Bộ y tế
viện dinh dỡng
ZY báo cáo tổng kết đề tài

xác định d lợng penicillin g và v
trong thực phẩm bằng phơng pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao
Chủ nhiệm đề tài: ThS. Trần quang thủy 7106
16/02/2009


hữu hiệu giúp các cơ
quan chức năng kiểm soát tốt hơn vấn đề đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm.
Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu phương pháp xác định dư lượng Penicillin trong
thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Phương pháp có độ nhạy, độ
chọn lọc và độ chính xác cao. 2
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu về kháng sinh nhóm Penicillin
1.1.1 Đại cương
Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện một nấm mốc thuộc giống Penicillium ức
chế sự phát triển của vi khuẩn. Fleming gọi chất kháng khuẩn chưa được biết tới này là
Penicillin. 10 năm sau, một nhóm các nhà khoa học thuộc trường Đại học Oxford bắt
đầu nghiên cứu chất này trên chuột thí nghiệm. Penicillin được hoan nghênh như một
thứ thuốc thần kỳ và đã cứu sống vô số người trong chiến tranh thế giới thứ II [5]
Penicillin là kháng sinh thể hệ đầu tiên có tính kháng khuẩn rất mạnh đối với nhiều
loại vi khuẩn. Penicillin được chiết ra từ dịch nuôi cấy nấm Penicillium chrysogenum.
Penicillin lần đầu tiên phát hiện có tác dụng chống vi khuẩn gram dưng Staphylococcus,
Diplococcus nhưng hầu như không có tác dụng chống vi khuẩn gram âm và nấm men.
Vài thập niên trở lại đây đã phát hiện ra nhiều loại pencillin mới trong đó một số có hiệu
quả chống lại vi khuẩn gram âm và nấm men như Saccharomyces cerevisae đơn bội và
E.coli [5]
1.1.2 Phân loại
Pencillin gồm nhiều loại, chúng có cấu tạo
gần giống nhau, bao gồm một vòng tiasolidin, một
vòng β-lactam, một nhóm amino có gắn với CO

M
¹
ch bªn
Vßn
g
thiazolindine
Vßng β-lactam
3
1.1.3 Tác dụng của Penicillin
Giống như các họ kháng sinh khác, penicillin có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt
vi sinh vật gây bệnh.
Cơ chế tác dụng chung như sau:
Peptidoglycan là thành phần cơ bản tạo nên tính vững chắc của vách tế bào vi
khuẩn. Quy trình tổng hợp peptidoglycan được thực hiện nhờ enzym D-alanin
transpeptidase. Do là axit, các penicillin có khả năng acyl hoá các D-alanin transpeptidase,
làm cho các enzym này không thể tham gia vào quá trình tổng hợp peptidoglycan. Sinh
tổng hợp vách tế bào bị gián đoạn, vi khuẩn không thể tồn tại.
Mặt khác, các penicillin còn hoạt hoá enzym tự phân giải murein hydroxylase làm
tăng phân huỷ vách tế bào vi khuẩn, kết quả là vi khuẩn bị tiêu diệt.
1.1.4 Tác hại của penicillin khi tồn dư trong thực phẩm
Phần lớn các kháng sinh an toàn khi sử dụng đúng. Tuy nhiên dù ít hay nhiều
chúng đều có thể gây ra các tác dụng không mong muốn và tai biến.
Penicillin là kháng sinh ít độc, ít tác dụng không mong muốn, ngoại trừ phản ứng
dị ứng. Các sản phẩm phân huỷ kết hợp với protein tạo thành các kháng nguyên là
nguyên nhân của dị ứng và tuỳ theo cơ địa từng người phản ứng ở mức độ nào.
¾ Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh trong thực phẩm như sau:
Một là, có thể nhiễm lẫn vào thức ăn do tiếp xúc với môi trường có chứa kháng sinh và
có thể tồn dư do lỗi kỹ thuật sử dụng thường xuyên kháng sinh trong chăn nuôi
+ Kháng sinh cho vào thức ăn với mục đích kích thích tăng trọng cho gia súc.
+ Kháng sinh cho vào nước uống để phòng bệnh trong mùa dịch bệnh


2,76
Penicillin V
(350,39)
(2S,5R,6R)-3,3-dimethyl-7-
oxo-6-[[2-
(phenoxy)acetyl]amino]-4-
thia-1-
azabicyclo[3.2.0]heptane-2-
carboxylic acid

