Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 1

MỤC LỤC
BÀI Trang
BÀI 1. CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ TẠO DÒNG 2
BÀI 2. NHÂN BẢN SAO DNA/GEN MỤC TIÊU BẰNG PHẢN ỨNG PCR 7
BÀI 3. TÁCH CHIẾT PLASMID TỪ TẾ BÀO CHỦ 10
BÀI 4. PHÂN TÍCH PLASMID BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐO MẬT ĐỘ QUANG,
CẮT GIỚI HẠN VÀ ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE 13
BÀI 5. THU NHẬN DNA/PLASMID TINH SẠCH TỪ BỘ KIT TINH CHẾ DNA 18
BÀI 6. NỐI DNA VÀO PLASMID 20
BÀI 7. BIẾN NẠP PLASMID TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ E. coli 22
TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 2

BÀI MỞ ĐẦU
NỘI QUY PHÒNG THÍ NGHIỆM & GIỚI THIỆU MÔN HỌC
I. Những quy định chung

điện di và dung dịch hút bỏ trong quá trình thí nghiệm phải bỏ đúng nơi quy định, không vứt bỏ
lung tung.
- Trƣờng hợp lỡ tay làm đổ hóa chất lên bàn thực tập phải lau ngay tránh để ngƣời khác sơ ý
đụng phải.
- Lắng nghe và thực hiện nghiêm túc các hƣớng dẫn của cán bộ phụ trách thực tập trong
việc dùng hóa chất cũng nhƣ trang thiết bị thí nghiệm. Trƣờng hợp xảy ra tai nạn, sự cố, cần
báo ngay với cán bô phụ trách thực tập để có biện pháp xử lý thích hợp.
- Trƣớc khi rời phòng thí nghiệm phải rửa sạch tay.
III. Giới thiệu môn học
Môn học thực tập sinh học phân tử giúp sinh viên làm quen với các kỹ thuật cơ bản của
công nghệ gen thông qua đó nắm vững, hiểu rõ hơn các khái niệm, kiến thức của công nghệ
gen và có thể bƣớc đầu tiến hành các thí nghiệm về thao tác trên gen.
3.1. Nội dung
Bài 1. Các khái niệm cơ bản về tạo dòng
Bài 2. Nhân bản sao DNA/gen mục tiêu bằng phản ứng PCR
Bài 3. Tách chiết plasmid từ tế bào chủ
Bài 4. Phân tích plasmid bằng các phƣơng pháp đo mật độ quang, cắt giới hạn và điện di
trên gel agarose
Bài 5. Thu nhận DNA/plasmid tinh sạch từ bộ kit tinh chế DNA
Bài 6. Nối DNA vào plasmid
Bài 7. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ E. coli
3.2. Phƣơng pháp dạy và học
- Bài học đƣợc tiến hành dƣới hình thức bài giảng và thao tác thực hành. Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 4

3.3. Phƣơng pháp đánh giá
Nội dung các bài thực tập có liên quan với nhau, các kết quả thu đƣợc của bài thực tập trƣớc


Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 5

BÀI 1. CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ TẠO DÒNG
MỤC TIÊU:
Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:
Về kiến thức: Sinh viên có khả năng củng cố và hình thành mới các kiến thức sau:
- Khái niệm về tạo dòng
- Ứng dụng của việc tạo dòng trong Sinh học phân tử
- Các bƣớc cơ bản của tạo dòng
- Khái niệm về tái tạo dòng (subcloning)
- Khái niệm chung về vector và chủng chủ
- Một số enzyme dùng trong tạo dòng
Về kỹ năng: Sinh viên có khả năng củng cố và rèn luyện các kỹ năng sau:
- Sử dụng các trang thiết bị, dụng cụ chuyên dụng trong sinh học phân tử
- Cẩn thận, khéo léo và khả năng tập trung cao độ trong các thao tác sinh học phân tử đồng
thời có khả năng tƣ duy cao
- Viết báo cáo, tổng hợp tài liệu
Số tiết lên lớp: 10 tiết
Bảng phân chia thời lƣợng

bộ kit tinh sạch dành cho DNA, dung dịch, thuốc thử chuyên dụng trong sinh học phân
tử.
BÁO CÁO
Viết báo cáo quy trình tạo dòng DNA/gen mục tiêu vào tế bào chủ E. coli
Câu hỏi
1. Tạo dòng là gì?
2. Mục đích của việc tạo dòng?
3. Các bƣớc cơ bản của quy trình tạo dòng
4. Vector là gì?
5. Ứng dụng của vector trong việc tạo dòng gen mục tiêu
6. Chủng chủ là gì?
7. Đặc điểm của chủng chủ
8. Vi khuẩn E. coli và ứng dụng của nó trong công nghệ gen
9. Enzyme cắt giới hạn (RE) là gi?
10. Ứng dụng của RE trong dòng hóa gen quan tâm vào vector
11. Polymerase, Ligase, Nuclease và ứng dụng của nó trong sinh học phân tử
Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 7

