LỜI CẢM ƠN
Chúng tôi xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
Ban chủ nhiệm khoa Thủy Sản.
Thầy Nguyễn Hữu Thịnh, Trần Hữu Lộc, cô Hồ Thị Trường Thy, Trần
Ngọc Thiên Kim đã hướng dẫn tận tình và tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi
thực hiện bài báo cáo này.
Trong quá trình thực tập, chúng tôi không thể tránh được những thiếu
xót nên rất mong sự đóng góp của quý thầy cô và các bạn. Nhóm Sinh Viên
2.4 MIC 5
Chương III. Tổng quan và phương pháp thí nghiệm 5
3.1 Tổng quan và đặc điểm 5
3.2 Vật liệu 6
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 6
3.2.2 Hệ thống bể thí nghiệm 6
3.2.3 Dụng cụ 6
3.2.4 Hóa chất, môi trường 7
3.3 Phương pháp nghiên cứu 7
3.3.1 Phân lập định danh vi khuẩn ( test API 20E, Nam Khoa) 7
3.3.2 Làm kháng sinh đồ 10
3.3.3 MIC 10
3.3.4 Kiểm tra kí sinh trùng 11
3.3.5 Xác định LD
50
11
3.4 Các xử lý số liệu 12
3.4.1 Xác định LD50 12
3.4.2 Xác định kháng sinh đồ 12
3.4.3 Phương pháp tính MIC 13
Chương IV. Kết quả và thảo luận 13
4.1 Một số chỉ tiêu chất lượng nước 13
4.2 Kết quả kiểm tra kí sinh trùng 14
4.3 Xác định LD50 15
4.4 Kháng sinh đồ 15
4.5 MIC 16
Chương V. Kết luận đề nghị 17
5.1 Kết luận và đề nghị 17
5.2 Bảng phụ lục 18


càng có nhiều tôm, cá bệnh do môi trường nuôi ô nhiễm do không biểt cách
quản lý tốt môi trường nuôi.
Để giải quyết một phần khó khăn do bệnh tôm cá ngày càng tràn lan nên
Trường ĐH Nông Lâm đã mở ra một chuyên ngành Ngư Y để khắc phục một
phần khó khăn này. Và trong đợt này, Khoa thủy sản đã tổ chức cho chúng em
thực tập môn bệnh cá ngay tại phòng thí nghiệm tại trường Đại học Nông Lâm
từ ngày 30/10/08 đến 7/11/08. Để giúp chúng em tiếp cận thực tế về bệnh học
thủy sản và những vấn đề liên quan tới bệnh trong ngành nuôi trồng thủy sản.
Và sau khi ra trường chúng em cũng bớt một phần bỡ ngỡ trong các thao tác ở
phòng thí nghiệm.
2. Mục tiêu
Nhằm đáp ứng cho sinh viên khi ra trường nắm bắt được các bước cơ bản trong
việc thực hiện các phương pháp trong phòng thí nghiệm nhằm phát hiện bệnh
trên động vật thuỷ sản:
 Phương pháp kiểm tra cá khi thu mẫu.
 Phương pháp thu mẫu cố định và lưu trữ bệnh.
 Các bước chuẩn đoán, định danh vi khuẩn bằng bộ test Nam Khoa, API
20.
 Các phương pháp kháng sinh đồ, MIC,…
 Các kỹ năng làm việc trong phòng thí nghiệm.

Từ đó, mỗi sinh viên có sự đánh giá và so sánh giữa kiến thức thực tế về những
gì đã được học với thực tế. Ngoài ra còn giúp cho sinh viên xử lý nhanh các
tình huống làm việc trong phòng thí nghiệm và trong thực tế.

Đặc điểm sinh trưởng :
- Cá tra có tốc độ tăng trưởng nhanh .
- Sau 5 tháng nuôi cá tra:1kg/con.

Đặc điểm sinh sản
Cá đẻ trứng dính vào rễ cây cỏ thuỷ sinh
Tuổi thành thục: 3-4 năm tuổi
Thời gian tái thành thục: 2,5-3 tháng (phụ thuộc điều kiện dinh
dưỡng )
Sức sinh sản thực tế: 150.000 trứng/kg
Tập tính ăn
Cá 3 ngày tuổi ăn phiêu sinh động vật
Thường ăn nhau ở giai đoạn 1-3 ngày tuổi mặc dù còn noãn
hoàng
10-15 ngày tuổi trở đi,ngoài phiêu sinh động, cá ăn được cám
gạo, bột cá thức ăn viên
Là loài ăn tạp thiên về động vật

2.1.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh

Trong vài năm trở lại đây, phong trào nuôi cá tra xuất khẩu ở đồng bằng
sông Cửu Long (ĐBSCL) tăng rất nhanh, đem về cho đất nước một nguồn
ngoại tệ rất lớn.Tuy nhiên hiện nay tình hình nuôi cá tra gặp nhiều rủi ro cao do
giá thành cá tra luôn tăng, nhưng giá bán sản phẩm cá tra lại giảm, do giá vật tư
và nguyên liệu tăng, đưa giá thành sản phẩm cá tra hiện nay (đến 23/05/2008)
là 14.000 - 14.500đ/kg (đối với thức ăn tự chế) và trên 15.000đ/kg đối với thức
ăn công nghiệp, tăng lên từ 2.000 - 3.000đ/kg. Trong khi đó giá cá thịt bán ra là
14.200 - 14.800đ/kg, nhiều doanh nghiệp thu mua sản phẩm có giới hạn do
thiếu vốn
Do phát triển quá nhanh không theo quy hoạch nên bệnh trên cá tra nuôi

Do mật độ nuôi dày nên mầm bệnh tích tụ nhiều trong ao nuôi. Khó
phòng bệnh vì bệnh lưu hành thường xuyên trên cá tra nuôi công nghiệp
Cá nhiễm bệnh do bị stress bởi mật độ nuôi cao, chất lượng nước giảm
Khó ngăn cản được vi khuẩn xâm nhập vào ao nuôi ( bơm nước trực tiếp
vào ao không qua xử lý )
Vaccine đang trong giai đoạn nghiên cứu
Phòng bệnh
Sức khoẻ của cá nuôi phải tốt để mức độ cảm nhiễm với mầm bệnh thấp
Không sử dụng một số hoá chất diệt kí sinh như CuSO
4
trong thời gian
nhiệt đọ nước thích hợp cho vi khuẩn phát triển ( giảm chất lượng nước, giảm
sức đề kháng của cá )
β-Glucan không cải thiện được sức đề kháng của cá đối với E.ictaluri.
Vi khuẩn có thể kí sinh tuỳ nghi bên trong tế bào của cá nên khả năng mang
bệnh và chống lại các chất kích thích miễn dịch lớn
Cải tạo ao, đặc biệt sát trùng đáy ao để hạn chế mầm bệnh. Sau mỗi vụ
nuôi, ta loại bỏ lớp bùn đáy ao, chỉ giữ lại lớp bùn khoảng 10cm
Khi thấy bệnh xuất hiện thì ngưng cho ăn để hạn chế khả năng mầm
bệnh lây lan qua đường phân

2.3 Tổng quan về kháng sinh

2.3.1 Định nghĩa

Kháng sinh là chất hữu cơ có nguồn gốc sinh học,bán tổng hợp hoặc
tổng hợp có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc giết chết vi trùng trên cơ sở kết
hợp với một điểm tiếp nhận ( receptor ) trong quá trình biến dưỡng, dẫn đến sự
ngưng trệ quá trình sống của vi khuẩn bên trong cơ thể,vì vậy kháng sinh
thường được dùng để điều trị trên cơ thể đã bị nhiễm trùng.

