Trêng ®¹i häc vinh
Khoa HãA HäC
-------o0o------

§ËU THÞ LOAN

ĐỊNH LƯỢNG α-TOCOPHEROL (VITAMIN E) TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: HÓA THỰC PHẨM

Vinh

1


MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ...............................................................................................................................1
1. Lý do chon đề tài...................................................................................................................1
2. Nhiệm vụ nghiên cứu............................................................................................................2
3. Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................................2

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN...............................................................3
1.1. Giới thiệu về vitamin .................................................................................3
1.1.1. Khái niệm ........................................................................................................................3
1.1.2. Đặc điểm chung và phân loại ..........................................................................................3

1.2. Tổng quan về vitamin E. ........................................................................7
1.2.1. Khái niệm chung .............................................................................................................7

.........................................................................................................
54
3.1. Thiết bị ,dụng cụ và hóa chất
.........................................................................................................
54
3.1.1. Thiết bị, Dụng cụ..............................................................................................................54
3.1.2. Hóa chất..........................................................................................................................54

3.2. Kỹ thuật thực nghiệm
.......................................................................................................................
55
3.2.1. Sơ đồ xử lý chất chuẩn và mẫu........................................................................................55
3.2.2. Tiến hành....................................................56

3.3. Tiến hành trên máy sắc ký HPLC.............................................................58

3.3.1. Đề
i u kiện sắc ký..................................................................................58
3.3.2. Điều kiện Detectơ............................................................................................................58

3.4. Khảo sát đánh giá phương pháp
.......................................................................................................................
58
3.4.1. Khảo sát độ lặp lai...........................................................................................................58
3.4.2. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp..................................................................59

CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.........................................60

3


TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................................82

4


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.2.3.1. Hàm lượng tocopherol trong một số loại dầu thực vật ......................................9
Bảng 1.2.3.2. Hàm lượng (-tocopherol, γ-tocopherol trong một số loại
thực phẩm khác: .......................................................................................................................9
Bảng 1.2.3.3. Hàm lượng tocopherol trong một số loại thực phẩm .........................................10

Bảng 1.2.3.4. Hàm lượng vitamin E trong một số loại thực phẩm (mg/100g)
.................................................................................................................
11
Bảng 1.2.7. Nhu cầu RRR-α-tocopherol ( D-α-tocopherol) đối với các độ tuổi .........................23
Bảng 1.2.8.3. Độ bền của tocopherol trong quá trình chiên rán ở nhiệt độ cao........................26
Bảng 1.2.8.4. Hàm lượng vitamin E trong một số thực phẩm trên thị trường ..........................27
Bảng 1.3.7.3.2 các ví dụ về giá trị ﾧ

1% ..................................................................48
E1cm

Bảng 1.2.8.3.4.2 : Các ví dụ về tỷ lệ thích hợp

của thuốc thử............................................50

Bảng 4.1.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến phép định lượng
α-tocopherol bằng HPLC............................................................................................................61
Bảng 4.1.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến phép

6


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.3.5.1. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1100................................33
Hình1.3.5.2 sơ đồ nguyên lý của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao..............................................34
Hình 3.2.1.1. Sơ đồ xử lý chất chuẩn.........................................................................................55
Hình 3.2.1.2. Sơ đồ xử lý mẫu dầu gấc......................................................................................55
Hình 3.2.1.3. Sơ đồ xử lý mẫu bơ và xốt trứng gà tươi.............................................................56
Hình 4.2.1. Sắc đồ mẫu chuẩn α-tocopherol có nồng độ 10ppm...............................................64
Hình 4.2.2. Sắc đồ mẫu chuẩn α-tocopherol có nồng độ 20ppm..............................................65
Hình 4.2.3. Sắc đồ mẫu chuẩn α-tocopherol có nồng độ 45ppm...............................................65