2,73
30 -
40
phút
1.2.2 Tính chất và tác dụng
Penicillin G và Penicillin V là hai penicillin tự nhiên thu được từ môi trường nuôi
cấy nấm penicillium chrysogenum.
Chúng được chỉ định trong bệnh nhiễm khuẩn thông thường: nhiễm khuẩn đường
hô hấp, tai mũi họng, nhiễm khuẩn huyết…
Penicillin G và V có độc tính thấp, nhưng cũng giống như các penicillin khác dễ
gây dị ứng thuốc: mẩn ngứa, mày đay, ngoại ban, hội chứng Stevens- johnson và Lyell,
nguy hiểm nhất là shock phản vệ.
Ngoài ra có thể gây viêm t
ĩnh mạch huyết khối, thiếu máu tan máu, giảm bạch cầu.
1.2.3 Tình hình sử dụng Penicillin
Mặc dù thuốc kháng sinh đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc chống lại
nhiều bệnh tật cho con người và các loài gia súc, gia cầm cũng như các loài thủy sinh,
nhưng việc sử dụng bừa bãi trong chăn nuôi có thể gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng như
gây độc, biến đổi hệ vi khuẩn của người tiêu dùng hoặc làm cho người tiêu dùng cũng bị

Thịt Thịt Gan Thận Sũa
Penicillin G
(ppb)
4 50 50 50 50 50 4
50
Thịt
Penicillin V
(ppb)
25

1.3 Các phương pháp xác định Penicillin
1.3.1 Trong nước
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5147-90 [9] đã qui định phương pháp gián tiếp sử
dụng quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS xác định Penicillin tổng số trong thịt và sản
phẩm thịt, dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn gia súc. Phương pháp này dựa vào
phản ứng tạo phức đặc trưng và hoàn toàn định lượng của cadimi với thuốc thử
phenaltrolin-cadimi sinh ra phức bền. Chiết phức này bằng nitrobenzen và đo phổ hấp thụ
6
nguyên tử AAS của kim loại cadimi trong phức ở pha hữu cơ, hay phân hủy pha hữu cơ
lấy cadimi vào dung dịch HCl 1% và đo phổ của cadimi. Phương pháp này phức tạp,
không đặc trưng và chỉ xác định được lượng tổng Penicillin.
Tiêu chuẩn ngành thuỷ sản TCN 197-2004 [8] qui định phương pháp định lượng
Penicillin trong sản phẩm thuỷ sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Penicillin trong sản
phẩm thuỷ sản được tách ra khỏi n
ền mẫu bằng dung dịch đệm phosphat, pH 9, làm sạch
và cô đặc dịch chiết trên cột Bond Elut C18, dẫn xuất hoá và định lượng bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao với detector PDA. Qui trình này trải qua quá trình dẫn xuất phức tạp và
mới chỉ dừng lại ở phạm vi thuỷ sản.
1.3.2 Thế giới
a) Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS

định đồng thời 7 penicillin trong thịt, gan, bầu dục gia súc và lợn bằng phương pháp
HPLC. Các penicllin được tách ra khỏi mẫu bằng H
2
O, loại các tạp chất hữu cơ với hỗn
hợp acid sulphuric và natri tungstat. Dịch chiết được làm sạch qua cột chiết pha rắn Oasis
HLB, được dẫn xuất hoá với anhydric benzoic, 1, 2, 4 - triazole và HgCl
2
. Các penicillin
được tách và định lượng trên cột C18, chương trình rửa giải gradient và phát hiện bằng
detectơ tử ngoại tại bước sóng 323nm. Giới hạn phát hiện LOD của phương pháp là từ
8,9-11,1 µg/kg đối với amoxicillin, penicillin G, ampicillin, oxacillin, nafcillin và 18,3-
20,9 µg/kg cho đicloxacillin.
8
CHƯƠNG II
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu
Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh (trong thức ăn, điều
trị bệnh gia súc, gia cầm) là rất phổ biến và được coi là một tiến bộ của công nghệ sinh
học, nhằm làm vật nuôi mau lớn. Thế nhưng, việc tuỳ tiện sử dụng thuốc kháng sinh dễ
dẫn đến hậu quả: Lượng thuốc kháng sinh tồn dư trong sản phẩm vượt ngưỡng cho phép,
người sử dụng loại thực phẩm này trong thời gian dài có thể gây nguy hại cho sức khoẻ.
Mục tiêu của đề tài là: Xây dựng được phương pháp xác định penicillin G và V với độ
nhạy và độ chính xác cao. Phân tích một số mẫu thực tế để thẩm định lại qui trình.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Việc phát triển các kỹ thuật xác định dư lượng penicillin G và V trong thực phẩm
là rất cần thiết giúp cho các cơ quan chức năng kiểm soát tốt hơn việc sử dụng kháng sinh
trong chăn nuôi. Để phù hợp với điều kiện của hầu hết các phòng thí nghiệm trong nước,
chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tử ngoại để
phát hiện và định lượng penicillin G và V. Cơ sở lí thuyết của phương pháp được tóm tắt

ghi sắc đồ của mẫu phân tích, và xác định thời gian lưu của từng pic ứng với mỗi chất
trong sắc đồ. Sau đó so sánh thời gian lưu của chất phân tích với thời gian lưu của chất
chuẩn, từ đó sẽ xác định được trong mẫu phân tích có những chất nào.
Trong HPLC có thể dùng một trong 2 phương pháp là phương pháp đường chuẩn
hoặc phương pháp thêm tiêu chuẩn để định l
ượng. Việc dùng phương pháp nào trong hai
phương pháp đó tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng chất phân tích
H
i
= k
1.
C
i

S
i
= k
2
. C
i

H
i
, S
i
là chiều cao pic và diện tích pic tương ứng của chất i
C
i
là nồng độ chất i
K

2.3.2 Hoá chất
Các loại hóa chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích
- Chuẩn Benzyl penicillin (Penicillin G) (từ Sigma) Penicillin G sodium salt
(C
16
H
17
N
2
NaO
4
S)
- Chuẩn phenoxymetyl penicillin Kali (Penicillin V) (viện kiểm nghiệm thuốc trung
ương) C
16
H
17
KN
2
O
5
S (98,90%)
- Acetonitril
11
- Methanol
- Natri tungstat
- Thuỷ ngân (II) clorid
- 1,2,4- triazole
- Natri thiosulfat
- Natri hydroxid

2
O; 8,84 gam KH
2
PO
4
và 3,89 gam Na
2
S
2
O
3
. Hoà tan hỗn hợp
trên vào nước và chuyển vào bình định mức 1000 ml, định mức đến vạch bằng nước cất.
2.3.3.5 Chuẩn bị pha động chạy sắc ký.
12
- Kênh A: Lấy 240ml acetonitril, 60 ml metanol cho vào bình định mức 1000 ml và định
mức đến vạch bằng đệm photphat pH 6,5.
- Kênh B: Lấy 300ml acetonitril và 200 ml metanol cho vào bình định mức 1000 ml và
định mức đến vạch bằng đệm photphat pH 6,5.
2.3.3.6 Chuẩn bị dung dịch Natri tungstat 0,68M
Cân 22,43 gam Na
2
WO
4
.2H
2
O, hoà tan và định mức bằng nước cất đến 100 ml.
2.3.3.7 Chuẩn bị dung dịch acid sulfuric 0,68M
Hút 3,8 ml dung dịch H
2
13
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Tối ưu các điều kiện xác định penicillin G và V bằng HPLC
3.1.1 Chọn bước sóng phát hiện
Detectơ là một bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp.
Penicillin G và V hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại. Do vậy, chúng tôi đã lựa chọn
detectơ PDA để phát hiện và định lượng 2 penicillin này. Tham khảo tài liệu [11] với các
điều kiện sau:
- Cột Symmestry waters C18 (150mm × 4,6mm × 5µm)
- Detectơ PDA: 220nm
- Nhiệt độ buồng cột: 35
o
C
- Tốc độ dòng: 1,5ml/phút
- Pha động: A: H
2
O (0,01% TFA); B: ACN (0,01% TFA) với chương trình gradient:
Bảng 3: Chương trình gradient rửa giải các penicillin (không dẫn xuất)
Thời gian %A %B
0 100 0
3 100 0
8 63 37
19 63 37
20 100 0
25 100 0
Bơm hỗn hợp chuẩn 2 penicillin: PenG 25ppm, PenV 56ppm thu được sắc đồ sau:
Minutes
0

