Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh họcTrần Thị Nguyệt
1
Lớp 0601MỞ ĐẦU

Hàng năm trên thế giới các bệnh thực vật như bệnh đạo ôn, bệnh xì mủ,
thối cổ rễ gây ra những tổn thất nặng nề cho sản xuất nông nghiệp. Khoảng
hơn 8000 loài nấm có khả năng gây bệnh cho cây trồng và một vài loài nấm
có thể gây hại trên nhiều loại cây trồng[5]. Trong đó các bệnh do nấm
Phytophthora spp. gây ra được xem rất nguy hiểm ở nhiều loại cây như sầu
riêng, cam, quýt, nhãn Ở Mỹ, nấm Phytophthora spp. gây thiệt hại cho cây
trồng gây thất thu hàng tỉ đô la mỗi năm. Chỉ ở bang Ohio của Mỹ, nấm
Phytophthora spp. gây bệnh thối rễ trên cây đậu nành làm thiệt hại trên 50
triệu đô la mỗi năm. Ở Việt Nam từ năm 1998 đến nay, bệnh này đã phát triển
và gây hại ở một số tỉnh phía Nam. Bệnh do nấm Phytophthora spp. gây ra là
bệnh rất nguy hiểm trên cây ăn quả, bởi chúng tấn công và gây hại cho cây từ
giai đoạn cây con đến giai đoạn trưởng thành, thậm chí đến giai đoạn sau thu
hoạch. Trong điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, trồng trọt quanh năm, sự
lan truyền của các tác nhân gây bệnh trong nước tưới, hệ thống thoát nước
kém, cây giống không sạch bệnh là những yếu tố tạo điều kiện thuận lợi cho
sự phát triển của bệnh này.
Trên thế giới, hàng loạt các biện pháp phòng trừ nấm bệnh đã được các
nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu và được áp dụng[1, 8]. Việc sử
dụng thuốc hoá học trừ nấm bệnh thường rất độc và rất tốn kém, có khả năng
tồn dư trong đất, nước, nông sản sẽ gây ảnh hưởng tới sức khoẻ con người,
gây ô nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái. Mặt khác việc sử dụng

trên thế giới hiện nay, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:"Nghiên cứu sử
dụng các tác nhân vi sinh vật trong đấu tranh sinh học để phòng trừ bệnh
nấm hại rễ (Phytopthora spp.) ở cây trồng có múi”.
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh họcTrần Thị Nguyệt
3
Lớp 0601CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. ĐẤU TRANH SINH HỌC (Biological control)
1.1.1. Khái niệm
Đấu tranh sinh học là việc giảm các quần thể phá hoại bằng các đối thủ
tự nhiên và thông thường có sự tham gia tích cực của con người. Các đối thủ
tự nhiên của các loài phá hoại, còn được gọi là các tác nhân đấu tranh sinh
học bao gồm những loài ăn mồi, các loài kí sinh và các mầm bệnh. Các tác
nhân đấu tranh sinh học đối với các bệnh ở thực vật thường được đề cập là
các loài đối kháng (antagonist). Các tác nhân đấu tranh sinh học của cỏ dại

