Vi n Nghiên C u Và Nuôi Tr ng Th y S n II ệ ứ ồ ủ ả
Trung Tâm Qu c Gia Quan Tr c, C nh Báo Môi Tr ngố ắ ả ườ
Và Phòng Ng a D ch B nh Th y S n Khu V c Nam Bừ ị ệ ủ ả ự ộ
TÀI LIỆU TẬP HUẤN KỸ THUẬT PCR CHẨN
ĐOÁN BỆNH TRÊN TÔM CÁ
L u hành n i bư ộ ộ
Tp. H Chí Minh 2007ồ
1
CH NG I: ƯƠ LÝ THUY T PHÒNG THÍ NGHI MẾ Ệ
I. AN TOÀN PHÒNG THÍ NGHI MỆ
Luôn m c qu n áo b o h trong khi làm vi c t i phòng thí nghi m.ặ ầ ả ộ ệ ạ ệ
1. Hóa ch tấ
Hóa ch t s d ng trong phòng thí nghi m sinh h c phân t ph n l n là nh ng ch t đ cấ ử ụ ệ ọ ử ầ ớ ữ ấ ộ
h i vì th , luôn xem k tên hóa ch t tr c khi s d ng và c n ghi chú rõ ràng bên ngoàiạ ế ỹ ấ ướ ử ụ ầ
bao bì m i lo i hóa ch t. ỗ ạ ấ
Tr c khi s d ng m t lo i hóa ch t m i, c n ph i tham kh o thông tin c a chúng tướ ử ụ ộ ạ ấ ớ ầ ả ả ủ ừ
các tài li u c a nhà s n xu t. Ví d :ệ ủ ả ấ ụ
Phenol – r t d gây cháy ấ ễ
Acrylamide – tác đ ng đ c lên h th n kinh ộ ộ ệ ầ
Ethidium bromide – tác nhân gây ung thư
Luôn đeo găng tay khi làm vi c v i các hóa ch t và không bao gi đ c hút chúng b ngệ ớ ấ ờ ượ ằ
mi ng. N u ti p xúc tr c ti p v i nh ng ch t đ c này ph i nhanh chóng r a vùng ti pệ ế ế ự ế ớ ữ ấ ộ ả ử ế
xúc d i vòi n c và tuân theo ch d n c a ng i h ng d n. ướ ướ ỉ ẫ ủ ườ ướ ẫ
Các hóa ch t c n ph i đ c b o qu n đúng nhi t đ quy đ nh: nhi t đ phòng, trong tấ ầ ả ượ ả ả ệ ộ ị ệ ộ ủ
mát (4
0
C) ho c t l nh âm (-20ặ ủ ạ
0
C) và đ c ghi nhãnượ c n th nẩ ậ .
2. Đèn t ngo i (UV)ử ạ
Ti p xúc tr c ti p v i tia UV có th gây h i m t. Luôn luôn đeo kính b o v khi sế ụ ế ớ ể ạ ắ ả ệ ử

N ng đ ph n trăm: ồ ộ ầ N ng đ ph n trăm (trong l ng/th tích) = tr ng l ng ch t tanồ ộ ầ ượ ể ọ ượ ấ
(g) pha trong 100 ml n c c t ho c dung dung môi. ướ ấ ặ
Ví d : Chu n b dung d ch agarose 0.7% trong đ m đi n di TBEụ ẩ ị ị ệ ệ
Cân 0.7 g agarose
Thêm dung d ch TBE 1X sao cho th tích cu i cùng là 100ml. ị ể ố
Dung d ch m "X".ị ẹ Nhi u lo i hóa ch t, dung d ch c n đ c chu n b n ng đ caoề ạ ấ ị ầ ượ ẩ ị ở ồ ộ
(dung d ch m ) 5 l n (5X) ho c m i l n (10X) so v i n ng đ c n thi t khi s d ng.ị ẹ ầ ặ ườ ầ ớ ồ ộ ầ ế ử ụ
Tr c khi s d ng chúng s đ c pha loãng thích h p đ đ a v n ng đ c n thi tướ ử ụ ẽ ượ ợ ể ư ề ồ ộ ầ ế
(1X c a dung d ch làm vi c). ủ ị ệ
Ví d : Chu n b dung d ch đi n di TBE 1X: ụ ẩ ị ị ệ
100ml dung d ch TBE 10X ị
Thêm 900ml n c c t đ th tích cu i cùng là 1000 ml dung d ch TBE 1X.ướ ấ ể ể ố ị
Chu n b dung d ch làm vi c t dung d ch mẩ ị ị ệ ừ ị ẹ
Nhi u dung d ch trong nghiên c u và ng d ng sinh h c phân t đòi h i s d ng cùngề ị ứ ứ ụ ọ ử ỏ ử ụ
m t thành ph n hóa ch t nh ng l i khác nhau v n ng đ . Vì th đ tránh ph i ph cộ ầ ấ ư ạ ề ồ ộ ế ể ả ứ
t p khi pha ch riêng r các hóa ch t này chúng ta t t nh t nên chu n b s n m t vàiạ ế ẽ ấ ố ấ ẩ ị ẵ ộ
dung d ch g c đ d dàng pha loãng chúng khi c n thi t.ị ố ể ễ ầ ế