Hình 4: Sắc đồ chạy mẫu thịt lợn
(thêm chuẩn ở mức 1mg/kg đối với Pen G và 2,2mg/kg đối với Pen V) (không dẫn xuất)
Có thể sử dụng detectơ PDA tại bước sóng 220nm để xác định các penicillin. Tuy
nhiên giới hạn phát hiện của phương pháp này không cao (LOD ~ 2ppm). Mặt khác, có
rất nhiều chất hấp thụ tại vùng bước sóng 220nm, nên sắc đồ thu được chứa nhiều tạp
chất gây khó khăn cho việc phát hiện và định lượng chất phân tích. Tức là phương pháp
này có độ nhạy và độ chọn lọc kém. Do vậy, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp dẫn xuất
hoá các penicillin để mở rộng vùng bước sóng UV làm tăng độ chọn lọc của phương
pháp, giảm tối đa ảnh hưởng độ hấp thụ của nền mẫu. Tác nhân dẫn xuất được sử dụng ở
đây là hỗn hợp 1,2,4-triazole và thuỷ ngân (II) clorid. Sản phẩm của quá trình dẫn xuất
hấp thụ cực đại tại bước sóng 225nm và 323nm. Chúng tôi lựa chọn bước sóng 323nm để
phát hiện và định lượng các penicillin.

Hình 5: Sắc đồ 3D của hỗn hợp chuẩn Penicillin G 0,4ppm – Penicillin V 0,8ppm.
15
3.1.2 Chọn pha động
Sau pha tĩnh thì pha động là yếu tố thứ hai quyết định đến hiệu quả tách sắc ký.
Nhìn chung, pha động có thể ảnh hưởng đến: độ chọn lọc của hệ pha, thời gian lưu trữ,
hiệu lực của cột tách, độ phân giải, độ rộng của pic sắc ký.
Trong HPLC, pha động phân cực được sử dụng phổ biến với thành phần chủ yếu
là n
ước mang lại tính kinh tế cao. Để tách 2 penicillin ra khỏi các chất cản trở trong nền
mẫu và định lượng nó một cách dễ dàng và chính xác, pha động sử dụng phải phân cực.
Để đảm bảo sự ổn định của kết quả, đặc biệt là thời gian lưu, chúng tôi sử dụng hệ đệm.
Hệ đệm được lựa chọn ở đây là đệm photphat 0,1M; pH 6,5. Khảo sát chương trình pha
động trên 3 kênh:
A: Đệm photphat 0,1M; pH 6,5; B: ACN; C: MeOH
C
ố định các điều kiện:
- Cột Symmestry waters C18 (150mm × 4,6mm × 5µm)

4.107 33212
1: 323 nm, 8 nm
Pens
std mix 200_60-30-10.dat
Name
Retention Time
Area

Hình 5: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 2 penicillin nồng độ 0,4ppm
tại thành phần pha động A: B: C = 60 : 30 : 20
Từ bảng kết quả trên, chúng tôi nhận thấy, với chế độ chạy isocractic: nếu thành
phần pha động chỉ gồm đệm photphat và MeOH thì chất phân tích không được rửa giải;
nếu thành phần pha động chỉ gồm đệm photphat và ACN thì thời gian lưu của 2 penicillin
thấp và chúng không tách khỏi nhau được. Thành phần pha động có cả đệm photphat,
ACN và MeOH với các tỉ lệ khác nhau thì thời gian lưu có cao hơn nhưng khả năng tách
của 2 chất ra khỏi nhau vẫn chưa tốt. Do vậy, chúng tôi sử dụng chế độ gradient với
chương trình rửa giải như sau:
A: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 700 : 240 : 60
B: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 500 : 300 : 200
Bảng 5: Chương trình gradient rửa giải các penicillin (dẫn xuất)
Thành phần pha động
Thời gian (phút)
%A %B
0 100 0
20 0 100
21 100 0
25 100 0

Ban đầu, giữ ổn định ở 100%A. Từ 0-20 phút, thành phần pha động thay đổi
tuyến tính từ 100%A đến 100%B. Trong khoảng thời gian này, chất phân tích được rửa

- Mẫu phân tích: dung dịch chuẩn hỗn hợp 2 penicillin 0,4ppm

Thu được các kết quả sau:
Minutes
0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
mAU
1 2 3
mAU
1
2
3
PenG 8.309 28513 1385
PenV 9.461 22263 1022

Hình 7: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp 2 penicillin nồng độ 0,4ppm
(cột Symmestry waters: 150mm × 4,6mm × 5µm)
18
Minutes
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
mAU
1 2 3 4
mAU
1
2
3
4
PenG 12.640 45263
PenV 14.016 34526


- Cột Symmestry waters C18 (250mm × 4,6mm × 5µm)
- Pha động: chương trình gradient
A: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 700 : 240 : 60
B: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 500 : 300 : 200
19
Thành phần pha động
Thời gian (phút)
%A %B
0 100 0
20 0 100
21 100 0
25 100 0

- Detectơ: PDA 323nm
- Nhiệt độ buồng cột: 40
o
C
- Tốc độ dòng: 1ml/phút

3.2 Tối ưu hoá các điều kiện xử lí mẫu
Nguyên tắc: Penicillin G và V được tách ra khỏi nền mẫu bằng nước cất, loại các
tạp chất hữu cơ bằng hỗn hợp acid sulphuric và natri tungstat, làm sạch qua cột chiết pha
rắn SPE, dẫn xuất với hỗn hợp 1,2,4-triazole và thuỷ ngân (II) clorid, phát hiện và định
lượng bằng săc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tử ngoại.