nhau ở thực vật. Các tương tác giữa vi sinh vật và cơ thể thực vật chủ có thể
là rất phức tạp, những tương tác dẫn tới quá trình kiểm soát sinh học bao gồm:
kháng sinh, cạnh tranh, cảm ứng sự kháng của vật chủ và tiêu diệt. Khi kiểm
tra các chủng vi khuẩn và nấm được phân lập từ môi trường về hoạt tính đấu
tranh sinh học thì có ít nhất từ 1 đến 10% khả năng ức chế sự sinh trưởng của
các mầm bệnh. Tuy nhiên, một vài dòng có thể ức chế các bệnh ở thực vật
dưới các điều kiện sinh trưởng khác nhau và một vài loài có phổ tác dụng
rộng chống lại nhiều loài mầm bệnh. Chính vì vậy, việc sàng lọc kỹ càng sẽ
tạo ra nhiều vi sinh vật trong việc phát triển các chế phẩm thương mại. Một
vài dòng vi sinh vật đã được thương mại hoá thành công và hiện tại được
phân phối như là các chất diệt loài gây hại sinh học ở Mỹ, bao gồm các vi
khuẩn thuộc về các chi Agrobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces
và nấm thuộc về các chi Ampelomyces, Candida, Coniothyrium, Trichoderma.
Sàng lọc là một bước quan trọng trong việc phát triển các tác nhân đấu tranh
sinh học. Thành công của các giai đoạn sau đó sẽ phụ thuộc vào phương pháp
sàng lọc để xác định một loài thích hợp. Nhiều tác nhân đấu tranh sinh học
hữu dụng đã được phát hiện bằng cách quan sát các vùng ức chế trên đĩa
thạch. Đối với sự cạnh tranh, các phương pháp sàng lọc bao gồm việc tìm
kiếm các vi sinh vật mà nhanh chóng tạo được khuẩn lạc trong đất vô trùng và
có khả năng loại bỏ các sinh vật khác lây nhiễm vào đó, tìm kiếm các vi sinh
vật mà tạo khuẩn lạc bảo vệ đối với quá trình lây nhiễm. Việc sàng lọc cơ bản
đối với các vi sinh vật đấu tranh sinh học mới vẫn còn được sử dụng và dường
như sẽ tiếp tục cần để làm đa dạng các ứng dụng của kiểm soát sinh học cũng
như thay thế các sản phẩm đấu tranh sinh học đang được sử dụng mà có thể sẽ
dẫn tới sự kháng [36].
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh họcTrần Thị Nguyệt
5

phát triển một chế phẩm dựa trên bột đá tan, than bùn, chất khoáng bón cây,
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh họcTrần Thị Nguyệt
6
Lớp 0601cao nilit, mùn cưa và phân bón sân trại mà trong đó các chủng P. fluorescens
có thể sống sót tới 240 ngày dự trữ. Một chủng P. fluorescece được tạo ra trên
methylcellulose: đá tan có khả năng sống sót trong 10 tháng ở 4
o
C và làm
giảm tới 68,5% bệnh ở lúa gạo. Những chế phẩm vi sinh khác được sử dụng
để kiểm soát bệnh tật bao gồm Agrobacterium radiobacter, hiện nay đã được
thương mại hoá ở Úc, New Zealand và Mỹ dùng để kiểm soát các bệnh mụn
cây (crown gall) dưới dạng lỏng, dưới dạng bột than, bùn ẩm [36]. Những chế
phẩm này được hoà tan trong nước trước khi xử lý hạt và đào những rãnh nhỏ,
phun hoặc nhúng. Streptomyces griseoviridis được sử dụng chống lại nhiều
nấm gây bệnh và có sẵn ở nhiều nước trên thế giới dưới dạng bột có thể làm
ẩm, được sử dụng để kiểm soát các bệnh ở rễ gây ra bởi Pythium, Fusarium,
Phytophthora và Phomopsis. Các chế phẩn dạng than bùn hoặc lỏng của
Burkholderia cepacia cũng đang được sử dụng để kiểm soát các nấm gây
bệnh như Phytophthora, Pythium và Fusarium.
Ngày nay, các CKS trong bảo vệ thực vật sử dụng có hiệu quả thường
được dùng dưới dạng các chế phẩm như là: thuốc chống nấm blastixidin,
kasugamyxin…; thuốc chống vi khuẩn streptomyxin, oxytetracylin…; thuốc
trừ sâu avermectin – B, milbemctins…; thuốc diệt cỏ bilanafos và các chất
điều hòa sinh trưởng của cây như là gibberellins. Ở Nhật Bản, người ta đã có

