GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG

NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI
HÀM LƯỢNG VITAMIN A, D2, D3 TRONG MỘT SÔ
THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGHỆ AN - 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG

NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI
HÀM LƯỢNG VITAMIN A, D2, D3 TRONG MỘT SÔ
THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 60.44.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 6
MỞ ĐẦU 11

1. Lý do chọn đề tài 11
2. Mục đích nghiên cứu 12
3. Nhiệm vụ nghiên cứu 12
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 12
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 13

1.1. Vitamin D 13
1.1.1. Giới thiệu, cấu tạo, phân loại và tên gọi 13
1.1.2. Nguồn cung cấp vitamin D cho cơ thể 17
1.2. Vitamin A 20
1.2.1. Giới thiệu 20
1.2.2. Vai trò của vitamin A 22
1.2.3. Nguồn cung cấp vitamin A cho cơ thể 24
1.3. Các phương pháp xác định vitamin A và D 24
1.3.1. Phương pháp thử nghiệm sinh học 24
1.3.2. Phương pháp quang phổ 25
1.3.3. Các phương pháp xét nghiệm miễn dịch 26
1.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 28
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 37

2.1. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 37

chuẩn vitamin A, D2, D3 52
3.4. Xây dựng đường chuẩn của vitamin 52


6
3.5. Khảo sát độ lặp lại của máy 56
3.6. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương
pháp 56
3.7. Xác định hiệu suất thu hồi 58
3.8. Kết quả phân tích một số mẫu thực phẩm 60
KẾT LUẬN 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO 65
PHỤ LỤC 68

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
25(OH)D

:

25-hydroxyl vitamin D

25(OH)D2

:

25-hydroxyl vitamin D2

25(OH)D3

:


Phép phân tích Fourier hồng ngoại (Fourier transform infrared)

HPLC

:

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IT

:

Bẫy ion ( Ion trap)

IS

:

Chất nội chuẩn(internal standard)

LC

:

Sắc kí lỏng (Liquid chromatography)

MeOH

:


Tia tử ngoại


7
DAD

:

Đầu dò mảng diot

RMSE

:

Độ lệch khởi động (root mean square error)

THF

:

Tetra hydro furan

ACN

:

Aceton nitril

LOD

Bảng 3.2. Thời gian lưu - diện tích peak của các vitamin khi thay đổi tỷ lệ
MeOH:MTBE 49
Hình 3.6. Sắc ký đồ các vitamin khi thay đổi tỷ lệ MeOH:ACN 50
Bảng 3.3. Thời gian lưu - diện tích peak của các vitamin khi thay đổi tỷ lệ
MeOH:ACN 50
Hình 3.7. Sắc ký đồ của các vitamin ở các tốc độ dòng khác nhau 51
Bảng 3.4. Sắc ký đồ của vitamin D2 ở dòng 1 ml/phút (a) và 0,5 ml/phút (b)
52
Bảng 3.5. Tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn của vitA 53
Bảng 3.6. Tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn của vit D2 53
Bảng 3.7. Tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn của vit D3 53
Hình 3.8. Peak của các nồng độ vitamin D2, D3, A trong đường chuẩn xếp
chồng lên nhau 54
Hình 3.9. Đường chuẩn vitamin A 54
Hình 3.10. Đường chuẩn vitamin D2 55
Hình 3.11. Đường chuẩn vitamin D3 55


10
Bảng 3.8. Độ lặp lại của máy HPLC 56
Bảng 3.9. LOD, LOQ của vitamin A 57
Bảng 3.10. LOD, LOQ của vitamin D2 57
Bảng 3.11. LOD, LOQ của vitamin D3 58
Bảng 3.12. Kết quả xác định hiệu xuất thu hồi đối với các vitamin 59
Bảng 3.13. Tổng hợp các điều kiện phân tích vitamin A, D2, D3 60
Bảng 3.14. Kết quả phân tích một số mẫu thực phẩm 60
Hình 3.12. Sắc đồ mẫu cà rốt 61
Hình 3.13. Sắc đồ mẫu gan bò 61
Hình 3.14. Sắc đồ mẫu gan cá Tra 61
Hình 3.15. Sắc đồ mẫu gan gà 62

