PO4 0.05 M – ACN............................................................................................37
Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC đối với các chế độ gradient thử nghiệm với hệ dung môi
NaH2PO4 0.05 M – MeOH............................................................................................ 39
Hình 3.7. Sắc ký đồ HPLC đối với các chế độ gradient thử nghiệm với hệ dung môi
NaH2PO4 0.01 M – MeOH............................................................................................ 41
Hình 3.8. Ảnh hưởng của dung môi loại béo đến độ thu hồi của các phẩm màu ........ 44
Hình 3.9. Ảnh hưởng của dung môi chiết mẫu đến độ thu hồi của các phẩm màu ...... 45
Hình 3.10. Ảnh hưởng của pH trong quá trình chiết mẫu ............................................ 46
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình chiết mẫu .................................... 47
Hình 3.12. Quy trình chiết mẫu xác định một số phẩm màu trong thực phẩm ........... 48


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Phân nhóm, chức năng công nghệ và qui định của các chất phụ gia TP ... ........ 2
Bảng 1.2. Phân loại chất phụ gia theo khoảng số INS. ............................................... 4
Bảng 1.3. Chỉ tiêu hàm lượng các phẩm màu được phép sử dụng trong thực phẩm ... 18
Bảng 3.1. Các gradient thử nghiệm với pha động là NaH2PO4 0.05 M – ACN .......... 36
Bảng 3.2. Thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), hệ đối xứng pic (AS) của fast green,
camoisine, erythrosine ứng với từng chế độ gradient ................................................. 36
Bảng 3.3. Các gradient thử nghiệm với pha động là NaH2PO4 0.05 M – MeOH ........ 38
Bảng 3.4. Thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), hệ đối xứng pic (AS) của fast green,
camoisine, erythrosine ứng với từng chế độ gradient ................................................. 38
Bảng 3.5. Các gradient thử nghiệm với pha động là NaH2PO4 0.01 M – MeOH ....... 40
Bảng 3.6: Thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), hệ đối xứng pic (AS) của fast green,

1.4. Các phương pháp xác định phẩm màu .................................................................. 19
1.4.1. Phương pháp định tính xác định phẩm màu không được phép sử dụng ............ 19
1.4.2. Phương pháp xác định các phẩm màu được phép sử dụng trong thực phẩm ..... 19
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 24
2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................ 24
2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu ............................................................. 24
2.2.1. Hóa chất ............................................................................................................. 24
2.2.2. Thiết bị ................................................................................................................. 25
2.2.3. Dụng cụ............................................................................................................... 25
2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................... 25
2.4. Thẩm định phương pháp phân tích ...................................................................... 28
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................. 29
3.1. Tối ưu điều kiện xác định các phẩm màu tổng hợp trên hệ thống HPLC ............. 29
3.1.1. Lựa chọn detector ............................................................................................... 29


3.1.2. Lựa chọn cột sắc ký ........................................................................................... 30
3.1.3. Tối ưu thành phần pha động ............................................................................. 34
3.1.4. Lựa chọn thể tích bơm mẫu ................................................................................ 41
3.2. Tối ưu quy trình xử lý mẫu ................................................................................... 43
3.2.1. Tối ưu dung môi loại chất béo ........................................................................... 43
3.2.2. Tối ưu dung môi chiết mẫu ................................................................................ 44
3.2.3. Tối ưu pH chiết mẫu ........................................................................................... 46
3.2.4. Tối ưu nhiệt độ chiết mẫu .................................................................................. 46
3.3. Đánh giá phương pháp phân tích ........................................................................... 49
3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn ................................................ 49
3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp .... 53
3.3.3. Độ lặp lại của phương pháp ............................................................................... 54
3.3.4. Độ thu hồi của phương pháp .............................................................................. 57
3.4. Kết quả phân tích mẫu thực ................................................................................... 62

1. Xây dựng phương pháp tách và định lượng đồng thời một số phẩm màu trong
thực phẩm
2. Áp dụng phương pháp để tách và định lượng một số phẩm màu trong một số
mẫu thực phẩm.
1