có thể giảm quần thể giun tròn bằng khả năng kí sinh của chúng, trong khi các
loài vi khuẩn trong rễ không kí sinh có thể làm giảm quần thể giun tròn bằng
cách tạo khuẩn lạc ưu tiên trên thực vật chủ hoặc tạo ra các chất trao đổi độc
với giun tròn [37]. Các chế phẩm thương mại của B.cepacia đã được điều chế
dưới dạng bột ẩm, hạt khuếch tán trong nước hoặc dưới dạng huyền phù đang
được đánh giá để kiển soát các loại giun tròn.
Trước khi một tác nhân đấu tranh sinh học vi khuẩn có thể được thương mại
hoá thì một đánh giá mức độ nguy hiểm cũng phải được hoàn thành. Đối với
một tác nhân đấu tranh sinh học được đăng kí như là các chất diệt loài gây hại
thì những quy định hiện hành đòi hỏi nhà sản xuất phải cung cấp các dữ liệu
về sự phân tán của tác nhân đấu tranh sinh học và các tác động đến các vi
khuẩn khác trong môi trường mà tác nhân này được sử dụng.
1.2.2 Nấm
Các loài nấm chủ yếu sử dụng trong đấu tranh sinh học là Trichoderma
spp, Gliocladium viens, Tilletiopsis pallescens, and Pseudozyma flocculose
[19]. Nhiều nấm gây bệnh ở lá và rễ như Rhizoctonia, Pythium, Phytophthora,
Botrytis có khả năng được kiểm soát bởi những loài nấm này [19, 30, 36].
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh họcTrần Thị Nguyệt
8
Lớp 0601Có nhiều phương pháp khác nhau dùng để phát triển các chế phẩm
nấm, bao gồm làm khô sợi nấm đã phân đoạn, chứa một viên hệ sợi nấm [12],
viên nang bào tử hoặc hệ sợi nấm trong tinh bột hoặc alginate và bao bọc các
bao tử khô lên hạt cám, một số bào tử nấm sinh sôi nhanh chóng trong nước.
Tương tự, các chế phẩm dạng nước thường dễ bị nhiễm do đó mà việc sử dụng


Ở đâu có vi sinh vật tồn tại thì sẽ có những vi sinh vật cạnh tranh, đối
kháng với nó, đó là quy luật cạnh tranh sinh tồn của sinh vật nói chung trong
hệ sinh thái. Vi sinh vật trong đất cũng vậy, bao gồm cả vi sinh vật hữu ích và
vi sinh vật gây bệnh. Ở vùng rễ, vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng nguy hiểm
và đáng quan tâm là nấm gây bệnh. Những vi sinh vật hữu ích trong vùng rễ
là các vi khuẩn kiểm soát sinh học, xạ khuẩn, nấm chúng là hàng rào phòng
thủ đầu tiên chống lại các nấm gây bệnh cho cây trồng. Sự có mặt của các vi
sinh vật đối kháng với nấm bệnh ngăn chặn bệnh và giảm tác động gây bệnh
của nấm với cây trồng [4].
Các vi sinh vật đối kháng với nấm, cho đến nay đã được biết là nhờ các cơ
chế như cạnh tranh dinh dưỡng, tiêu diệt mầm bệnh (các sản phẩm trao đổi
chất của các sinh vật kiểm soát sinh học có tính kháng, có tính độc đối với tế
bào nấm), ký sinh đối với nấm (vi sinh vật sinh ra các emzym có khả năng
phân huỷ thành tế bào nấm bệnh làm nguồn cơ chất và nguồn cacbon cho
mình) và đề kháng cảm ứng của cây trồng với nấm bệnh. Các cơ chế này cho
đến nay vẫn chưa được hiểu một cách đầy đủ, nhưng các nhà khoa học cho
rằng nấm bị tiêu diệt bởi các vi sinh vật đối kháng không chỉ đơn thuần từ
một cơ chế nào đó mà có sự kết hợp bởi các cơ chế nói trên [4, 35].
1.4. ĐẤU TRANH SINH HỌC - CƠ HỘI VÀ THÁCH THỨC
Có nhiều cơ hội và thách thức của việc sử dụng biện pháp đấu tranh
sinh học bao gồm việc phát hiện và sử dụng các vi sinh vật làm tác nhân đấu
tranh sinh vật. Chúng bao gồm các thách thức về khoa học và công nghệ và
các quá trình điều tiết ở các nước khác nhau mà đòi hỏi những xem xét và
kiểm tra trước.
Ở nhiều nước cũng như cộng đồng Châu Âu, các tác nhân sinh học
được xử lý với tầm quan trọng tương đuơng với các thuốc trừ sâu hoặc các
thuốc diệt nấm thương mại. Đánh giá dữ liệu độc học và an toàn sinh học phải
thu được và cung cấp bởi các cơ quan luật pháp dẫn đến một thời gian chờ đợi dài
trước khi được đăng kí, hơn nữa giá thành lại cao để có thể phát triển sản phẩm.