Ví d : có th pha đ m TBE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) b ng cách ph i h p 1ml dungụ ể ệ ằ ố ợ
d ch Tris 1M và 2 ml dung d ch EDTA 0.5 M c ng v i 98.8 ml n c c t vô trùng. ị ị ộ ớ ướ ấ
Công th c chung dùng đ tính toán n ng đ c n thi t nh sau:ứ ể ồ ộ ầ ế ư
3
Ci x Vi = Cf x Vf
C i = n ng đ ban đ u, ho c n ng đ c a ồ ộ ầ ặ ồ ộ ủ dung d ch mị ẹ;
V i = th tích ban đ u, ho c l ng dung d ch m c n thi t, ể ầ ặ ượ ị ẹ ầ ế
C f = n ng đ cu i, ho c n ng đ mong mu n sau khi pha; ồ ộ ố ặ ồ ộ ố
V f = th tích cu i, ho c th tích mong mu n sau khi pha ể ố ặ ể ố
III. S D NG THI T BỬ Ụ Ế Ị
Yêu c u h c viên gi gìn các v t d ng trong phòng thí nghi m c n th n. ầ ọ ữ ậ ụ ệ ẩ ậ
Không đ c t ý s d ng các thi t b khi ch a đ c s đ ng ý ho c ch a đ c h ngượ ự ử ụ ế ị ư ượ ự ồ ặ ư ượ ướ
d n s d ng c a ng i h ng d n. ẫ ử ụ ủ ườ ướ ẫ

2+
(MgCl2 )
- Deoxy nucleotide triphosphate (dNTP’s: dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
- Các m i (m i xuôi: F và m i ng c : R)ồ ồ ồ ượ
- Enzym Taq polymerase
Ph n ng PCR g m có ba ả ứ ồ quá trình trong m t ộ chu kỳ khu ch đ i: ế ạ Bi n tínhế , b t c pắ ặ
và kéo dài , chúng đ c l p l i nhi u l n đ khuy ch đ i trình t DNA mong mu n.ượ ặ ạ ề ầ ể ế ạ ự ố
Sau m i ỗ chu kỳ khu ch đ i s l ngế ạ ố ượ
phân t DNA đích đ c nhân lên g p đôi:ử ượ ấ
t 1 phân t lên 2, lên 4 lên 8, lên 16 phânừ ử
t … 2ử
n
.
Chi ti t ba quá trình trên trong m i chu kỳế ỗ
khu ch đ i nh sau:ế ạ ư
Bi n tínhế : Phân t DNA s i đôi đ cử ợ ượ
hình thành b i m i liên k t hydro gi a haiở ố ế ữ
m ch đ n. Trong quá trình bi n tính,ạ ơ ế
nhi t đ ph n ng gia tăng lên nhanhệ ộ ả ứ
chóng đ n 95ế
o
C và gi nhi t đ nàyữ ở ệ ộ
trong kho ng 15-50 giây. nhi t đ này m i liên k t hydro gi a hai m ch đ n c aả Ở ệ ộ ố ế ữ ạ ơ ủ
phân tử DNA s i đôiợ b phá v . Trong giai đo n ị ỡ ạ b t c pắ ặ ti p theoế , nhi t đ ph n ngệ ộ ả ứ
gi m nhanh chóng làm cho m i liên k t hydro ban đ u không hình thành l i đ c k tả ố ế ầ ạ ượ ế
qu làm t o thành hai phân t DNA m ch đ n.ả ạ ử ạ ơ
B t c pắ ặ : Trong giai đo n b t c p, nhi t đ lai th ng duy trì kho ng 50- 60ạ ắ ặ ệ ộ ườ ả
0
C, trong
th i gian 15-60 giây. Quá trình này giúp cho các m i (primer) tìm ki m và b t c p bờ ồ ế ắ ặ ổ

VI. PHÂN TÍCH S N PH M PCR B NG ĐI N DI GEL AGAROSEẢ Ẩ Ằ Ệ
Đi n di aệ garose th ng đ c s d ng đ xác đ nh s n ph m PCR d a trên kh năngườ ượ ử ụ ể ị ả ẩ ự ả
phân tách các đo n DNA có kích th c khác nhau khi s n ph m PCR di chuy n quaạ ướ ả ẩ ể
mang l i các vi l có trong gel agarose. ướ ỗ
Do phân t DNA tích đi n âm cao. Khi phân tử ệ ử
DNA đ c đ t d i m t đi n tr ng xácượ ặ ướ ộ ệ ườ
đ nh, nh ng phân t DNA tích đi n âm này sị ữ ử ệ ẽ
di chuy n v phía c c d ng c a đi n tr ng,ể ề ự ươ ủ ệ ườ
trong tr ng h p đi n di agarose chúng s diườ ợ ệ ẽ
chuy n qua gel agarose đ c đ t trong dungể ượ ặ
d ch ị đ m đi n diệ ệ . Các phân t càng nh cóử ỏ
kh năng di chuy n càng nhanh trong gel agarose v phía c c d ng so v i các phân tả ể ề ự ươ ớ ử
DNA l n h n. Nguyên tác này cho phép k thu t đi n di phân tách các đo n DNA cóớ ơ ỹ ậ ệ ạ
kích th c khác nhau.ướ
S n ph m PCR đ c tr n v i ả ẩ ượ ộ ớ dung d ch đ t m u (loading gel)ị ặ ẫ vào chuy n vào cácể
gi ng trên gel agarose đ th c hi n phân tách d i tác đ ng c a đi n tr ng. Gelế ể ự ệ ướ ộ ủ ệ ườ
agarose có ch a s n ứ ẵ Ethidium bromide vì th khi DNA di chuy n trong gel agarose sế ể ẽ
t o liên k t v i Ethidium bromide ạ ế ớ
Dung d ch đ t m u (loading gel)ị ặ ẫ ch a ch t có t tr ng n ng (nh đ ng sucrose ho cứ ấ ỷ ọ ặ ư ườ ặ
glycerol) đ lôi cu n DNA xu ng đáy gi ng trên b n gel agarose và ngăn c n không choể ố ố ế ả ả
DNA khu ch tán vào dung d ch đ m đi n di. Ngoài ra, trong dung dich đ t m u cònế ị ệ ệ ặ ẫ
ch a ch t ch th tích đi n âm. Ch t ch th di chuy n cùng v i DNA giúp cho d dàngứ ấ ỉ ị ệ ấ ỉ ị ể ớ ễ
c l ng s di chuy n c a DNA trong b n gel. Ch t ch th th ng dùng là ướ ượ ự ể ủ ả ấ ỉ ị ườ Xylene
cyanol và Bromophenol blue, chúng di chuy n cùng v i nh ng phân t DNA có chi u dàiể ớ ữ ử ề
t ng ng l n l t là 5000 bp and 300 bpươ ứ ầ ượ
Đ m di n di: ệ ệ Đ m đi n di giúp n đ nh các đi u ki n môi tr ng cho phép quá trình diệ ệ ổ ị ề ệ ườ
chuy n c a DNA đ c n đ nh trong su t quá trình đi n di. Có m t vài lo i đ m đi nể ủ ượ ổ ị ố ệ ộ ạ ệ ệ
di th ng dùng trong phân tích đi n di agarose: Tris acetate ườ ệ EDTA (TAE),
Tris/Borate/EDTA (TBE). Kh năng đ m c a dung d ch đ m TAE th p h n so v i TBE.ả ệ ủ ị ệ ấ ơ ớ
Tuy nhiên, TAE l i cho phép phân tách t t đ i v i nh ng đo n DNA l n h n. Đi u nàyạ ố ố ớ ữ ạ ớ ơ ề

6. Eppendorf các lo i: 0,2ml; 0,5 ml và 1,5 ml (chuyên dùng cho PCR)ạ ; Giá ngố
nghi m cho Eppendorf ệ
7. Giá ng nghi m cho lo i tube PCR 0,2ml và 0,5mlố ệ ạ
8. H p đ ng n c đáộ ự ướ
9. D ng c bào đá b ng tayụ ụ ằ
10. Bình đ ng c n ự ồ
11. H p đ ng gi y th m lau tayộ ự ấ ấ
12. Các b kéo, panh vô trùngộ
13. H p nh a có n p đ ng v t li u dộ ự ắ ự ậ ệ ơ
14. Box vô trùng
15. Máy c t n c 2 l nấ ướ ầ
16. T s y d ng c (hot box oven)ủ ấ ụ ụ
17. V t li u khác: Các l s ch đ đ ng m u, c n 95% đ c đ nh và b o qu nậ ệ ọ ạ ể ự ẫ ồ ể ố ị ả ả
m u, găng tay, gi y lau, bút lông d u, kim tiêm vô trùngẫ ấ ầ
2. Khu ch đ i nucleic acidế ạ
Máy luân nhi t (thermocycler)ệ
B gi đi n UBS: lo i online, công su t 2000 wộ ữ ệ ạ ấ
3. Phân tích k t q aế ủ
1. B đi n di g m ngu n và b n đi n di, bàn đ c k t qu v i tia UV, máy nhộ ệ ồ ồ ồ ệ ọ ế ả ớ ả
dùng đ ch p l i k t quể ụ ạ ế ả
2. Khay đ gel (b n gel kích th c 7 x 10 cm ho c 10 x 15cm), l c t o gi ngổ ả ướ ặ ượ ạ ế
v i dung tích ch a m u 10 - 20ớ ứ ