Trêng ®¹i häc vinh
Khoa HãA HäC
-------o0o------
§ËU THÞ LOAN
ĐỊNH LƯỢNG α-TOCOPHEROL (VITAMIN
E) TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG
PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: HÓA THỰC PHẨM
Vinh, 2012
1
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................1
1. Lý do chon đề tài.....................................................................................1
2. Nhiệm vụ nghiên cứu..............................................................................2
3. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................2
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN.......................................................................3
1.1. Giới thiệu về vitamin ...........................................................................3
1.1.1. Khái niệm .........................................................................................3
1.1.2. Đặc điểm chung và phân loại ...........................................................3
1.2. Tổng quan về vitamin E. .....................................................................7
1.2.1. Khái niệm chung ..............................................................................7
3.3. Tiến hành trên máy sắc ký HPLC........................................................58
3.3.1. Điều kiện sắc ký...............................................................................58
3.3.2. Điều kiện Detectơ..............................................................................58
3.4. Khảo sát đánh giá phương pháp...........................................................58
3.4.1. Khảo sát độ lặp lai.............................................................................58
3.4.2. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp....................................59
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................60
4.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phép định lượng α-tocopherol
bằng HPLC..........................................................................................60
4.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ cột tách........................................................60
4.1.2 Ảnh hưởng của thề tích bơm mẫu…………………………………..61
4.1.3. Ảnh hưởng của tốc độ dòng..............................................................61
4.1.4. Ảnh hưởng của thành phần dung môi pha động................................62
4.1.5. Ảnh hưởng của phương pháp xử lý mẫu...........................................63
4.2. Xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích peak vào
nồng độ .......................................................................................................64
3
4.3. Đánh giá phương pháp.........................................................................68
4.3.1. Xác định độ lặp lại của phương pháp ...............................................68
4.3.2. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp....................................70
4.4. Sắc đồ..................................................................................................71
4.4.1. Sắc đồ mẫu.......................................................................................71
4.4.2 Sắc đồ khảo sát phương pháp.............................................................73
CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.................................................81
5.1. Kết luận...............................................................................................81
5.2. Đề xuất.................................................................................................81
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................82
Bơ 68
Bảng4.2.3. Kết quả phân tích hàm lượng α-tocopherol trong mẫu dầu gấc......68
Bảng 4.2.1.1 Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên của mẫu xốt và
Bơ................................................................................................................69
Bảng 4.3.1.2. Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên mẫu dầu gấc.....70
Bảng 4.3.2.1. Kết quả xác định hiệu suất thu hồi của phương pháp đối với
mẫu bơ.........................................................................................................71
5
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.3.5.1. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1100........33
Hình1.3.5.2 sơ đồ nguyên lý của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao..............34
Hình 3.2.1.1. Sơ đồ xử lý chất chuẩn..........................................................55
Hình 3.2.1.2. Sơ đồ xử lý mẫu dầu gấc......................................................55
Hình 3.2.1.3. Sơ đồ xử lý mẫu bơ và xốt trứng gà tươi..............................56
Hình 4.2.1. Sắc đồ mẫu chuẩn α-tocopherol có nồng độ 10ppm................64
Hình 4.2.2. Sắc đồ mẫu chuẩn α-tocopherol có nồng độ 20ppm...............65
Hình 4.2.3. Sắc đồ mẫu chuẩn α-tocopherol có nồng độ 45ppm................65
Hình 4.2.4. Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic thu được
và nồng độ các chuẩn α-tocopherol.............................................................66
Hình 4.4.1.1 Sắc đồ mẫu Xốt trứng gà tươi................................................71
Hình 4.4.1.2 Sắc đồ mẫu bơ........................................................................72
Hình 4.4.1.3 Sắc đồ mẫu Dầu gấc...............................................................72
Hình 4.4.1.4. Sắc đồ mẫu bơ thêm chuẩn α-tocopherol..............................73
Hình4.4.2.1.1 Sắc đồ khảo sát thể tích bơm mẫu tại V=5μl.......................73
Hình 4.4.2.1.2 Sắc đồ khảo sát thể tích bơm mẫu tại V=3μl......................74
Hình 4.4.2.1.3 Sắc đồ khảo sát thể tích bơm mẫu tại V=10μl....................74
Sắc ký khí khối phổ
HPLC:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LOD:
Giới hạn phát hiện
LOQ:
Giới hạn định lượng / giới hạn xác định
UV – VIS: Ultraviolet – spectrophotometer
RDA:
Hàm lượng vitamin E cho phép sử dụng
PUFA:
hàm lượng axit béo không bảo hòa trong cơ thể
UV:
UltraViolet
BPC:
LỜI CẢM ƠN
Khóa luận được thực hiện tại phòng thí nghiệm Trung tâm Kiểm định
An toàn Thực phẩm và Môi trường, Trường Đại học Vinh.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn đến
Ths. Lê Thế Tâm - Khoa Hóa, Trường Đại học Vinh đã giao đề tài, tận tình
hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình nghiên cứu và
hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Chu Thị Thanh Lâm - Khoa Hóa Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá
trình làm thí nghiệm, hướng dẫn cách sử dụng máy HPLC đo mẫu.
Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các cán
bộ trong khoa Hoá.
Và lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã động viên đã giúp đỡ
tôi hoàn thành khóa luận này.
Vinh, tháng 05 năm 2012
Sinh viên
Đậu Thị Loan
ĐẶT VẤN ĐỀ
9
1. Lý do chon đề tài
Vitamin là một nhóm chất hữu cơ có phân tử tương đối nhỏ và có
bản chất vật lý, hóa học khác nhau, so với nhu cầu về các chất dinh dưỡng
cơ bản như protein, lipit, gluxit thì nhu cầu về vitamin rất thấp. Tuy nhiên
nhóm chất hữu cơ này đặc biệt cần thiết cho hoạt động sống của các cơ thể
sinh vật, Vitamin E (C29H50O2) là một trong những hợp chất hữu cơ quan
trọng ấy. Được phát hiện từ năm 1922, vitamin E chỉ được biết như là chất
có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh sản của các loại động vật và con
Để đóng góp thêm phương pháp phân tích cho các đối tượng thực
phẩm chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện định lượng
α-
tocopherol (vitamin E) trong mẫu dầu gấc, xốt trứng gà tươi và trong bơ
bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).
2. Nhiệm vụ nghiên cứu
Trong luận văn này, chúng tôi có các nhiệm vụ :
- Nghiên cứu các tính chất vật lý, hóa học và phương pháp định
tính, định lượng α-tocopherol trong tinh dầu gấc, xốt trứng gà tươi và trong
bơ.
- Tách, chiết α-tocopherol trong mẫu tinh dầu gấc, xốt trứng gà
tươi và trong bơ.
- Định lượng α-tocopherol bằng phương pháp HPLC.
3. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu tinh dầu gấc, bơ thực vật và xốt trứng gà tươi được thu thập tại
siêu thị và các cửa hàng tạp hóa trong thành phố Vinh, mỗi mẫu được lấy
một ít đựng vào túi nilông sạch. Bao gồm:
- Dầu gấc Việt Nam G8
- Xốt trứng gà tươi Aji-mayo
- Bơ thực vật cao cấp Meizam.
11
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về vitamin
1.1.1. Khái niệm [1] [22]
Vitamin là hợp chất hữu cơ, phần lớn có phân tử tương đối nhỏ. Bản
Là chất xúc tác, bằng cách hoạt hoá quá trình oxi hoá thức ăn và chuyển
hoá. Tham gia vào thành phần cấu tạo coenzym, quyết định hoạt tính đặc
thù của chúng.