-Gồm 5 nghiệm thức,gồm 15 bể,trong đó nghiệm thức 1 làm đối chứng.
-Cá thí nghiệm có cỡ khá đồng đều,trong quá trình thí nghiệm thì không cho
ăn.
- Hàng ngày,các chỉ tiêu (pH ,DO ,NH
4
+
/ NH
3
,nhiệt độ) được theo dõi.
Đặc điểm:
-Tiến hành kiểm tra kí sinh trùng,định danh và phân lập vi khuẩn tại phòng thí
nghiệm.
-Ngoài ra,còn tiến hành một số thí nghiệm: MIC, kháng sinh đồ.

3.2 Vật liệu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Việc gây bệnh thực nghiệm được
thực hiện trên cá tra giống được cung cấp
từ trại thủy sản trường Đại Học Nông
Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Cá tra giống sử
dụng trong bể nuôi thí nghiệm có kích
thước từ 1,3 – 1,5 cm, đạt trọng lượng cơ
thể từ 7 – 10 g. Cá được chọn một cách
ngẫu nhiên từ trại giống và được bố trí
một cách ngẫu nhiên trong các nghiệm
thức gây bệnh thực nghiệm.

3.2.2 Hệ thống bể thí nghiệm

3.2.4 Hóa chất, môi trường.

Hóa chất cố định kí sinh trùng
Dung dịch Shaudin
Dung dịch ammonium 1%.
Cồn 70 %.
Dung dịch Iod loãng.
Hóa chất nhuộm màu, Gram
Dung dịch Crystal Violet.
Dung dịch Hematoxylen, Lugol.
Dung dịch Giemsa, Safranin.
Dung dịch Carmin.
Dung dịch AgNO
3
.
Môi trường: TSA ( Trypticase Soy Agar ), NA ( Nutrient Agar ), BHIA
( Brain Heart Infusion Agar ).

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Định danh vi khuẩn bằng bộ test IDS 14GNR của công ty Nam Khoa:

Tiến hành định danh vi khuẩn bằng bộ 14 thử nghiệm sinh hoá định danh trực
khuẩn Gram [-] (IDS 14GNR).Đây là hệ thống bao gồm 14 thử nghiệm sinh
hoá dùng để định danh các trực khuẩn Gr [-] bằng cách sử dụng hệ thống mã
định danh và phần mềm định.Bộ định danh này gồm các phản ứng :
Oxidase,lên men Glucose,khử Nitrate,thử nghiệm ONPG,sinh
Urease,PAD,Citrate,thuỷ giải Esculin,sinh H
2
S,sinh Indol,Voges-Poskauer

có hệ enzyme tryptophanase tạo ra sản phẩm chứa góc indol.
-Voges-Poskauer :thử nghiệm này xác định khả năng tạo acetone (acetyl
methylcarbinol),một sản phẩm cuối trung tính hình thành do lên men glucose.
-Malonate :là một tác nhân kiềm hãm tính hoạt động của enzyme succinase
chuyển succinate thành fumarate cản trở sự biến dưỡng của chu trình Krebs.
-LDC :đây là phản ứng đánh giá hoạt tính decarbonxylase của vi khuẩn dùng
để khử nhóm carboxyl của amino acid tạo thành amine có tính kiềm.
-Di động :trong bộ định danh này,phản ứng di động được xác định trên môi
trường bán rắn.Khi vi khuẩn mọc trên môi trường này sẽ làm mờ đường cấy và
lan ra khỏi đường cấy.
Cách thực hiện
-Cấy vi khuẩn có thời gian phát triển không quá 24 giờ.
-Dùng pipet pasteur chạm vào vào vi khuẩn thử nghiệm,cấy đâm thẳng đứng
vào chính giữa chai môi trường LDC,sau đó đậy chặt nắp chai.
-Làm huyền dịch vi khuẩn trong 3-5 mL nước muối sinh lý vô trùng,pha càng
đục càng tốt.Dùng pipet với đầu tips vô trùng ,hút cho vào khoảng 2/3 giếng
.Đậy nắp bảng nhựa lại.
-Bảng nhựa đã nhỏ huyền dịch vi khuẩn và chai môi trường LDC được ủ trong
tủ ấm ở 35 - 37
o
C .Đọc kết quả sau khi ủ khoảng 12- 16 giờ.

Đọc kết quả:

Giếng Phản ứng sinh hoá Thuốc thử thêm vào Đọc kết quả
1
Lên men glucose Không [+] vàng [-] tím
2
Lên men nitrate 1 đĩa giấy tìm nitrate [+] đỏ [-] vàng lợt
3


Phản ứng sinh hoá Đọc kết quả
LDC [+] vi khuẩn mọc và môi trường
thường có màu tím hay nhạc màu
[-] vi khuẩn mọc và môi trường có màu
vàng
Di động [+] vi khuẩn mọc làm nhoè đường cấy [-] vi khuẩn mọc không nhoè đường cấy

Phương pháp tính điểm để có code định danh: OXI GLU NIT ONPG UREA PAD CIT ESC H
2
S IND VP MLO LDC MOB
[-] 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
[+] 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2
Code ∑ ∑ ∑ ∑ ∑

Định danh vi khuẩn bằng bộ test API-20E:
Phương pháp thử
-Cho một ít nước vào khay nhựa của bộ test để giữ ẩm trong quá trình ủ vi
khuẩn trong tủ ấm.
-Dùng que cấy đã tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5mL nước muối sinh
lý hoặc nước cất đã tuyệt trùng ,lắc đều.
-Dùng pipet tuyệt trùng hút vi khuẩncho vào các giếng của bộ test
-Cho dầu khoáng tuyện trùng các giếng ADH ,LDC ,H
2
S và Ure.
-Ủ trong tủ ấm trong 24 giờ ở 28-30
o

khuẩn. sau đó, so sánh đường kính vòng vô khuẩn với độ nhạy chuẩn của từng
loại khánh sinh.

3.3.3 MIC (nồng độ ức chế tối thiểu):

Các bước tiến hành theo phương pháp pha loãng kháng sinh trong ống nghiệm
(NCCCLS,2005):
-Chuẩn bị dung dịch kháng sinh vô trùng: hoà tan kháng sinh trong nước muối
sinh lý,pha loãng để đạt nồng độ kháng sinh như sau:128 ,64 ,32 ,16 ,8 ,4 ,2 ,1
,0.5 ,0.25 ,0.125 ,0 µg/mL.

-Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn: nuôi cấy vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên
môi trường BHIA trong vòng 36-48 tiếng.Chọn 5 khuẩn lạc riêng lẻ giống hệt
nhau,tạo huyền dịch vi khuẩn khoảng ở nồng độ chọn trước trong nước muối
Test Substrate Reaction/enzyme Âm tính Dương tính
ONPG
Ortho-nitrophenyl Beta-galatosidae Không màu Vàng
ADH
Arginine Arginine dihyrolase Vàng Đỏ/cam
LDC
Lysine Lysine decarboxylase Vàng Cam
ODC
Ornithine Ornithine decarboxylase Vàng Đỏ
CTT
Sodium citrate Citrate utilisation Vàng Xanh/xanh lá
H
2
S
Sodium thiosulphate H
2

0.5 nồng độ vi khuẩn khoảng 1.5x10
8
cfu/mL.Pha loãng dung dịch xuống còn
1.5x10
6
cfu/mL.
-Đánh dấu ống nghiệm từ 1-12.Từ ống 2-11 cho vào môi trường BHI Broth.
-Từ ống 1-11 cho kháng sinh vào tương ứng với nồng độ pha loãng.Ống 12
không cho kháng sinh (đối chứng).
-Từ ống 1-12 cho huyền dịch vi khuẩn vào sao cho mật độ vi khuẩn trong ống
nghiệm tương đương 5x10
6
cfu/mL.
-Lắc đều ống nghiệm,ủ trong vòng 22-24 giờ ở 30
0
C.
-Sau đó lấy ra quan sát.
-Biện luận kết quả.