BÀI 2. NHÂN BẢN SAO DNA/GEN MỤC TIÊU BẰNG
PHẢN ỨNG PCR
MỤC TIÊU:
Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:
Về kiến thức: Sinh viên có khả năng củng cố và hình thành mới các kiến thức sau:
- Mục đích của việc PCR trong sinh học phân tử
- Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR
- Các thành phần phản ứng PCR

II. Yêu cầu nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ
- DNA bộ gen
- 1 eppendorf 0.5 ml vô trùng và giá để eppendorf
- 1 eppendorf chứa mồi xuôi
- 1 eppendorf chứa mồi ngƣợc
- 1 eppendorf chứa dung dịch đệm cho phản ứng PCR
- 1 eppendorf chứa dung dịch dNTP
- 1 eppendorf chứa enzyme Taq DNA polymerase (luôn đƣợc giữ trong chậu nƣớc đá trong
khi thao tác)
- 1 eppendorf nƣớc cất hai lần vô trùng
- Pipetman các loại: 0.5 – 10ul; 20 – 100ul; 200 – 1000ul, đầu tip
- 1 máy PCR
III. Thực hành
Sinh viên tiến hành hút lần lƣợt các thành phần phản ứng PCR vào eppendorf 0.5ml theo
thứ tự và thể tích nhƣ sau:
dH
2
O 16.5ul
DNA bộ gen 2.0ul
Buffer (10X) 2.5ul
dNTP (10X) 2.5ul
Mồi xuôi 0.5ul
Mồi ngƣợc 0.5ul
Taq polymerase 0.5ul
Tổng thể tích phản ứng 25ul

Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 9

Đặt eppendorf có chứa hỗn hợp phản ứng PCR vào máy PCR với chƣơng trình PCR nhƣ


Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 10

BÀI 3. TÁCH CHIẾT PLASMID TỪ TẾ BÀO CHỦ
MỤC TIÊU:
Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:
Về kiến thức: Sinh viên có khả năng củng cố và hình thành mới các kiến thức sau:
- Khái niệm cơ bản về plasmid
- Quy trình tách chiết plasmid
- Ứng dụng của plasmid trong việc sử dụng làm vector
Về kỹ năng: Sinh viên có khả năng củng cố và rèn luyện các kỹ năng sau:
- Thu nhận plasmid tinh sạch làm nguyên liệu cho quy trình tạo dòng
- Viết báo cáo, tổng hợp tài liệu
Số tiết lên lớp: 5 tiết
Bảng phân chia thời lƣợng
TT
NỘI DUNG
SỐ TIẾT
1
Cơ sở lý thuyết

Amp 50mg/ml, lắc qua đêm ở 37
o
C.
- Hút dịch vi khuẩn vào 3 eppendorf 1.5ml, mỗi eppendorf 1.5ml. Thu sinh khối bằng ly
tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Hút bỏ dịch bên trên.
- Bổ sung 100µl dung dịch 1 vào eppendorf chứa sinh khối; vortex thật kỹ.
- Bổ sung 200µl dung dịch 2; đảo nhẹ. Bổ sung ngay 150µl dung dịch 3; đảo nhẹ.
- Ly tâm thu dịch nổi ở 13.000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ phòng. Thu dịch nổi từ 3
eppendorf trên vào eppendorf mới, bỏ cặn.
- Bổ sung 1.5µl RNase vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi trên ủ ở 37
o
C trong 1 giờ.
- Sau đó, bổ sung vào mỗi eppendorf 250µl phenol pH 8 và 250µl chloroform; vortex nhẹ;
ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ phòng; thu dịch nổi.
- Thêm vào eppendorf trên 500ul ethanol tuyệt đối; ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút,
4
o
C. Hút bỏ dịch nổi, thu tủa
- Rửa tủa trên với 500ul ethanol 70% lạnh; ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, 4
o
C. Thu
tủa; phơi khô tự nhiên.
- Bổ sung 25µl TE; bảo quản mẫu ở 4
o
C.
Chú ý: Phenol, chloroform là những chất oxy hóa mạnh, có khả năng gây bỏng. Tránh tiếp
xúc trực tiếp với da, đặc biệt là mắt. trong trƣờng hợp nhỏ lên tay, cần rửa ngay bằng nƣớc.
trƣờng hợp bị nặng hơn, cần báo ngay với cán bộ hƣớng dẫn thực hành để kịp thời xử lý.
Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 12


