Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch

62
BÀI 1
XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ α-AMYLAZA THEO
PHƯƠNG PHÁP HEINXEL

1.1. Chiết tách dịch enzym từ chế phẩm nấm mốc và từ malt.
Cân 20-100 g môi trường nuôi cấy bề mặt (chế phẩm nấm mốc) hoặc
malt, nghiền nhỏ cẩn thận, cho vào bình tam giác, thêm 500-1000 ml dung
dịch NaCl 1%, đặt trên máy lắc liên tục trong 1-2 h. Lọc hoặc ly tâm ở 6000
vòng/phút để được dung dịch enzym trong suốt.
1.2. Nguyên tắc :
Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ
giảm cường
độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dich iốt.
Đơn vị hoạt độ ezim là lượng enzym có khả năng phân giải 1mg tinh
bột sau 30 phút ở 30
0
C.
1.3. Cách tiến hành và tính kết quả :
Cho vào ống nghiệm 1mg dung dịch tinh bột 1%, 1 mg dung dịch NaCl
0,1% và 2 ml dung dịch đệm phosphat 0,05M pH 6.0, lắc đều, giữ ở 30
0
C
trong 15-20 phút để dung dịch đạt đến 30
0
C. Thêm vào hỗn hợp 1 ml dung
dịch enzym đã đạt đến 30
0
C. Lắc đều, tiếp tục giữ ở 30

mức 100 ml và thêm nước cất đến vạch mức.
Từ dung dịch này chuẩn bị các dung dịch có chứa 2, 4, 6, 8 và 10 mg
tinh bột trong 1 ml bằng cách lấy 2, 4, 6, 8 ml dung dịch tinh bột 1% và thêm
nước cất vào cho đến 10 ml.
Lập đồ thị tiêu chuẩn : Lấy 0,1 ml dung dịch tinh bột đã chuẩn bị như
trên, thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 0,1 %; 0,2 ml dung dịch đệm; 0,1 ml nước
cất; 0,5 ml dung dịch axít sunfosalisilic 20%, lắc đều, thêm 9 ml dung dịch iốt
đã pha loãng 150 lần, so màu ở bước sóng 560 nm. Vẽ đồ
thị tiêu chuẩn, trên
trục hoành ghi số mg tinh bột, trục tung ghi số đọc được trên máy tương ứng.

Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch

64
BÀI 2

C. Sau đó cho 1 ml thuốc thử 5 lắc
đều. Đặt cả 2 ống nghiệm vào nồi cách thuỷ đang sôi trong 20 phút rồi lấy ra
làm nguội dưới vòi nước chảy. Thêm vào mỗi ống 1 ml thuốc thử arseno-
molypden, lắc liên tục cho đến khi ngừng tạo thành bọt khí CO
2
và hoà tan
hoàn toàn kết tủa Cu
2
O. Thêm nước cất đến 10 ml. Lắc đều, so màu ở bước
sóng 660 nm đối với mẫu trắng.
Mẫu trắng : Cho 1 ml nước cất, 1 ml thuốc thử 5, đun sôi 20 phút trong
nồi cách thuỷ đang sôi, làm lạnh, thêm 1ml thuốc thử arseno-molypden và
tiếp tục làm như trên.
- Tính kết quả : Lấy hiệu số đọc trên máy giữa mẫu thí nghiệm và mẫu
kiểm tra (E
TN
- E
KT
). Đối chiếu với đồ thị tiêu chuẩn để tính ra số micromol
glucoza tương ứng, nhân với độ pha loãng dung dịch enzym, tính số đơn vị
hoạt độ trên 1 g môi trường nuôi cấy bề mặt (chế phẩm nấm mốc) hoặc malt.
Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch

65
- Hoá chất :
1- Dung dịch enzym : chuẩn bị giống như phần 1.1 của bài 1.
2- Dung dịch tinh bột 1 % trong dung dịch đệm phosphat 0,05M pH = 6.0.
3- Thuốc thử đồng (I) : Hoà tan 200 g Na
2
SO

4
đặc, thêm nước cất đến 100 ml.
5- Thuốc thử hỗn hợp : Trộn lẫn thuốc thử đồng (I) và (II) theo tỷ lệ 25:1
ngay trước khi dùng.
6- Thuốc thử arseno-molypden : Hoà tan 25 g molypdat amonium trong
400 ml nước cất, thêm 31 ml H
2
SO
4
đặc. Chuẩn bị 25 ml dung dịch có
chứa 3 g Na
2
HAsO
4
.7H
2
O. Trộn lẫn 2 dung dịch trên giữ ở 30-37
0
C
trong 24-48 h hoặc ở 55
0
C trong 24 phút trong lọ có màu nâu để dung
dịch có màu vàng bền.
7- Dung dịch glucoza tiêu chuẩn : Trong 1 ml chứa 1 µM glucoza, từ dung
dịch này chuẩn bị các dung dịch có chứa 0,20; 0,25; 0,30; 0,40; 0,50;
0,60 µM trong 1ml. Lấy 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm thêm 1ml
thuốc thử 5, đun sôi 20 phút trong nồi cách thuỷ, làm lạnh, thêm 1ml
thuốc thử arseno-molypden, lắc đều, so màu.
bỏ vào cối sứ nghiền nhanh với axeton khan và 0,5 g Al
2
O
3
. Gạn dung dịch
chiết qua phễu thuỷ tinh xốp số 2, còn cặn tiếp tục nghiền, lọc khoảng 5-6 lần
cho đến khi chlorophyll hoàn toàn được tách hết. Lúc đó ta nhận được loại bột
màu vàng nhạt, đó là chế phẩm enzym-axeton.
3.3. Cách tiến hành và tính toán kết quả.
- Cách tiến hành :
Cân chính xác 50 mg chế phẩm enzym-axeton vào bình nón 100 ml,
cho thêm 10 ml dung dịch đệm phosphat pH =7, thêm 2 ml dung dịch axít
ascorbic 0,2% vừa mới pha và 1 ml dung dịch pyrocatechin 0,5 %. Lắc mạnh
trong đúng 2 phút ở nhiệt độ 20
0
C.
Khử hoạt tính enzym bằng cách thêm 2 ml dung dịch H
2
SO
4
10 %.
Tiếp tục thêm vào phản ứng một vài tinh thể KI và 5 giọt hồ tinh bột 1 %.
Tiếp tục chuẩn độ lượng axit ascorbic còn lại bằng dung dịch KIO
3

0,001N đến khi xuất hiện màu xanh bền.
Song song với thí nghiệm thực, tiến hành thí nghiệm trắng bằng cách
thêm các hoá chất theo thứ tự : 50 mg chế phẩm enzym-axeton vào bình nón
100 ml, thêm 10 ml dung dịch đệm phosphat pH=7, thêm 2 ml dung dịch
H

0,01N chuẩn độ ở bình thí nghiệm
1000 là hệ số chuyển ra gam
C là khối lượng mẫu chế phẩm enzym-axeton
t là thời gian thí nghiệm - phút.
- Dụng cụ và hoá chất :
Cân điện tử, cối chày sứ, phễu xốp số 2, máy hút chân không, buret 10
ml, pipet 1 ml, pipet 2 ml, bình nón 100 ml, tủ lạnh.
Al
2
O
3
, axeton khan, axit ascorbic 0,2 %, pyrocatechin 0,5 %, axit
sunphuric 10 %, KI tinh thể, dung dịch KIO
3
0,01N.