Khi trong thức ăn thiếu vitamin hoặc cơ thể hấp thu kém, sẽ dẫn đến
các rối loạn trao đổi chất đặc trưng và rối loạn chức năng, cơ thể sẽ xuất
hiện các rối loạn bệnh lý (bệnh thiếu vitamin và bệnh thừa vitamin). Thực
vật và vi sinh vật có khả năng tổng hợp hầu hết các loại vitamin và tiền
vitamin (provitamin). Còn đối với người và động vật không có khả năng
tổng hợp mà chỉ sử dụng được vitamin lấy từ thức ăn. Một số loại vitamin
(B6, B12, acid pantotenic, acid folid...) được hệ vi khuẩn ở ruột tổng hợp
hoặc tạo ra trong cơ thể (ví dụ acid nicotinic được tổng hợp từ tryptophan),
tuy vậy các phản ứng này không đủ cung cấp cho nhu cầu của cơ thể.
1.1.2.2. Phân loại [1]
Dựa vào cơ sở sinh lý và hoá học vitamin được phân chia thành 2 nhóm
lớn:
Vitamin hòa tan trong chất béo (dầu): Có khả năng dự trữ trong cơ
thể, do vậy sự thiếu hụt tạm thời của chúng không dẫn đến tác hại lớn đối
với cơ thể. Khi cơ thể tiếp nhận một lượng lớn vitamin tan trong dầu, thì
nồng độ của chúng trong lipit của cơ thể có thể vượt qua mức bình thường
và trong một số trường hợp có thể dẫn đến những rối loạn quá trình trao đổi
chất và các rối loạn chức năng (bệnh thừa vitamin). [3]
- Vitamin A và caroten
- Vitamin D (Canxiferol)
- Vitamin E (Tocoferol)
- Vitamin K (Koagulation)
13
- Vitamin Q
sẽ tan trong nước. Mặc dù lúc đầu có nhiều vitamin trong thức ăn nhưng
qua quá trình chế biến chúng sẽ mất đi, chỉ còn lại một lượng rất nhỏ.
-Cơ thể không dự trữ các vitamin này bởi vì chúng tan trong nước
nên bị thải ra ngoài qua nước tiểu.
Vitamin A, D, E và K là những vitamin tan trong dầu, được hấp thu
và vận chuyển cùng với mỡ, các vitamin này chủ yếu được giữ lại ở gan và
mô mỡ, một lượng nhỏ ở trong những mô khác. Chúng được sử dụng khi
có nhu cầu của cơ thể nhưng mức độ dự trữ này có giới hạn.
Phần lớn các vitamin hoạt động như một phức hợp hoạt hóa enzym.
Một số khác như vitamin E và beta-caroten là những chất cần thiết cho sự
sống, thiếu chúng sẽ ảnh hưởng đến quá trình oxy hóa, gây ra bệnh tim
mạch, viêm và dị ứng.
Nhiều loại vitamin có đa tác dụng và phức tạp hơn, nhất là cấu tạo
nên hormon (vitamin D và vitamin A) do đó chúng tham gia vào nhiều
chức năng và không thể thiếu trong các quá trình sau:
- Thụ thai và phát triển của bào thai: Thiếu chúng có thể gây vô sinh
và biến dạng bào thai cũng như gây ra những biến chứng lúc mang thai và
sinh đẻ.
- Tăng trưởng và khoáng hóa xương: Thiếu chúng đưa đến những
vấn đề về tư thế và biến dạng xương.
- Cân bằng thức ăn: khả năng hấp thu nhiều chất dinh dưỡng (như
vitamin D đối với canxi).
- Hoạt động nhân lên của tế bào: Thiếu vitamin sẽ gây thiếu máu,
chậm liền sẹo, biến đổi da, lông, tóc và móng.
- Tính miễn dịch: Nếu thiếu vitamin, dễ bị mắc bệnh, dễ nhiễm
khuẩn vì giảm khả năng miễn dịch của cơ thể.
15
các gốc tự do giúp cơ thể khỏe mạnh, chống lại sự sản xuất dư thừa gốc tự
do, chống lại quá trình chết tế bào, kìm hãm quá trình lảo hóa, giúp da tóc
mịn màng. Vitamin E được chỉ định điều trị các chứng rối loại bệnh lý về
da, điều trị hỗ trợ chứng gan nhiễm mỡ, tăng cholesterol trong máu, hỗ trợ
điều trị chứng vô sinh, suy giảm sản xuất tinh trùng ở nam giới, ngoài ra
còn có nhiều tác dụng khác giúp nâng cao chất lượng sống của con người.
1.2.2. Lịch sử về vitamin E [22]
Vitamin E được khám phá vào năm 1922 bởi các nhà khoa học
Evans- Bishop, khi các nhà khoa học phát hiện thấy chuột cống được nuôi
dưỡng với một chế độ ăn thiếu vitamin E sẻ nảy sinh các vấn đề liên quan
đến sinh sản.
- Khi vitamin E được công nhận như là một hợp chất có tác dụng
phục hồi khả năng sinh sản, các nhà khoa học đặt cho nó tên hóa học là
tocopherol, từ tiếng Hi Lạp có nghĩa là “ sinh con”.
- Năm 1936, tách được vitamin E từ mầm lúa mì và dầu bông.
- Năn 1938, tổng hợp được bốn loại dẫn xuất của benzopiran là:
α-tocopherol, β-tocopherol, γ-tocopherol, δ-tocopherol gọi là nhóm vitamin E.
1.2.3. Nguồn cung cấp vitamin E [22]
Chủ yếu là dầu thực vật, rau xà lách, rau cải, dầu mầm hạt (mầm lúa
mì, lúa và ngô); trong dầu của một số hạt có dầu (đậu tương, vừng, lạc, hạt
hướng dương, dầu ô-liu...) hoặc trong tinh dầu một số loại quả ( quả bơ,
quả gấc...)
α-tocopherol có trong hạt cây hướng dương, dầu gấc, dầu bơ, còn
đậu tương và dầu ngô lại chứa các dạng khác nhiều hơn.
Ở động vật, vitamin E có trong mỡ bò, mỡ cá nhưng với hàm lượng thấp.
- Hàm lượng tocopherol trong một số nguồn như sau:
17
-
-
-
70 - 110
90 - 105
55 – 70
10
-
25 – 40
90
0 – 10
0
75 - 170
10
-
60
30
Cà rốt
Trái bơ
α-tocopherol
(mg)
1.9
1.2
1.9
4.6
7.3
4.3
2.4
1.8
0.4
3.4
Hàm lượng
trong
1 thìa cafe
1 thìa cafe
1 thìa cafe
1 thìa cafe
1 OZ (28,35g)
1 OZ (28,35g)
1 OZ (28,35g)
½ tách
½ tách
1 quả
γ-tocopherol
Hạt hạnh nhân
Ngô
Hạt bông
Dầu ô-liu
Dầu cọ
Đậu phộng
Cây rum
Đậu tương
Hạt hướng dương
Mầm lúa mì
Nước ép cà chua
Táo (trong vỏ)
Xoài xanh
Hạt hạnh nhân khô
Hạt dẻ khô
Bơ đậu phộng
Đậu phộng khô
Quả hồ trăm khô
Mayonnaise
Trái bơ
Măng tây
Rau bina
Khoai tây
Cà chua
Cải xanh
1 thìa café
1 thìa café
1 thìa café
1 thìa café
6.1
20.3
0.4
0.81
2.32
6.72
6.7
3
2.56
1.46
11
2.32
1.15
0.53
5.93
0.42
0.63
35.3
12.6
32
10.6
17.3
10.6
30.6
10
40.6
135.3
2.6
5.4
100g
100g
100g
100g
100g
100g
Cá thu
Thịt gà
Dầu phộng
Dầu đậu nành
Dầu gấc
Măng tây
Đậu xanh
Hột điều
Trái bơ
Khoai lang ta
1,2mg
2mg
150mg
15mg
12mg
2mg
3mg
20mg
3mg
15mg
Bảng 1.2.3.4. Hàm lượng vitamin E trong một số loại thực phẩm (mg/100g) [22]
β-tocopherol
γ-tocopherol
21
δ-tocopherol
- Dạng thiên nhiên của vitamin E là RRR- α-tocopherol tìm thấy từ
dầu thực vật, là đồng phân lập thể đơn lẻ.
- Trong các loại tocopherol, α-tocopherol là thành phần chính tồn tại
trong cơ thể, có hoạt tính sinh học nhiều nhất của vitamin E. Các dạng khác
như beta (β), gamma (γ), delta (δ) dù hoạt tính thấp hơn loại alpha nhưng
cũng có tác dụng hỗ trợ rất lớn cho sức khỏe con người.
Tocotrienol:
- tocotrienol có bốn dạng, phân biệt với tocopherol nhờ chuỗi bên
cạnh bất bảo hòa, ít phân bố rộng rãi trong thiên nhiên.
Vitamin E tổng hợp: Được bào chế từ công nghệ hóa chất, là các
racemic D,L – alpha-tocopherol, gồm bảy đồng phân quang học, nhưng chỉ
có một đồng phân giống vitamin E thiên nhiên là D-alpha-tocopherol (chỉ
chiếm 12,5%), vì vậy tác dụng của vitamin E tổng hợp thấp hơn so với loại
có nguồn gốc thiên nhiên mặc dù về cơ chế hấp thu và sử dụng hai loại
vitamin E thiên nhiên và tổng hợp trong cơ thể không có gì khác nhau.
1.2.5. Tính chất của vitamin E [22]
1.2.5.1. Tính chất vật lý
- Các tocopherol có công thức phân tử là C29H50O2.
- Tocopherol là chất dầu lỏng không màu, hòa tan rất tốt trong dầu
thực vật, rượu etylic, đietyl ete, ete dầu hỏa.
- α-tocopherol thiên nhiên (danh pháp: (2R)-2,5,7,8-Tetramethyl-2[(4R,8R)-4,8,12-trimethyltridecyl]-3,4-dihydro-2H-chromen-6-ol) có thể
23
Vitamin E làm chậm sự lão hóa của da và đồng thời có tác dụng bảo vệ
màng tế bào. Sự hiện diện của nó giúp cho mỡ trong tế bào được giữ gìn
bởi vì những màng tế bào được cấu tạo từ axit béo có nhiều nối đôi, rất dễ
bị oxy hóa. Sự oxy hóa của axit béo màng tế bào cho ra hàng loạt phản ứng
mà kết quả cho ra gốc lipoperoxyd (LOO *) rất hoạt động vì không bền sẽ
làm rối loạn chức năng sinh học của màng tế bào.
Vitamin E có khả năng ngăn chặn phản ứng của các gốc tự do bằng
cách nhường một hyđro (H) của gốc phenol cho gốc lipoperoxyd (LOO *)
để biến gốc tự do này thành hyđroperoxyd không gây phản ứng vì tạo
LOOH.
Phản ứng như sau:
LOO* + Tocopherol- OH LOOH + Tocopherol-O*
Hoặc:
Trong quá trình phản ứng, tocopherol (tocopherol-OH) bị chuyển
hóa thành gốc tocopheryl (tocopherol-O*), bền nên chấn dứt những phản
ứng gốc.
Gốc tocopherol bị khử oxy để trở lại tocopherol bởi chất khử oxy
hòa tan trong nước, hiện diện trong cytosol của những tế bào. Ngoài chức
năng ngăn chặn sự tạo thành những gốc tự do nơi tế bào, vitamin E còn bảo
vệ những chất tạo nên tế bào như protein và axit nucleic. Vitamin E làm
giản sự peroxy hóa của lipid trong bã nhờn của tóc, làm lớp da đầu bớt hiện
tượng kích thích, nghĩa là làm giảm sự khô xơ của tóc.
24
Copyright: Tài liệu đại học ©