QUY TRÌNH DỰ KIẾN CHIẾT PENICILLIN G VÀ V

20

5ml đ

Rửa giải bằng 10ml ACN/bình cất quay
HPLC
Rung siêu âm ở 55
o
C, 30 phút
Cô quay đến cạn, 40
o
C
+ 500µL đệm photphat 25mM, pH 9
+ 500µL hỗn hợp dẫn xuất
3ml MeOH
3ml H
2
O
r
ửa
t
ạ
p
Hút khô 1 phút
21
3.2.1 Khảo sát cột chiết pha rắn SPE
Khảo sát hiệu lực chiết penicillin G và V trên hai loại cột: cột SPE C18 và cột
SPE Polymeric. Sử dụng nền mẫu thịt lợn không phát hiện penicillin, thêm cùng một mức
chuẩn: PenG 40mg/kg, Pen V 60mg/kg , mỗi loại cột làm lặp 3 lần. Tiến hành phân tích
như qui trình trên, tiêm vào hệ thống HPLC và lấy kết quả trung bình:
Bảng 6: Ảnh hưởng của loại cột SPE đến hiệu lực chiết các penicillin
Loại cột SPE
Diện tích Pen G
(mAU)

Hình 11: Sắc đồ chạy mẫu thịt lợn thêm chuẩn: PenG 40mg/kg, Pen V 60mg/kg
(sử dụng cột C18)
Về bản chất, hai loại cột này khác nhau không nhiều, chúng đều là cột pha đảo. Cột C18
bao gồm các gốc C18 gắn trên bề mặt của silica. Cột Polymeric bao gồm các mạch
polime gắn lên bề mặt silica. Tuy nhiên, với cấu tạo của Penicillin G và V, cột Polymeric
22
có khả năng lưu giữ tốt hơn do lực tương tác Vandevan mạnh hơn. Do đó, làm sạch mẫu
sử dụng cột Polymeric cho nền mẫu sạch hơn và hiệu quả chiết tốt hơn.
3.2.2 Khảo sát pH của dịch chiết trước khi qua SPE
pH của dịch chiết trước khi qua SPE ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất chiết
các penicillin. Sau khi li tâm, pH của dịch chiết nằm trong khoảng 4 – 5. Chúng tôi tiến
hành khảo sát ảnh hưởng của pH trong khoảng 4 – 11. Sử dụng mẫu thịt lợn không phát
hiện penicillin, thêm cùng một nồng độ chuẩn: Pen G 50mg/kg, Pen V 200mg/kg, tại mỗi
mức làm lặp 3 lần và lấy kết quả trung bình thu được bảng sau:
Bảng 7: Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả chiết qua SPE
pH 4,4 6,43 7,71 8,23 8,56 9,15 10,01 11,07
Diện tích
pic PenG
(mAU)
14902 15039 17596 18853 19563 17755 13493 5236
Diện tích
pic PenV
(mAU)
23225 26534 30868 31859 32785 31396 25267 15334

Vẽ đồ thị mối quan hệ giữa diện tích pic penicillin G và V vào pH thu được đồ thị sau:
0
5000
10000
15000

1.0
1.5
2.0
2.5
PenG 13.269 15596
PenV 14.709 26868

Hình 13: Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn Pen G 50mg/kg, Pen V 200mg/kg
(điều chỉnh pH = 6,43 trước khi qua SPE)

QUY TRÌNH CHIẾT PENICILLIN G VÀ V TRONG THỰC PHẨM
24
Mẫu (~5g)/ống li tâm 50ml
+ 20ml H
2
O
+ 2ml H
2
SO
4
0,68M
+ 2ml Natri tun
g
stat 0
,
68M
Lắc vortex, để yên 5 phút
Đồng nhất
Lọc / bình nón 50ml
Li tâm 6000 v/ph, 5 phút

ạ
p
Hút khô 1 phút