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về phụ gia thực phẩm
1.1.1. Phụ gia thực phẩm là gì ? [5]
Phụ gia thực phẩm là chất được chủ định đưa vào thực phẩm trong quá trình sản xuất,
có hoặc không có giá trị dinh dưỡng, nhằm giữ hoặc cải thiện đặc tính của thực phẩm.
1.1.2. Phân loại phụ gia thực phẩm
1.1.2.1. Phân loại theo nhóm chức năng
Các phụ gia thực phẩm có thể phân chia thành vài nhóm, mặc dù có một số phần
chồng lẫn giữa các thể loại này.[11]
Bảng 1.1: Phân nhóm, chức năng công nghệ và qui định của các chất phụ gia TP
TT

Tên nhóm

1.

Chất điều vị

2.

Chất làm ẩm

3.

Một chất hoặc hỗn hợp các chất sinh
QCVN 4-3:2010/BYT
khí và làm tăng thể tích của bột nhào
Làm giảm khả năng kết dính của các
QCVN 4-4:2010/BYT
phân tử thực phẩm
làm ổn định, duy trì hoặc làm tăng màu
QCVN 4-5:2010/BYT
sắc của một thực phẩm
Kéo dài thời gian sử dụng của thực
phẩm chống lại sự hư hỏng do quá trình
QCVN 4-6:2010/BYT
oxy hoá gây ra như sự ôi chua và biến
màu của mỡ

Chất chống tạo
Ngăn cản hoặc làm giảm bọt
QCVN 4-7:2010/BYT
bọt
Chất ngọt tổng
Chất không phải là đường tạo vị ngọt
hợp
QCVN 4-8:2010/BYT
cho thực phẩm
Chất làm rắn
chắc
Phẩm màu

Tạo hoặc giữ các mô của rau quả luôn
cứng và dòn hoặc tác động với chất tạo QCVN 4-9:2010/BYT

Kéo dài thời gian sử dụng của một thực
phẩm bằng cách chống lại sự hư hỏng QCVN 4-12:2010/BYT
do vi sinh vật gây ra
Tạo khả năng duy trì một sự phân tán
đồng nhất của hai hoặc nhiều chất QCVN 4-13:2010/BYT
không trộn lẫn được trong TP
QCVN 4-14:2010/BYT
Chất được pha vào bột để cải thiện chất
QCVN 4-15:2010/BYT
lượng làm bánh hoặc màu sắc của bột
Một chất không phải nước hoặc không
khí làm cho thực phẩm tăng lên về khối
QCVN 4-16:2010/BYT
lượng nhưng không tạo thêm giá trị
năng lượng có sẵn của thực phẩm.
Một chất khí khác không khí đẩy một
thực phẩm khỏi bao bì chứa thực phẩm QCVN 4-17:2010/BYT
đó

Chế phẩm tinh
bột
19. Enzym
18.

20. Chất làm bóng
21. Chất làm dày
22. Chất nhũ hóa

23. Chất tạo bọt


số này hiện đã được CAC chấp nhận và mở rộng để xác định trên bình diện quốc tế tất
cả các phụ gia thực phẩm mà không liên quan đến việc chúng có được chấp nhận sử
dụng hay không. Các phụ gia thực phẩm có thể phân chia thành vài nhóm, mặc dù có
một số phần chồng lấn giữa các thể loại này.
Mã số INS (International Numbering System) được CAC chấp nhận tại phiên
họp thứ 18 (tháng 7 năm 1989) và được nhiều nước thành viên công nhận và áp dụng
đến ngày nay.
Mã số INS là một hệ thống mã số mở nhằm mã hoá các chất phụ gia đang sử
dụng cũng như các chất sẽ được xem xét sau này. Mã số INS rất thuận tiện trong tra
cứu và ghi nhãn các chất phụ gia thực phẩm.
Dưới đây là bảng phân loại các chất phụ gia thực phẩm theo số INS.
Bảng1.2: Phân loại chất phụ gia theo khoảng số INS.
Loại chất

Khoảng số INS

100- 199

100 – 109

Vàng

Tạo màu

110 – 119

Vàng cam

120 – 129


220 – 229

Các sulfit

230 – 239

Các phenol và format (metanoat)

240 – 259

Các nitrat

260 – 269

Các axetat (etanoat)

270 – 279

Các lactate

280 – 289

Các propionat (propanoat)

4

Tên chất phụ gia


290 – 299

350 – 359

Các malat & adipat

360 – 369

Các succinat & fumarat

370 – 399

Khác

400 – 499

400 – 409

Các alginate

Chất tạo đặc, chất ổn
định và chất tạo thể
sữa

410 – 419

Các gôm tự nhiên

429 – 429

Các tác nhân tự nhiên khác


Chất điều chỉnh pH &
chất chống vón

510 – 519

Các clorua và sulfat

520 – 529

Các sulfat & hiddroxit

530 – 549

Các hợp chất kim loại kiềm

550 – 559

Các silicat

570 – 579

Các stearat & gluconat

580 – 599

Khác

660 – 699

620 – 629

Với mục đích làm tăng tính hấp dẫn, ngon mắt của sản phẩm, các phụ gia thực
phẩm được sử dụng để thay đổi màu sắc và mùi vị của nguyên liệu trong quá trình chế
biến, phù hợp với khẩu bị và mong muốn của người thực hiện.
Chất tạo mùi thường là các chất phụ gia hương liệu hoa quả, vani, socola… sử
dụng trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, nước giải khát…
*Bảo quản thực phẩm tươi lâu
Thông thường các loại thực phẩm thường bị tấn công bởi các vi sinh vật hoặc vi
khuẩn, nấm mốc gây hư hỏng hoặc phân huỷ. Phụ gia bảo quản thường hoạt động dưới
dạng ngăn ngừa sự phát triển của các nhân tố vi sinh vật, vi khuẩn và giữ cho thực
phẩm được tươi, ngon, ổn định chất lượng, mùi vị trong thời gian dài hơn.
*Phụ gia làm thay đổi cấu trúc
Có nhiều phụ gia thực phẩm được sử dụng để giúp chất lượng sản phẩm đạt yêu
cầu hơn ví dụ như: làm đông, làm loãng hay kích thích nở…

6


- Chất làm cho món ăn có độ loãng ổn định, không đông đặc hay kết tủa ví dụ
như canxi silicate, silicon dioxyd. Các chất này có tác dụng ngăn bột, đường, muối hút
nước rồi dính lại với nhau.
- Chất làm đông các sản phẩm như: thạch, kem, bánh ngọt.
Ví dụ: Carrageenan…
- Chất làm bột nở, như muối bicarbonate, bột nở, natri phosphat hoặc một vài loại
men, được dùng khi làm bánh nướng, bánh mì... giúp cho bánh mềm xốp, nhẹ hơn…
1.1.4. Ảnh hƣởng của phụ gia thực phẩm đến sức khỏe con ngƣời [8]
Nếu sử dụng phụ gia thực phẩm không đúng liều lượng, chủng loại nhất là
những phụ gia không cho phép dùng trong thực phẩm sẽ gây những tác hại cho sức
khỏe:
+ Gây ngộ độc cấp tính: Nếu dùng quá liều cho phép.
+ Gây ngộ độc mạn tính: Dù dùng liều lượng nhỏ, thường xuyên, liên tục, một

Phẩm màu thực phẩm là phụ gia thực phẩm được sử dụng với mục đích tăng
cường hoặc khôi phục màu cho sản phẩm thực phẩm chúng được dùng để tạo ra hoặc
cải thiện màu sắc của thực phẩm, nhằm tăng tính hấp dẫn của sản phẩm, chúng hoàn
toàn không có giá trị về mặt dinh dưỡng.
1.2.2. Phân loại phẩm màu thực phẩm
Phẩm màu được phân làm hai loại chính:
a. Phẩm màu tự nhiên: là các chất màu được chiết xuất ra hoặc được chế biến
từ các nguyên liệu hữu cơ (thực vật, động vật) sẵn có trong tự nhiên. Ví dụ: Caroten tự
nhiên được chiết xuất từ các loại quả có màu vàng, Curcumin được chiết xuất từ củ
nghệ, màu Caramen được chế biến từ đường...Nhóm phẩm màu có nguồn gốc tự nhiên
có nhược điểm là độ bền kém, sử dụng với lượng lớn nên giá thành sản phẩm cao.
b. Phẩm màu tổng hợp hoá học: Là các phẩm màu được tạo ra bằng các phản
ứng tổng hợp hoá học. Ví dụ: Amaranth (đỏ), Brilliant blue (xanh), Sunset yellow
(vàng cam), Tartazine (vàng chanh)...Các phẩm màu tổng hợp thường đạt độ bền màu
cao, với một lượng nhỏ đã cho màu đạt với yêu cầu đặt ra, nhưng chúng có thể gây
ngộ độc nếu dùng loại không nguyên chất, không được phép dùng trong thực phẩm.
1.2.3. Hiện trạng sử dụng phẩm màu trong thực phẩm [2].
Theo danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực phẩm, Bộ Y tế đã
8


ban hành Thông tư 27/2012/TT-BYT: qui định cho 23 nhóm chức năng với 400 chất.
Những loại phẩm màu này không gây độc hại cho sức khỏe người tiêu dùng nhưng
cũng cần sử dụng dưới mức giới hạn dư lượng cho phép. Tuy nhiên, hiện nay vẫn có
một số cơ sở sản xuất, kinh doanh do quá ham lợi nên thường sử dụng phẩm màu vượt
giới hạn cho phép, đặc biệt là màu tổng hợp, hoặc sử dụng phẩm màu ngoài danh mục
cho phép. Thậm chí có cơ sở sản xuất thực phẩm đã liều lĩnh, xem thường tính mạng
người tiêu dùng, lấy phẩm màu sử dụng trong công nghiệp đưa vào sản xuất thực
phẩm gây hậu quả nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng (gây hậu quả tức thời
như các trường hợp ngộ độc cấp tính, có thể dẫn đến tử vong hoặc gây độc tích luỹ từ

+ CTPT: C20H11N2Na3O10S3
+ Khối lượng phân tử: 604.48 g/mol
+ CTCT:

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Amaranth
+ Trạng thái: bột hoặc hạt màu nâu đỏ.
+ Tính tan: tan nhiều trong nước và tan ít trong etanol
10


+ Amaranth được dùng rộng rãi trong thực phẩm, đặc biệt trong đồ tráng miệng, bánh
kẹo, kem, sản phẩm sữa, nước giải khát, rau muối chua, sốt, cá và sản phẩm nướng.
c. Indigo carmin [13]
Indigo carmin chủ yếu gồm disodium 3,3' -dioxo-[delta2,2'-biindoline]-5,5'disulfonate, và disodium 3,3'-dioxo-[delta2,2'-biindoline]-5,7'-disulfonate và một số
chất màu phụ cùng với các chất không màu khác như natri clorua hoặc natri sulfat.
+ Tên hóa học: Disodium 3,3'-dioxo-[delta2,2'-biindoline]-5,5'-disulfonate
+ CTPT: C16H8N2Na2O8S2
+ Khối lượng phân tử: 466.36 g/mol
+ CTCT:

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Indigocarmin
+ Trạng thái: bột hoặc hạt màu xanh.
+ Tính tan: tan nhiều trong nước và tan ít trong etanol
+ Indigo carmin được dùng rộng rãi trong thực phẩm, đặc biệt trong đồ tráng
miệng, bánh kẹo, kem, sản phẩm sữa, nước giải khát...
d. Ponceau 4R- E 124 [14]
Ponceau 4R chủ yếu gồm trinatri – 2 – hydroxyl – 1 - (4 sulfonato – 1 naphtylazo) - 6,8 - naphthalendisulfonat và một số chất màu phụ cùng với các chất
không màu khác như natri clorua hoặc natrisulfat.
+ Tên gọi hóa học: Trinatri-2- hydroxyl-1-( 4 sulfonato-1-naphtylazo)- 6,8naphthalendisulfonat
+ CTPT:C20H11N2Na3O10S3.1,5 H2O

chất không màu khác như natri clorua hoặc natri sulfat.
+ Tên hóa học: Disodium 6-hydroxy-5-(2-methoxy-5-methyl-4-sulfonato
phenylazo)-2-naphthalenesulfonate.
+ CTPT: C18H14N2Na2O8S2
+ Khối lượng phân tử: 469.63 g/mol
+ CTCT:

Hình 1.6. Công thức cấu tạo của Allura red
+ Trạng thái: bột hoặc hạt màu vàng đỏ.
+ Tính tan: tan trong nước và tan ít trong etanol
+ Allura red: dùng rộng rãi trong thực phẩm, đặc biệt cho nước giải khát, kem,
bánh kẹo, đồ hộp, bánh nướng và đồ tráng miệng…
g. Fast Green FCF [17]
Fast green chủ yếu gồm disodium 3-[N-ethyl-N-[4-[[4-[N-ethyl-N-(3sulfonatobenzyl)amino]phenyl](4-hydroxy-2-sulfonatophenyl)methylene]-2,513


cyclohexadien-1-ylidene]ammoniomethyl]benzenesulfonate và một số chất màu phụ
cùng với các chất không màu khác như natri clorua hoặc natri sulfat.
+ Tên hóa học: Disodium 3-[N-ethyl-N-[4-[[4-[N-ethyl-N-(3-sulfonatobenzyl)
amino]

phenyl]

(4-hydroxy-2-sulfonatophenyl)

methylene]-2,5-cyclohexadien-1-

ylidene] ammoniomethyl]-benzenesulfonate
+ CTPT: C37H34N2Na2O10S3
+ Khối lượng phân tử: 808.86 g/mol

Hình 1.8. Công thức cấu tạo của Camoisine
+ Trạng thái: bột hoặc hạt màu đỏ.
+ Tính tan: tan trong nước và tan ít trong etanol
+ Carmoisine: dùng rộng rãi trong thực phẩm, đặc biệt cho nước giải khát, kem,
bánh kẹo, đồ hộp, bánh nướng và đồ tráng miệng…
i. Erythrosine [18]
Erythosine chủ yếu gồm disodium salt of 9-(o-carboxyphenyl)-6-hydroxy2,4,5,7-tetraiodo-3-isoxanthone monohydrate và một số chất màu phụ cùng với các
chất không màu khác như natri clorua hoặc natri sulfat.
+ Tên hóa học: Disodium salt of 9-(o-carboxyphenyl)-6-hydroxy-2,4,5,7tetraiodo-3-isoxanthone monohydrate
+ CTPT: C20H6I4Na2O5 . H2O
+ Khối lượng phân tử: 897.88 g/mol
+ CTCT:

Hình 1.9. Công thức cấu tạo của Erythrosine
15


+ Trạng thái: bột hoặc hạt màu đỏ
+ Tính tan: tan trong nước và tan ít trong etanol
+ Erythosine: dùng rộng rãi trong thực phẩm, đặc biệt cho nước giải khát, kem,
bánh kẹo, đồ hộp, bánh nướng và đồ tráng miệng…
k. Brilliant Blue FCF [19]
Brilliant Blue chủ yếu gồm Disodium 3-[N-ethyl-N-[4-[[4-[N-ethyl-N-(3sulfonatobenzyl)-amino] phenyl] (2-sulfonatophenyl)methylene]-2,5-cyclohexadiene1-ylidene] ammoniomethyl] benzenesulfonate và một số chất màu phụ cùng với các
chất không màu khác như natri clorua hoặc natrisulfat.
+

Tên

gọi


Amaranth, Indigo carmin, Ponceau 4R, Sunset Yellow FCF, Allura red, Fast Green,
Camoisine, Erythrosine và Brilliant Blue đều thuộc nhóm những phẩm màu được phép
sử dụng trong thực phẩm với độ độc nhạy thấp, do chúng hòa tan nhiều trong nước
nhưng không tích tụ trong cơ thể mà trao đổi qua gan và được bài tiết trong nước tiểu.
Tuy nhiên nếu sử dụng các loại thực phẩm có dư lượng phẩm màu vượt quá giới hạn
cho phép thêm vào thực phẩm thì rất dễ dẫn tới nguy cơ ngộ độc mãn tính, hàm lượng
tích lũy lớn có thể dẫn đến ung thư. Dưới đây là chỉ tiêu hàm lượng tối đa các phẩm
màu được phép thêm vào trong các loại thực phẩm [2].

17