Hình 4.2.4. Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic thu
được và nồng độ các chuẩn α-tocopherol
...............................................................................................................
66
Hình 4.4.1.1 Sắc đồ mẫu Xốt trứng gà tươi...............................................................................71
Hình 4.4.1.2 Sắc đồ mẫu bơ......................................................................................................72
Hình 4.4.1.3 Sắc đồ mẫu Dầu gấc..............................................................................................72
Hình 4.4.1.4. Sắc đồ mẫu bơ thêm chuẩn α-tocopherol............................................................73
Hình4.4.2.1.1 Sắc đồ khảo sát thể tích bơm mẫu tại V=5μl......................................................73
Hình 4.4.2.1.2 Sắc đồ khảo sát thể tích bơm mẫu tại V=3μl.....................................................74
Hình 4.4.2.1.3 Sắc đồ khảo sát thể tích bơm mẫu tại V=10μl...................................................74
Hình 4.4.2.2.1 Sắc đồ khảo sát ở tốc độ dòng 0,7ml/phút........................................................75
Hình 4.4.2.2.2 Sắc đồ khảo sát ở tốc độ dòng 1ml/phút...........................................................75
Hình 4.4.2.2.3. Sắc dồ khảo sát ở tốc độ dòng 1,3ml/phút........................................................76
Hình 4.4.2.2.4 Sắc đồ khảo sát ở tốc độ dòng 0,3ml/min..........................................................76
Hình 4.4.2.3.1. Sắc đồ khảo sát ở tỷ lệ pha động 1,4-dioxan/n-hexan:5/95..............................77


Giới hạn phát hiện

8


LOQ:

Giới hạn định lượng / giới hạn xác định

UV – VIS: Ultraviolet – spectrophotometer
RDA:

Hàm lượng vitamin E cho phép sử dụng

PUFA:

hàm lượng axit béo không bảo hòa trong cơ thể

UV:

UltraViolet

BPC:

Sắc ký pha liên kết

LLC:

Sắc ký phân bố - Sắc ký chiết



đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình làm thí nghiệm, hướng dẫn cách sử
dụng máy HPLC đo mẫu.
Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các cán bộ trong khoa Hoá.
Và lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã động viên đã giúp đỡ tôi hoàn thành
khóa luận này.

Vinh, tháng năm
Sinh viên
Đậu Thị Loan

10


ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Lý do chon đề tài
Vitamin là một nhóm chất hữu cơ có phân tử tương đối nhỏ và có
bản chất vật lý, hóa học khác nhau, so với nhu cầu về các chất dinh dưỡng
cơ bản như protein, lipit, gluxit thì nhu cầu về vitamin rất thấp. Tuy nhiên
nhóm chất hữu cơ này đặc biệt cần thiết cho hoạt động sống của các cơ thể
sinh vật, Vitamin E (C29H50O2) là một trong những hợp chất hữu cơ quan
trọng ấy. Được phát hiện từ năm 1922, vitamin E chỉ được biết như là chất
có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh sản của các loại động vật và con
người. Vitamin E là một trong các loại vitamin không tan trong nước, rất dễ
hòa tan trong dầu, chất béo và các dung môi của mỡ (ether, axeton,
chlorofom, methanol), vitamin E chủ yếu có nguồn gốc từ thiên nhiên.
Cho đến nay, qua các công trình nghiên cứu người ta đã nhận ra và
chứng minh được tầm quan trọng của vitamin E đối với cơ thể, với vai trò
như là chất chống lại và thu dọn các gốc tự do, vitamin E bảo vệ cơ thể làm

bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).
2. Nhiệm vụ nghiên cứu
Trong luận văn này, chúng tôi có các nhiệm vụ :
- Nghiên cứu các tính chất vật lý, hóa học và phương pháp định
tính, định lượng α-tocopherol trong tinh dầu gấc, xốt trứng gà tươi và trong
bơ.
- Tách, chiết α-tocopherol trong mẫu tinh dầu gấc, xốt trứng gà
tươi và trong bơ.
- Định lượng α-tocopherol bằng phương pháp HPLC.
3. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu tinh dầu gấc, bơ thực vật và xốt trứng gà tươi được thu thập tại
siêu thị và các cửa hàng tạp hóa trong thành phố Vinh, mỗi mẫu được lấy
một ít đựng vào túi nilông sạch. Bao gồm:
- Dầu gấc Việt Nam G8
- Xốt trứng gà tươi Aji-mayo
- Bơ thực vật cao cấp Meizam.

12


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về vitamin
1.1.1. Khái niệm [1] [22]
Vitamin là hợp chất hữu cơ, phần lớn có phân tử tương đối nhỏ. Bản
chất hóa học, lý học của các vitamin rất khác nhau. Nhóm chất hữu cơ này
có một đặc điểm chung là đặc biệt cần thiết cho mọi hoạt động sinh sống
bình thường của các cơ thể sinh vật dị dưỡng.
Vitamin là những chất mà cơ thể con người không thể tự tổng hợp
được. Phần lớn phải đưa từ ngoài vào bằng con đường ăn uống. Mặc dù
lượng vitamin sử dụng ít nhưng khi thiếu một loại vitamin nào đó sẽ dẫn

vật và vi sinh vật có khả năng tổng hợp hầu hết các loại vitamin và tiền
vitamin (provitamin). Còn đối với người và động vật không có khả năng
tổng hợp mà chỉ sử dụng được vitamin lấy từ thức ăn. Một số loại vitamin
(B6, B12, acid pantotenic, acid folid...) được hệ vi khuẩn ở ruột tổng hợp
hoặc tạo ra trong cơ thể (ví dụ acid nicotinic được tổng hợp từ tryptophan),
tuy vậy các phản ứng này không đủ cung cấp cho nhu cầu của cơ thể.
1.1.2.2. Phân loại [1]
Dựa vào cơ sở sinh lý và hoá học vitamin được phân chia thành 2 nhóm
lớn:
Vitamin hòa tan trong chất béo (dầu): Có khả năng dự trữ trong cơ
thể, do vậy sự thiếu hụt tạm thời của chúng không dẫn đến tác hại lớn đối
với cơ thể. Khi cơ thể tiếp nhận một lượng lớn vitamin tan trong dầu, thì
nồng độ của chúng trong lipit của cơ thể có thể vượt qua mức bình thường
và trong một số trường hợp có thể dẫn đến những rối loạn quá trình trao đổi
chất và các rối loạn chức năng (bệnh thừa vitamin). [3]
- Vitamin A và caroten
- Vitamin D (Canxiferol)
- Vitamin E (Tocoferol)
- Vitamin K (Koagulation)
- Vitamin Q

14


Vitamin hòa tan trong nước: Chúng được tích lũy chỉ với lượng ít,
lượng dư thừa được thải qua đường nước tiểu.
- Vitamin B1 (Titamin)
- Vitamin B2 (Riboflavin)
- Vitamin B6 (Piridoxin)
- Vitamin B3 (Acid pantoneic)

mô mỡ, một lượng nhỏ ở trong những mô khác. Chúng được sử dụng khi
có nhu cầu của cơ thể nhưng mức độ dự trữ này có giới hạn.
Phần lớn các vitamin hoạt động như một phức hợp hoạt hóa enzym.
Một số khác như vitamin E và beta-caroten là những chất cần thiết cho sự
sống, thiếu chúng sẽ ảnh hưởng đến quá trình oxy hóa, gây ra bệnh tim
mạch, viêm và dị ứng.
Nhiều loại vitamin có đa tác dụng và phức tạp hơn, nhất là cấu tạo
nên hormon (vitamin D và vitamin A) do đó chúng tham gia vào nhiều
chức năng và không thể thiếu trong các quá trình sau:
- Thụ thai và phát triển của bào thai: Thiếu chúng có thể gây vô sinh
và biến dạng bào thai cũng như gây ra những biến chứng lúc mang thai và
sinh đẻ.
- Tăng trưởng và khoáng hóa xương: Thiếu chúng đưa đến những
vấn đề về tư thế và biến dạng xương.
- Cân bằng thức ăn: khả năng hấp thu nhiều chất dinh dưỡng (như
vitamin D đối với canxi).
- Hoạt động nhân lên của tế bào: Thiếu vitamin sẽ gây thiếu máu,
chậm liền sẹo, biến đổi da, lông, tóc và móng.
- Tính miễn dịch: Nếu thiếu vitamin, dễ bị mắc bệnh, dễ nhiễm
khuẩn vì giảm khả năng miễn dịch của cơ thể.
- Tổng hợp các chất vận chuyển trung gian của hệ thần kinh: Thiếu
vitamin sẽ làm giảm mức độ tập trung và trí nhớ đồng thời kém chống đỡ
với stress và dẫn đến lo lắng, thay đổi tính tình.
Quá trình đào thải cũng như trung hòa các chất độc, các gốc tự do

16


ngay cả sửa chữa các hư hỏng trong cơ thể, nếu thiếu vitamin sẽ làm tăng
độ nhạy cảm với các chất độc cũng như tăng nhanh quá trình lão hóa và

còn có nhiều tác dụng khác giúp nâng cao chất lượng sống của con người.
1.2.2. Lịch sử về vitamin E [22]
Vitamin E được khám phá vào năm 1922 bởi các nhà khoa học
Evans- Bishop, khi các nhà khoa học phát hiện thấy chuột cống được nuôi
dưỡng với một chế độ ăn thiếu vitamin E sẻ nảy sinh các vấn đề liên quan
đến sinh sản.
- Khi vitamin E được công nhận như là một hợp chất có tác dụng
phục hồi khả năng sinh sản, các nhà khoa học đặt cho nó tên hóa học là
tocopherol, từ tiếng Hi Lạp có nghĩa là “ sinh con”.
- Năm 1936, tách được vitamin E từ mầm lúa mì và dầu bông.
- Năn 1938, tổng hợp được bốn loại dẫn xuất của benzopiran là:
α-tocopherol, β-tocopherol, γ-tocopherol, δ-tocopherol gọi là nhóm vitamin E.
1.2.3. Nguồn cung cấp vitamin E [22]
Chủ yếu là dầu thực vật, rau xà lách, rau cải, dầu mầm hạt (mầm lúa
mì, lúa và ngô); trong dầu của một số hạt có dầu (đậu tương, vừng, lạc, hạt
hướng dương, dầu ô-liu...) hoặc trong tinh dầu một số loại quả ( quả bơ,
quả gấc...)
α-tocopherol có trong hạt cây hướng dương, dầu gấc, dầu bơ, còn
đậu tương và dầu ngô lại chứa các dạng khác nhiều hơn.
Ở động vật, vitamin E có trong mỡ bò, mỡ cá nhưng với hàm lượng thấp.
- Hàm lượng tocopherol trong một số nguồn như sau:

Dầu

αβγδTocopherol tocopherol tocopherol tocopherol tocopherol
chung
%lượng
%lượng
%lượng
%lượng


70 - 110
90 - 105

55 – 70
10

-

25 – 40
90

0 – 10
0

75 - 170

10

-

60

30

20 - 50

40 – 50

-

1 thìa cafe
1 thìa cafe
1 thìa cafe
1 OZ (28,35g)
1 OZ (28,35g)
1 OZ (28,35g)
½ tách
½ tách
1 quả

(-tocopherol (mg)
1.9
1.2
1.9
4.6
7.3
4.3
2.4
1.8
0.4
3.4

γ-tocopherol (mg)
0.1
10.8
8.2
0.1
0.3
0
2.4


Miligam
0.88
5.3
1.9
4.8
1.6
2.6
1.6
4.6
1.5

% RDA
5.8
35.3
12.6
32
10.6
17.3
10.6
30.6
10


Hạt hướng dương
Mầm lúa mì
Nước ép cà chua
Táo (trong vỏ)
Xoài xanh
Hạt hạnh nhân khô


6.1
20.3
0.4
0.81
2.32
6.72
6.7
3
2.56
1.46
11
2.32
1.15
0.53
5.93
0.42
0.63

40.6
135.3
2.6
5.4
15.4
44.8
44.6
5
17
9.7
73.3

Hột điều
Trái bơ
Khoai lang ta

Lượng vitamin E
1,2mg
2mg
150mg
15mg
12mg
2mg
3mg
20mg
3mg
15mg

Bảng 1.2.3.4. Hàm lượng vitamin E trong một số loại thực phẩm (mg/100g) [22]

20


1.2.4. Cấu trúc hóa học- phân loại [22]
Vitamin E thuộc loại vitamin tan trong dầu và các dung môi của mỡ
(ether, axeton, chlorofom, methanol) không tan trong nước. Có hai loại
vitamin E: loại có nguồn gốc thiên nhiên và loại tổng hợp, cả hai dạng đều
có cùng công thức phân tử, nhưng khác nhau về cấu trúc trong không gian
ba chiều.
Vitamin E có nguồn gốc thiên nhiên: Vitamin E có nguồn gốc thiên
nhiên được chiết xuất từ dầu thực vật như: Đậu tương, gấc, mầm lúa mạch,
các loại hạt có dầu như hạt hướng dương, hạt lạc... Vitamin E trong thiên