32
o
C, độ ẩm không khí từ 80 đến 95%, nhất là trong mùa mưa,tuy nhiên ở
nhiệt độ dưới 10
O
C hay trên 35
o
C nấm ngừng phát triển.
1.5.5 Nguồn bệnh và lây lan
Nấm Phytophthora ưa thích và cần độ ẩm để sinh sản, phát triển. Vì thế
ở các tỉnh Nam bộ, bệnh thường xuất hiện và gây hại nhiều trong mùa mưa,
nhất là ở những vườn sau khi bị ngập lũ, những vườn trồng dầy, tán lá bít
bùng, không thông thoáng khô ráo. Từ nguồn bệnh ban đầu, khi gặp điều kiện
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh họcTrần Thị Nguyệt
14
Lớp 0601thích hợp như mưa nhiều thì bào tử vách dày có khả năng sinh sản động bào
tử và chúng có thể bơi lội trong nước tự do đến vị trí rễ và lông hút để gây hại
nhờ 2 lông roi. Từ các vết bệnh ban đầu các sợi nấm sẽ sinh sản rất nhiều bào
tử và lây lan rất nhanh trong điều kiện có gió, mưa hay lũ lụt. Nguồn nước
tưới trong vườn cũng là yếu tố làm cho nấm phát tán, lây lan rất nhanh trong
vườn và trong cùng khu vực.
1.5.6 Sự thiệt hại do nấm Phytophthora spp. gây ra
Thiệt hại do nấm Phytophthora trên cây trồng ở Mỹ làm thất thu hàng
tỷ đô la mỗi năm và nếu tính trên cả thế giới thì còn gấp hơn nhiều lần so với

giới (Evans và Prior, 1987). Năm 1994 do ảnh hưởng của lũ lụt nên hầu hêt
diện tích sầu riêng ở Thái Lan đã bị nhiễm nấm Phytophthora spp và bệnh
bộc phát rất nhanh gây thiệt hại nghiêm trọng, có khoảng 40% số cây bị chết
do thối gốc chảy nhựa.
Ở Việt Nam từ năm 1998 đến nay bệnh này đã phát triển và gây hại
nặng ở một số tỉnh phía Nam. Bệnh do Phytophthora spp gây ra là bệnh rất
nguy hiểm trên cây ăn quả, do chúng tấn công và gây hại nghiêm trọng trên
nhiều loại cây trồng từ giai đoạn cây con đến giai đoạn trưởng thành thậm chí
đến giai đoạn sau khi thu hoạch. Trong mùa lũ, phần lớn cây trồng đều bị tổn
thương, nhất là bộ rễ, vì thế nấm bệnh dễ dàng tấn công, đôi khi làm cho vườn
cây chết hàng loạt, hơn cả thiệt hại khi ngập. Như vậy, vấn đề phòng chống
nấm bệnh cây trồng là vô cùng quan trọng và cần thiết.
Biện pháp sử dụng hoá chất diệt nấm bệnh nhanh nhưng để lại nhiều
hậu quả như: làm cho nấm bệnh quen và dẫn đến kháng thuốc, ngoài ra nhiều
loài vi sinh vật có ích trong đất cũng bị tiêu diệt từ đó làm mất cân bằng môi
trường sinh thái vùng rễ. Bên cạnh đó hoá chất còn dư đọng trong đất sẽ ảnh
hưởng đến chất lượng sản phẩm cũng như xâm nhiễm vào thức ăn làm ảnh
hưởng đến sức khoẻ con người.
Vì vậy biện pháp phòng trừ bệnh nấm hại rễ bằng chế phẩm sinh học rất
cần thiết bởi tính bền vững, an toàn với sức khỏe con người, môi trường sinh
thái và hiệu quả kinh tế cao.
1.6. Một số bệnh liên quan do nấm Phytophthora spp. gây ra trên cây có múi
Do giá trị kinh tế cao nên diện tích cây ăn trái ngày càng gia tăng ở
Việt Nam, từ 346.000 ha năm 1995, diện tích cây ăn trái đã gia tăng đến
500.000 ha vào năm 2000. Trong các loại cây ăn trái được trồng phổ biến thì
nhóm cây có múi Citrus (cam, quýt, chanh, bưởi) chiếm một diện tích rất lớn.
Chỉ riêng trong khu vực miền Nam Việt Nam trong năm 2000, diện tích của
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
Bệnh thường gây hại trên quít, cam sành. Trong năm, bệnh thường gây
hại trong mùa mưa lũ hoặc sau khi tưới nước ra hoa. Cây bị bệnh lá vẫn lớn
bình thường nhưng gân lá có màu vàng trắng, phiến lá ngả màu vàng xanh, và
sau đó rụng đi, nhất là khi có gió hoặc khi ta lắc nhẹ cây. Các lá già rụng
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh họcTrần Thị Nguyệt
17
Lớp 0601trước sau đó dẫn đến các lá trên. Lúc đầu chỉ có một vài nhánh biểu hiện vàng
lá, rụng lá nhưng sau đó toàn cây sẽ rụng lá. Cây có nhiều chồi gắn lá nhỏ,
nhiều hoa, trái, trái chua và cuối cùng cây chết hẳn. Đào rễ lên thấy phía cành
bị rụng lá, rễ bị thối, vỏ rễ tuột khỏi phần gỗ, gỗ bị sọc nâu lan dần vào rễ lớn.
Bệnh nặng thì tất cả các rễ đều bị thối và cây chết [14, 16, 18].
Tác nhân:
Do nấm Fusarium solani, Phytophthora spp., Pythium tấn công vào
chóp rễ và làm thối rễ. Nếu rễ cây bị ngập úng làm rễ suy yếu hoặc do tuyến
trùng chích hút tạo vết thương và từ đó nấm tấn công gây hại làm cây bị bệnh
trầm trọng và chết nhanh hơn. Ngoài ra nấm còn kích thích cây tạo ra ethylen
làm lá vàng nhanh, rụng sớm. Thường vào mùa nắng hoặc do nước siết kích
thích ra hoa làm cho rễ suy yếu và một số rễ ăn sâu xuống để tìm nước hoặc
đến mùa mưa, bón phân cây ra nhiều rễ non, đất thoát nước không kịp, mực
thủy cấp dâng cao, rễ bị ngập úng, ngộp và thiếu oxy, làm rễ suy yếu đồng
thời qua tác đông trung gian của tuyến trùng (vết chích hút) tạo điều kiện
thuận lợi cho nấm tấn công nhanh hơn và bệnh nặng hơn.
• Bệnh lở cổ rễ, chết cây con
Là bệnh rất quan trọng và phổ biến ở hầu hết các vườn ươm cây giống.