3.3.4 Kiểm tra kí sinh trùng trên cá:

Nghiên cứu bên ngoài
Đạt cá trong khay nhôm giữ ẩm.Nếu cá kích thước lớn thì làm chết ngay.Quan
sát triệu chứng lâm sàn:
-Quan sát bằng mắt thường,chú ý màu sắc, hình dạng thân cá,xem cá có bị tổn
thương ,u nhọt ,vết đen ,loét ,đốm trắng ở da và mang cũng như các kí sinh
trùng lớn (đĩa,giáp xác…) bám trên da,vẩy cá để chuẩn đoán sơ bộ bệnh cá.
-Cân trọng lượng,đo chiều dài va chụp hình cá.
-Dùng lamelle cạo nhớt trên da,vây,nhỏ 1-2 giọt nước đưa lên kính quát sát từ
vật kính nhỏ đến lớn.

3.4 Cách xử lý số liệu.

3.4.1 Xác định LD
50Mục đích
Xác định liều gây chết 50 % số cá gây cảm nhiễm bằng Edwardsiella
ictaluri trong các nghiệm thức. Phương pháp thực hiện

Mỗi nghiệm thức được cho vào nồng độ vi khuẩn giảm 10 lần từ nghiệm
thức (NT)
2
là 100ml, NT
3
là 10ml, NT
4
là 1ml, NT
5
là 0,1ml và NT
1
là nghiệm
thức đối chứng không có vi khuẩn.
Cá thí nghiệm được cho bắt ra cho vào bể riêng theo từng nghiệm thức,
mỗi bể đều có máy sục khí để tạo môi trường tương đối giống nhau về tính chất
để tiến hành gây nhiễm.
Gây cảm nhiễm vi khuẩn bằng phương pháp ngâm với liều như trên và

Để tiến hành làm kháng sinh đồ trước hết ta cần chuẩn bị giống vi khuẩn
thuần, có thời gian phát triển từ 18 – 24 giờ, các đĩa môi trường, các đĩa kháng
sinh phải đạt nhiệt độ phòng (vì khi bảo quản phải được giữ ở nhiệt độ lạnh).
Khi có đầy đủ thì ta tiến hành thực hiện. Kết quả được xác định bằng cách đo
đường kính vòng vô khuẩn của các đĩa giấy và so sánh độ nhạy của chúng.

3.4.3 Phương pháp tính MIC

Trong một dãy ống thí nghiệm thì MIC là ống trong cuối cùng của dãy
và gần ống đục, sau đó ta có thể rút huyền phù vi khuẩn trong các ống nghiệm
và trang trên đĩa thạch dinh dưỡng đem ủ để xem khả năng mọc khuẩn lạc vi
khuẩn để xác định chính xác MIC.

CHƯƠNG 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Một số chỉ tiêu chất lượng nước:

Nhiệt độ (
o
C)
Ngày
Nghiệm
thức
pH NH
3
DO
Sáng Chiều
1 6.5 0.03 4 26 24
2 6.5 0.03 4 26 24
3 6.5 0.03 4 26 24


4.2 Kết Quả Kiểm Tra Ký Sinh Trùng

Qua quá trình kiểm tra ký sinh trùng trên cá lóc, cá trê chúng tôi có kết
quả như sau.
Kiểm tra ký sinh trùng trên nhớt da và mang của 2 loài cá này hầu như
là không thấy. Có thể là do trong quá tình người nuôi đánh bắt cá và trữ cá
trước khi bán đã làm cho ký sinh trùng không còn bám trên các kí chủ này hoặc
có thể người nuôi đã xử dụng hóa chất sát trùng nước trong ao làm tiêu diệt các
loại ký sinh trùng này
Kiểm tra ký sinh trùng trong dạ dày và ruột cá:
Cá lóc : số lượng giun đầu mốc ( giống Pallisentis Van Cleave, 1928) là
3 con và giun tròn ( Philometra Costa, 1845) là 3 con.
Ở Việt Nam cá lóc có tỷ lệ cảm nhiễm giun đầu gai Pallisentis rất cao, cá lóc ở
Đồng Bằng Sông Cửu Long có tỷ lệ cảm nhiễm 81,7%, cường độ cảm nhiễm 2
– 70 trùng/cá thể ( Bùi Quang Tề, 1990) Hình cá lóc trước khi
ki
ểm tra ký sinh tr
ùng

Hình sạng đầy đủ giun

C sau 20 – 24 h tiến hành đo
đường kính vòng kháng khuẩn.