BÀI 4. PHÂN TÍCH PLASMID BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐO
MẬT ĐỘ QUANG, CẮT GIỚI HẠN VÀ ĐIỆN DI GEL AGAROSE
MỤC TIÊU:
Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:
Về kiến thức: Sinh viên có khả năng củng cố và hình thành mới các kiến thức sau:
- Mục đích của việc xác định nồng độ và độ tinh sạch của một mẫu DNA
- Giá trị của một mẫu DNA đƣợc xem là sạch là nhƣ thế nào
- Nguyên tắc hoạt động của máy đo mật độ quang
- Mục đích của việc sử dụng enzyme cắt giới hạn trong bài thực hành
- Phƣơng pháp điện di trên gel agarose là nhƣ thế nào?
- Mục đích của phƣơng pháp điện di gel agrose
Về kỹ năng: Sinh viên có khả năng củng cố và rèn luyện các kỹ năng sau:
- Biết cách sử dụng máy đo mật độ quang
- Biết cách phân tích bản đồ enzyme cắt giới hạn của plasmid cho trƣớc đồng thời biết
cách sử dụng enzyme cắt giới hạn thích hợp cho phản ứng cắt kiểm tra plasmid
- Biết cách thu nhận thông tin kiểm chứng về trình tự plasmid mục tiêu
- Biết cách đọc, ghi nhận và giải thích kết quả trên bảng điện di gel agarose
- Viết báo cáo, tổng hợp tài liệu
Số tiết lên lớp: 10 tiết
Bảng phân chia thời lƣợng
TT
NỘI DUNG
SỐ TIẾT
1
Cơ sở lý thuyết
4
2
Yêu cầu nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ
1.5

vào 1 eppendorf sạch. Bổ sung 13.5ul nƣớc cất vô trùng. Lắc trộn đều.
- Mở máy đo mật độ quang, chọn chƣơng trình đo thích hợp theo hƣớng dẫn của cán bộ.
- Rửa sạch buồng đo, điều chỉnh blank
- Nạp 10ul mẫu vào buồng đo. Nhấn nút DNA để đo nồng độ và độ tinh sạch của dung dịch
DNA.
- Ghi nhận kết quả và rút ra kết luận.
II.2. Phân tích plasmid bằng phƣơng pháp cắt giới hạn
a. Vật liệu, dụng cụ, thiết bị
Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 15

- Dung dịch DNA plasmid thu đƣợc ở bài 2
- 1 eppedorf 1.5ml
- Pipetman các loại: 0.5 – 10ul; 20 – 100ul; 200 – 1000ul, đầu tip
- Nƣớc cất vô trùng
- Enzyme cắt giới hạn, dung dịch đệm (buffer)
- Bình chứa nƣớc thải, giấy thấm
- Tủ ấm 37
o
C
b. Thực hành
Dựa vào bản đồ plasmid cho trƣớc (Hình 2), sinh viên thực tập chọn enzyme cắt giới hạn sử
dụng cho phản ứng cắt kiểm chứng plasmid. Dự đoán kết quả thu đƣợc khi sử dụng enzyme đã
chọn cho phản ứng kiểm chứng.

Hình 2. Vùng trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn (MCS) và bản đồ giới hạn của
plasmid pGEM- T Easy [4]
Sinh viên tiến hành thực hiện phản ứng cắt giới hạn theo các bƣớc sau:
 Chuẩn bị một eppendorf sạch và thiết lập phản ứng cắt với thành phần sau đây:
DNA plasmid 1ug

+ Để nguội cho gel kết đông tự nhiên; sau khi gel đông gỡ 2 gờ của khuôn và tháo lƣợc ra
khỏi khuôn
+ Cho dung dịch TAE 1X vào buồng điện di, đặt miếng gel vào buồng điện di.
- Chuẩn bị mẫu và nạp mẫu
Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 17

+ Chuẩn bị 1 miếng parafilm; hút 5ul dung dịch DNA (10ul đối với mẫu sản phẩm cắt giới
hạn) cần phân tích đặt lên bề mặt miếng parafilm; thay đầu tip, hút 3ul dung dịch nạp mẫu, trộn
đều với dung dịch DNA.
+ Dùng pipetman hút toàn bộ dung dịch mẫu vừa trộn và nạp vào giếng trên gel agarose
+ Đóng nắp buồng điện di, cắm điện cực
+ Điện di với điện thế 100V, 20 phút.
+ Xem kết quả điện di bằng hộp soi đèn UV
BÁO CÁO
Viết báo cáo kết quả thí nghiệm và giải thích mục đích của việc phân tích plasmid bằng các
phƣơng pháp đo mật độ quang, cắt giới hạn và điện di gel agarose .
Câu hỏi:
1. Tại sao cần xác định nồng độ và độ tinh sạch của một mẫu DNA?
2. Phân tích mẫu DNA plasmid sau khi tách chiết bằng phƣơng pháp nào?
3. Nguyên tắc hoạt động của máy đo mật độ quang
4. Mục đích của việc sử dụng enzyme cắt giới hạn trong bài thực hành
5. Gel agarose là gì? Đọc kết quả điện di trên bảng điện di gel agarose là nhƣ thế nào?