Sclerotium gây ra. Nếu do nấm Sclerotium gây hại thì trên mắt đất gần gốc
cây bệnh có thể nhìn thấy các hạch nấm tròn màu nâu. Trong khi nấm
Rhizoctonia tạo nên các hạch nấm tròn dẹt và bề mặt hạch nấm sần sùi. Đây là
các loại nấm có khả năng lưu tồn trong đất. Chúng phát triển và lây lan mạnh
trong điều kiện đất có độ ẩm cao, những lúc mưa kéo dài, luống ươm hay bầu
đất bị ứ đọng nước, thiếu ánh nắng như ở vườn ươm. Ngoài ra, nếu phần cổ rễ
của cây con (nơi tiếp xúc với đất) bị sây xước mà trong đất có chứa sắn mầm
bệnh thì vi sinh vật gây bệnh sẽ dễ dàng tiếp xúc và xâm nhiễm vào cây hơn.
• Chết cây con
Triệu chứng
Bệnh thường tấn công vào cây con một năm tuổi trở lại, ở thân cây
ngang mặt đất, cây nảy mầm làm cây gãy gục. Cây cũng có thể bị tấn công
muộn hơn (cây cao 5 – 10 cm), làm vỏ thân ngang mặt đất bị hư và cây bị
chết nhưng cây vẫn còn đứng không ngã rạp như lúc nhỏ [14, 16].
Tác nhân
Do nấm Phytophthora palmivora; Fusarium spp; Rhizoctonia solani;
Sclerotium rolfsii
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh họcTrần Thị Nguyệt
19
Lớp 0601 Ở mặt đất, nơi gốc cây bệnh có thể quan sát thấy hạch nấm, nếu hạch
nấm nhỏ màu vàng nâu đến nâu và bóng láng thì đó là nấm S. rolfsii, nếu hạch
nấm to, sần sùi, hơi dẹt là nấm R. solani, nếu ở gốc cây có tơ nấm trắng dày
đặc là Fusarium spp, nếu chỉ thấy tơ nấm rất ít vào sáng sớm như mạng nhện
là do P. palmivora.
albicans, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Salmonella typhi. . . do
Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật - Trung tâm Công nghệ Sinh học- Đại học
Quốc gia Hà Nội cung cấp.
- Các loại nấm, vi khuẩn gây bệnh thực vật: Phytophthora spp,
Fusarium moniliform, Fusarium oxysporum.
2.1.2. Hoá chất
Hóa chất: Các hóa chất làm môi trường: pepton, tinh bột tan, thạch, cao
men, các loại đường chuẩn: glucoza, fructoza, inositol, mannitol, arabinoza,
raffinoza
Các loại dung môi: n- butanol, etanol, ethyl acetate, iso propanol,
methanol, aceton (Trung quốc).
Các hóa chất dùng trong phân loại và nghiên cứu: agaroza, Tris-HCl,
EDTA, SDS, isoamyl alcohol, ethilium bromide, Tris-HCl, EDTA, SDS
(Merck).
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ
Cân điện 0,001 (Thụy Điển), kính hiển vi quang học OLYMPUS (Nhật
Bản), máy lắc ổn nhiệt (Nhật), nồi lên men (Nhật), máy đo pH (Mỹ), máy li
tâm, máy đo OD, máy GeneAmp PCR System, máy đọc trình tự ABI PRISM
3100 Avant Genetic Analyzer (Mỹ), máy ly tâm lạnh (Sigma, Đức), máy soi
gel (Mỹ); máy đo quang phổ UV3000, máy chạy điện di.
2.1.4. Môi trường
• Môi trường khoai tây (PDA) (g/L):

Khoai tây miếng: 200g
Đường gluco: 20g
Thạch : 16g
Nước : 1 lit
• Môi trường Czapeck:

Đường gluco: 20g
Thạch : 16g
Nước : 1l

• Môi trường ISP
4
• Môi trường Gause I:
Tinh bột tan: 20g
K
2
HP0
4
: 0,5g
MgSO
4
.7H
2
O: 0,5g
NaCl: 0,5g
(NH
4
)
2
SO
4
: 2g
KNO
3
: 0,5g
FeSO

MgSO
4
.7H
2
O: 1g
NaCl : 1g
(NH
4
)
2
SO
4
: 2g
CaCO
3
: 2g
Dịch khoáng: 1ml
Thạch : 16g
Nước : 1lit
pH : 7
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh họcTrần Thị Nguyệt
22
Lớp 06012.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi sinh vật

Hoạt tính enzym/hoạt tính kháng sinh (HTE/HTKS) xác định theo công thức:
HTE/HTKS = D – d (mm).
D: Đường kính vòng phân giải/vòng vô khuẩn + đường kính thỏi thạch.
d: Đường kính thỏi thạch.
* Phương pháp nhỏ dịch
Dùng khoan nút chai đục các lỗ trên môi trường thạch đã cấy vi sinh
vật kiểm định trong đĩa petri, nhỏ dịch lọc sau nuôi cấy. Các bước tiếp theo
tiến hành như phương pháp thỏi thạch.
2.2.2. Đặc điểm hình thái
a. Quan sát hình dạng cuống sinh bào tử:
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh họcTrần Thị Nguyệt
23
Lớp 0601 Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP4 cắm lamen nghiêng. Sau 6-7
ngày lấy lamen ra quan sát hình dạng cuống sinh bào tử và đếm số lượng bào
tử trên kính hiển vi quang học. Chuỗi sinh bào tử có các dạng thẳng hay lượn
sóng kí hiệu là RF (Rectusflexibilis), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn
toàn kí hiệu là RA (Ratinaculiaperti) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spira).
b. Bề mặt bào tử
Quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử
Bào tử có dạng: tròn, ovan, elip, hình que.
Bề mặt bào tử xạ khuẩn có dạng: nhẵn kí hiệu là Sm (Smooth), dạng
mụn cóc Wa (Warty), dạng gai Sp (Spiny) và dạng tóc là Ha (Hairy).
2.2.3 Phân loại theo sinh học phân tử
 Phương pháp tách ADN vi khuẩn, nấm

0
C ở
15.000 vòng/ phút trong 5 phút, lấy phần nổi phía trên.
- Thêm 200 µl CHCl
3
-Izoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm 15.000v/phút trong 2
phút. (Bước này được lặp lại 2 lần)
- Thêm 200 µl 2-propanol (Izo-propanol) và đặt trong tủ đá 20 phút. Ly tâm
15.000v/ph trong 15 phút và lấy kết tủa.
- Rửa sạch kết tủa bằng etanol 70%. Ly tâm 15.000 v/ph trong vòng 10 phút
và lấy tủa.
- Làm khô thiết bị ly tâm trong 10 phút. Hòa tan tủa trong TE (30-50 µl), giữ
trong tủ lạnh 4
0
C trong 1 ngày. Giữ ở -20
0
C trước khi sử dụng.
 Điện di trên gel agaroza
- Đây là kỹ thuật quan trọng vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn
axit nucleic hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên một đặc tính của axit
nucleic là ở pH trung tính mang điện tích âm nhờ các nhóm photphat nằm trên
khung photphodieste của các sợi axit nucleic. Điều đó có nghĩa là các phân tử
sẽ chạy về cực dương khi đặt trong điện trường. Kỹ thuật này được tiến hành
trên một đệm gel có tác dụng phân tách các axit nucleic theo kích thước.
- Tiến hành: Đun tan 1% agaroza trong dung dịch đệm TAE 1x đổ vào
khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml
dung dịch 1X TAE. Trộn đều 2µl dung dịch loading buffer 6x với 5µl mẫu,
nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V,
cường độ dòng điện 80mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr
(nồng độ 0,5 µl/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát vạch ADN trên máy soi gel.

Mồi xuôi: 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3' tương ứng với vị trí
nucleotit 27 đến 47
Mồi ngược: 5'- AAAGGAGGTGATCCAGCC -3' tương ứng với vị trí
nucleotit 1525 đến 1507
 Nấm
Mồi xuôi 18F: 5'- CACCAGGTTGATTCTGCC-3'
Mồi ngược 18R: 5′-GTGCACGGTCTACGAGACCTC-3′
- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di: Tiến hành tương tự như
đối với điện di genom.
 Phản ứng khuếch đại ADN cho giải trình tự
Sử dụng bộ kít Cycle sequencing với hỗn hợp phản ứng như sau:
Terminator Ready Reaction Mix
8 µl
Mồi
1 µl
Mẫu
1µl
Nước cất
đủ đến 20µl

- Chu trình nhiệt
Bước tiến hành Nhiệt độ (