Hình dạng cá trê trước khi
kiểm tra ký sinh trung
Hình dạng sán dây
Hình kiểm tra kết quả
kháng sinh đồ
Đường kính vòng vô khuẩn của các loại kháng sinh:
Ampicillin : 36 mm
Oxacillin : 20 mm
Tetracycline : 10 mm
Gentamycin : 6 mm

Kết quả kiểm tra kháng sinh cho thấy Ampicillin cho kết quả vòng vô
khuẩn cao nhất ( 36 mm), tiếp theo là Oxacillin ( 20 mm), từ kết quả đường
kính vòng vô khuẩn cho thấy vi khuẩn Streptococcus agalactiae nhạy với 2 loại
kháng sinh này. Còn 2 kháng sinh còn lại cho kết quả là vi khuẩn đã kháng lại

CHƯƠNG V. Kết luận và đề nghị

5.1 Kết luận đề nghị

Đây là đợt thực tập bổ ích đối với sinh viên nghành ngư y chúng em , nhằm
chuẩn đoán và xác định tác nhân gây dịch bệnh và tổ chức việc phòng trừ có
hiệu quả,phục vụ sản xuất, góp phần nâng cao năng suất và sản lượng nuôi
trồng thủy sản. Phương pháp nghiên cứu đúng đắn sẽ cho kết quả chính xác với
độ tin cậy cao và từ đó chúng ta có thể chọn lựa một loại thuốc thích hợp. Bên
cạnh đó, chúng em còn học nhiều kỹ thuật, nguyên tắc trong việc cấy thuần,
phân lập, đo chỉ tiêu chất lượng nước, pha chế dung dịch, đỗ thạch…
Vì đây là đợt thực tập đầu tiên về môn bệnh nên chúng em đã mắc phải
nhiều sai sót như việc gây bệnh cho cá mà cá không chết trong các ngày thí
nghiệm mà chúng chỉ có những biểu hiện như lồi mắt, xuất huyết ở gốc vây
lưng và vây đuôi có thể do môi trường phát triển vi khuẩn không thích hợp :vi
khuẩn phát triển mạnh nhất trong khoảng 24-28
o
C nhưng trong quá trình thí
nghiệm nhiệt độ lại không ổn định theo chiều hướng giảm. Đáng lẽ chúng ta
kiểm tra số lượng vi khuẩn trong bể để biết sự biến động số lượng vi khuẩn
dưới sự tác động của nhiệt độ môi trường do máy điều hòa ở phòng thí nghiệm
. Quá trình tiến hành như sau:
Lấy 1ml mẫu nước đưa vào một ống nghiệm, sau đó hòa với 9 ml
nước muối sinh lý. Sắp xếp 10 ống nghiệm trên giá đánh số từ 1 đến 10 rồi cho


Sáng 31/10
Nghiệm thức Nhiệt độ pH DO NH
3
1 26 6.5 4mg/l <0,03 mg/l
2 26 6.5 4mg/l <0,03 mg/l
3 26 6.5 4mg/l <0,03 mg/l
4 26 6.5 4mg/l <0,03 mg/l
5 26 6.5 4mg/l < 0,03 mg/l

Chiều : nhiệt độ nước: 24
0
C

Sáng 1/11
Nghiệm thức Nhiệt độ pH DO NH
3
1 22
o
C 7 4 0,03mg/l
2 22
o
C 6,5 4 0,03mg/l
3 22
o
C 7 4 0,03mg/l
4 22
o
C 6,5 4 0,03mg/l
5 22

C 7 4 0,06mg/l
3 22
o
C 6,5 4 0,06mg/l
4 22
o
C 7 4 0,06mg/l
5 22
o
C 7 4 0,06mg/l