Các bƣớc tiến hành
1.75
4
Nhận xét kết quả thí nghiệm
1

Trọng tâm bài thực hành
- Nắm vững các bƣớc của quy trình tinh sạch DNA bằng bộ kit để thu đƣợc sản phẩm DNA
tinh sạch.
I. Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1], [5]
1.1. Mục đích của việc tinh sạch sản phẩm DNA/plasmid sau khi đã thao tác
1.2. Nguyên tắc của quy trình tinh sạch DNA/plasmid bằng bộ kit dành cho DNA
II. Yêu cầu nguyên vật liệu, dụng cụ, thiết bị:
- Bộ kit dùng cho tinh chế DNA/plasmid EZ-10
Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 19

- 3 eppedorf 1.5ml vô trùng
- Phenol bão hòa TE
- Chloroform
- Pipetman các loại: 0.5 – 10ul; 20 – 100ul; 200 – 1000ul, đầu tip
- Tủ ổn nhiệt
- Máy li tâm
III. Thực hành
- Bổ sung 50ul phenol bão hòa TE và 50ul chloroform vào từng eppendorf chứa dung dịch
DNA/plasmid; vortex kỹ
- Ly tâm 10,000g trong 5 phút ở nhiệt độ phòng
- Chuyển phần dịch nổi sang một eppendorf mới
- Bổ sung 3V binding buffer (của bộ kit) vào eppendorf chứa phần dịch nổi. Trộn đều.
- Hút dung dịch trên vào cột tinh chế (của bộ kit), để yên trong 3 phút

Số tiết lên lớp: 5 tiết
Bảng phân chia thời lƣợng
TT
NỘI DUNG
SỐ TIẾT
1
Cơ sở lý thuyết
2
2
Yêu cầu nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ
0.25
3
Các bƣớc tiến hành
1.75
4
Nhận xét kết quả thí nghiệm
1

Trọng tâm bài thực hành
- Nắm vững các bƣớc của quy trình thiết lập phản ứng nối gen mục tiêu vào plasmid
I. Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1]
1.1. Mục đích của việc nối gen mục tiêu vào plasmid
1.2. Nguyên tắc của phản ứng nối.

Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 21

II. Yêu cầu nguyên vật liệu, dụng cụ, thiết bị:
- 1 eppedorf 1.5ml sạch
- 1 eppendorf chứa vector pGEM


BÀI 7. BIẾN NẠP PLASMID TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ
BÀO CHỦ E. coli
MỤC TIÊU:
Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:
Về kiến thức: Sinh viên có khả năng củng cố và hình thành mới các kiến thức sau:
- Thế nào là biến nạp
- Mục đích của việc biến nạp plasmid vào tế bào chủ
- Nguyên tắc thực hiện quá trình biến nạp
- Tế bào khả nạp
Về kỹ năng: Sinh viên có khả năng củng cố và rèn luyện các kỹ năng sau:
- Biết quy trình thực hiện biến nạp plasmid vào tế bào chủ
- Hiểu biết đƣợc một tế bào đƣợc xem là khả nạp thì nhƣ thế nào
- Tế bào chủ nhƣ thế nào thì đƣợc xem là có khả năng mang vector tái tổ hợp
- Viết báo cáo, tổng hợp tài liệu
Số tiết lên lớp: 5 tiết
Bảng phân chia thời lƣợng
TT
NỘI DUNG
SỐ TIẾT
1
Cơ sở lý thuyết
2
2
Yêu cầu nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ
0.25
3
Các bƣớc tiến hành
1.75
4

trong 30 giây; đặt eppendorf trở lại trong chậu đá trong 5 phút
- Bổ sung 1ml môi trƣờng LB vào eppendorf; ủ ở 37
o
C trong 1 giờ hoặc lắc trong máy lắc ở
37
o
C, 15 phút
- Trải 100ul dịch vi khuẩn trên lên đĩa môi trƣờng LB/amp; ủ ở 37
o
C, qua đêm
Tiến hành đồng thời với mẫu đối chứng không cho plasmid.
BÁO CÁO
Viết báo cáo kết quả thí nghiệm về thành phần cũng nhƣ quy trình biến nạp plasmid vào tế
bào chủ E. coli.
Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 24

Câu hỏi:
1. Biến nạp là gì?
2. Tại sao quá trình biến nạp lại quan trọng trong thao tác sinh học phân tử vi sinh vật?
3. Nguyên tắc của biến nạp
4. Các bƣớc thực hiện quy trình biến nạp
5. Tế bào khả nạp là gì? Đặc điểm?
6. Nhận biết plasmid tái tổ hợp có đƣợc biến nạp vào tế bào chủ E. coli bằng cách thức nào?