Vitamin cần thiết cho cơ thể nhưng thừa vitamin cũng có thể gây nên những
vấn đề nghiêm trọng. Trái với nhóm các vitamin tan trong nước khi thừa đều
thải ra theo đường nước tiểu thì các vitamin tan trong dầu được dự trữ ở gan
với các mức độ khác nhau. Với một lượng vitamin A, D quá cao có thể gây


12
ngộ độc cho cơ thể. Nếu thừa vitamin A trong thời gian dài gây đau xương
khớp, rụng tóc, môi khô nứt nẻ, chán ăn, gan lách to. Còn khi dùng với liều
cao D2, D3 hàng nghìn lần liều phòng có thể gây ngộ độc. Các triệu chứng hay
gặp là kém ăn, buồn nôn, nóng, tiểu nhiều, ngừng lớn, xanh xao, đôi khi gây
co giật khó thở.
Với những đặc điểm trên, kiểm soát và bổ sung hàm lượng vitamin phù
hợp là rất quan trọng, nhất là khi trên thị trường ngày càng xuất hiện nhiều
loại thực phẩm chế biến sẵn có bổ sung vitamin A và D. Vì vậy việc phân tích
hàm lượng vitamin A, D trong thực phẩm là cần thiết, vừa để xây dựng một
quy trình định lượng đồng thờivitamin trong thực phẩm, vừa để góp phần xây
dựng bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm địa phương.Có nhiều phương
pháp, kĩ thuật đánh giá hàm lượng vitamin A, D2, D3 trong thực phẩm, trong
đó phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho phép phân tích với độ nhạy và
độ chọn lọc cao. Vì vậy chúng tôi đã chọn đề tài “NGHIÊN CỨU, XÁC
ĐỊNH ĐỒNG THỜI HÀM LƯỢNG VITAMIN A, D 2, D3 TRONG MỘT SÔ
THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)”.
2. Mục đích nghiên cứu
Xây dựng được phương pháp xác định đồng thời hàm lượng vitamin A,
D2, D3 trên máy HPLC.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Thiết lập được phương pháp phân tích đảm bảo độ chính xác, độ hội
tụ, độ nhạy cao, xác định được LOD và LOQ của phương pháp.

một số bệnh ung thư, vì vitamin D điều hoà lượng canxi trong máu ức chế tế
bào ung thư, đặc biệt là ung thư gan và ung thư đại trực tràng. Bà mẹ mang


14
thai nếu thiếu vitamin D dẫn đên con sinh ra còi xương, khuyết tật, nhất là 3
tháng đầu thai kì, sẽ là tổn thương não không thể phục hồi.

Hình 1.1. Khái quát về cấu trúc và sự chuyển hóa các dạng vitamin D
Các biểu hiện cho thấy trẻ bị thiếu vitamin D: thần kinh bị kích thích,
ngủ không yên giấc, hay tỉnh giấc, quấy khóc, và rõ ràng nhất là ở trẻ dưới 3
tháng tuổi), hay bị mồ hôi trộm cả khi trời lạnh, bị co giật nếu sốt cao, có thể
khó thở. Nếu tình trạng thiếu vitamin D trầm trọng sẽ gây biến đổi cơ, biến
dạng xương, sẽ ảnh hưởng đến chiều cao tầm vóc của trẻ sau này và khó có
thể phục hồi. Vì vậy, các mẹ cần cung cấp đủ lượng vitamin D mỗi ngày cho
trẻ để trẻ phát triển bình thường với tầm vóc cao to khoẻ mạnh.


15
Thiếu vitamin D làm giảm hàm lượng serotonin trong não, ảnh hưởng
đến tinh thần của con người. Serotonin là một loại hoocmon được gọi là
“hoocmon hạnh phúc”, suy giảm lượng hoocmon này khiến tâm trạng con
người bất ổn, dễ buồn chán, cáu bẳn, không kiểm soát được hành động và suy
nghĩ, nếu thiếu hụt một cách trẩm trọng sẽ dẫn đến trầm cảm. Nguyên nhân
chính dẫn đến thiếu hụt lượng vitamin D trong cơ thể là ít tiếp xúc với ánh
nắng mặt trời, dù cho có chế độ ăn đầy đủ và đều đặn.
Vitamin D đã được hoạt hoá duy nhất ảnh hưởng đến 2000 gen, đặc
biệt là tăng cường hệ miễn dịch. Vì vậy, thiếu vitamin D trong cơ thể gây ra
các chứng bệnh nan y như:
1. Bệnh cúm: ở trẻ nếu thiếu hụt vitamin D sẽ làm giảm khả năng miễn

• Thiếu nghiêm trọng
Ngoài ra, sữa không những rất bổ dưỡng cho trẻ em mà còn có tác dụng tốt
với sức khỏe của người lớn. Các nhà nghiên cứu chỉ ra rằng vitamin D có
trong sữa có khả năng chống lão hóa, do đó hãy thêm sữa vào thực đơn
hằng ngày của bạn.
Lòng đỏ trứng:
Trứng là một thực phẩm giàu vitamin D, đặc biệt là phần lòng đỏ trứng.
Lòng đỏ trứng có khả năng điều hòa hệ thần kinh, hệ tim mạch và não. Hơn
nữa, trứng còn làm giảm nguy cơ bị đục thủy tinh thể cũng như kích thích tóc
mọc nhanh hơn.
Cá hồi:
Cá hồi cũng là những nguồn cung cấp vitamin D rất lớn. Thực tế, cá
hồi là một trong những nguồn vitamin D tự nhiên và các axít béo thiết yếu
rất hiếm có. Loại cá này giúp cải thiện các chức năng của não bộ và bảo vệ
hệ thần kinh. Nó hoạt động như một chất chống trầm cảm và do đó hỗ trợ
trong việc giúp não thư giãn, tăng hiệu quả hoạt động của não và cải thiện
trí nhớ.
Dầu gan cá:
Dầu gan cá tuyết được biết đến rộng rãi như là một nguồn cung cấp một
lượng lớn vitamin D. Loại dầu cá này có khả năng cải thiện tình trạng của tim
và hệ tim mạch. Hơn nữa, nó hỗ trợ trong việc tăng cường các hoạt động của
cơ bắp và độ đàn hồi của mạch máu. Các nghiên cứu đã cho thấy dầu gan cá
giúp làm giảm lượng cholesterol cao trong máu và làm loãng máu, do đó giảm
nguy cơ tắc nghẽn động mạch.


19
Cá mòi đóng hộp
Mặc dù cả cá mòi tươi và đóng hộp đều được ưa chuộng nhưng cá mòi
đóng hộp được cho rằng có lợi hơn cho sức khỏe. Ngoài các chất dinh dưỡng
khác, cá mòi đóng hộp rất giàu vitamin D, do đó giúp cải thiện sức khỏe của

Bảng 1.1 Nhu cầu vitamin D mỗi ngày của các lứa tuổi [12].

STT

Lứa tuổi

Liều

Liều lượng

lượng(IU)

(µg)

Khuyến cáo-

Khuyến cáotối đa
5-25

1

0-6 tháng

tối đa
200-1000

2

6-12 tháng


14-18 năm

600-4000

15-100

4

19-70năm

600-4000

15-100

5

Từ 71 tuổi trở đi
Phụ nữ mang thai và cho
con bú

800-4000

20-100

600-4000

15-100

6


CH3
CH2

OH

CH3
Retinyl acetat C22H32O2 (2E, 4E, 6E, 8E) 3 - 7 - dimethyl - 9 - (2 - 6 6 - trimethyl - 1 - cyclohexen - 1 - yl) - 2,4,6,8 - nona tetraen - 1 - yl acetat

H3C

CH3

CH3

CH3

O
CH2 O

C

CH3

CH3
Retinyl propionate C23H34O2 (2E, 4E, 6E, 8E) 3 - 7 - dimethyl - 9 - (2 - 6 6 - trimethyl - 1 - cyclohexen - 1 - yl) - 2,4,6,8 - nona tetraen - 1 - yl propionat

H3C

CH3



C

(CH2)14 CH3

CH3
Vitamin A có tính chất hóa học sau:
- Không tan trong nước, tan tốt trong các dung môi của lipit, ete,
ethanol…
- Bền trong điều kiện yếm khí, bền với acid và kiềm ở nhiệt độ
không quá cao.
- Dễ bị oxy hóa bởi oxy không khí, ánh sáng làm tăng quá trình oxy
hóa vitamin A
- Dưới tác dụng của enzyme dehydrogenase thì retinol chuyển sang
dạng retinal.
- Phản ứng với SbCl3 cho phức chất màu xanh.
- Phản ứng với H2SO4 cho phức chất màu nâu.
1.2.2. Vai trò của vitamin A
Vitamin A có vai trò quan trọng trong sự phát triển của phôi thai, hình
thành cơ quan trong quá trình phát triển của thai nhi, chức năng miễn dịch
bình thường, và phát triển của mắt và thị lực.
Vitamin A có các chức năng :
- Bảo vệ cấu trúc của da trong toàn bộ cơ thể.
- Yểm trợ thị giác trong quá trình phân biệt vùng sáng và vùng tối.
- Xúc tác sự phóng thích tố sinh dục và hưng phấn quá trình thụ thai.
- Phát triển sự tăng trưởng của nhau và bào thai.
- Hưng phấn quá trình kiến tạo tủy xương.
- Ức chế độc chất sinh ung thư và gây xơ cứng tế bào.
Vitamin A là một vi chất có vai trò đặc biệt quan trọng với cơ thể, gồm
4 vai trò chính :



24
tiêu chảy có thể là các triệu chứng hàng đầu gắn liền với ngộ độc ít nghiêm
trọng. Các triệu chứng ngộ độc nói trên chỉ xảy ra với dạng tạo thành trước
(retinoit) của vitamin A (chẳng hạn từ gan), còn các dạng caretonoit (như βcarotene trong cà rốt) không gây các triệu chứng như vậy.
1.2.3. Nguồn cung cấp vitamin A cho cơ thể
Vitamin A trong thực phẩm có nguồn gốc động vật dưới dạng retinol,
còn thức ăn có nguồn gốc thực vật ở dưới dạng caroten (tiền vitamin A).
Retinol (các nguồn động vật): cá tuyết và cá bơn, dầu gan, thịt bò, bê, thịt
cừu và thịt gà, gan, bơ, phô mai, trứng, sữa, cá thu, thịt bò, cá mòi đóng hộp...
Beta-Carotene (pro-vitamin A, các nguồn thực vật): cải xoăn, cà rốt
thường xuyên, rau mùi tây, rau bina, khoai lang, mơ khô, cải xoong, cải xanh,
xoài, cà chua, bắp cải, đậu Hà Lan đông lạnh...
1.3. Các phương pháp xác định vitamin A và D
1.3.1. Phương pháp thử nghiệm sinh học
Phương pháp chính thức đầu tiên để xác định vitamin D là phương
pháp thử nghiệm sinh học, trong đó hoạt tính sinh học của vitamin D được
xác định bằng khả năng của nó ngăn ngừa hoặc cải thiện các triệu chứng thiếu
hụt vitamin D trong cơ thể. [16].
Bằng cách đo khả năng hoạt động chống còi xương, bằng thử nghiệm
trên loài chuột (kiểm tra điểm vôi hóa hoặc kiểm tra chữa bệnh còi xương) đã
từ lâu được sử dụng để xác định vitamin D trong thực phẩm hoặc các dược
phẩm. Chuột còi xương được cho ăn bằng thức ăn có chứa một lượng khác
nhau của vitamin D đã được thiết lập theo các định mức tiêu chuẩn. Sau bảy
ngày, xương của những con chuột được xử lý bằng dung dịch nitrat bạc.
Lượng canxi mới được chuyển vào xương được biểu hiện thành vết tối trên
ảnh chụp. Thang tiêu chuẩn được thiết lập bằng cách xây dựng mối liên hệ
giữa các vùng tối trên xương với lượng vitamin D trong chế độ ăn uống (cho