- Trong các loại tocopherol, α-tocopherol là thành phần chính tồn tại
trong cơ thể, có hoạt tính sinh học nhiều nhất của vitamin E. Các dạng khác
như beta (β), gamma (γ), delta (δ) dù hoạt tính thấp hơn loại alpha nhưng
cũng có tác dụng hỗ trợ rất lớn cho sức khỏe con người.
Tocotrienol:
- tocotrienol có bốn dạng, phân biệt với tocopherol nhờ chuỗi bên
cạnh bất bảo hòa, ít phân bố rộng rãi trong thiên nhiên.
Vitamin E tổng hợp: Được bào chế từ công nghệ hóa chất, là các
racemic D,L – alpha-tocopherol, gồm bảy đồng phân quang học, nhưng chỉ
có một đồng phân giống vitamin E thiên nhiên là D-alpha-tocopherol (chỉ
chiếm 12,5%), vì vậy tác dụng của vitamin E tổng hợp thấp hơn so với loại
có nguồn gốc thiên nhiên mặc dù về cơ chế hấp thu và sử dụng hai loại
vitamin E thiên nhiên và tổng hợp trong cơ thể không có gì khác nhau.
1.2.5. Tính chất của vitamin E [22]
1.2.5.1. Tính chất vật lý
- Các tocopherol có công thức phân tử là C29H50O2.
- Tocopherol là chất dầu lỏng không màu, hòa tan rất tốt trong dầu

22


thực vật, rượu etylic, đietyl ete, ete dầu hỏa.
- α-tocopherol thiên nhiên (danh pháp: (2R)-2,5,7,8-Tetramethyl-2[(4R,8R)-4,8,12-trimethyltridecyl]-3,4-dihydro-2H-chromen-6-ol) có thể
kết tinh chậm trong rượu metylic ở nhiệt độ -35 0C, sẽ thu được những tinh
thể hình kim có nhiệt độ nóng chảy từ 2.5-3,5 0C, nhiệt độ sôi 200-2200C áp
suất 0,1mmHg, Khối lượng riêng 0,950g/cm3.
- Vitamin E khá bền đối với nhiệt, có thể chịu được nhiệt độ 170 0C
khi đun trong không khí.
- Bị phá hủy nhanh chóng bởi tia tử ngoại.
- Đơn vị tính: IU là đơn vị quốc tế để đánh giá hoạt tính của vitamin

cách nhường một hyđro (H) của gốc phenol cho gốc lipoperoxyd (LOO *)
để biến gốc tự do này thành hyđroperoxyd không gây phản ứng vì tạo
LOOH.
Phản ứng như sau:
LOO* + Tocopherol- OH  LOOH + Tocopherol-O*
Hoặc:

Trong quá trình phản ứng, tocopherol (tocopherol-OH) bị chuyển
hóa thành gốc tocopheryl (tocopherol-O*), bền nên chấn dứt những phản

24


ứng gốc.
Gốc tocopherol bị khử oxy để trở lại tocopherol bởi chất khử oxy
hòa tan trong nước, hiện diện trong cytosol của những tế bào. Ngoài chức
năng ngăn chặn sự tạo thành những gốc tự do nơi tế bào, vitamin E còn bảo
vệ những chất tạo nên tế bào như protein và axit nucleic. Vitamin E làm
giản sự peroxy hóa của lipid trong bã nhờn của tóc, làm lớp da đầu bớt hiện
tượng kích thích, nghĩa là làm giảm sự khô xơ của tóc.
1.2.5.3. Tính chất chống viêm
Vitamin E ức chế sự peroxyd hóa các lipid bằng cách bẫy các gốc tự
do sẽ tạo thành prostaglandins, là chất trung gian sinh lý của sự viêm.
Nhiều nghiên cứu dược học đã chứng tỏ hoạt tính của vitamin E trên sự
chống viêm, vitamin E làm giảm bệnh viêm đỏ và bệnh phù bởi vậy khi ta
bị nắng rát da có thể dùng vitamin E để chữa.
Ngoài các tính chất trên vitamin E còn có tính chất làm ấm, giúp sự
luân chuyển mạch máu li ti của da.
1.2.6. Chức năng của vitamin E [22]
1.2.6.1. Chống oxy hóa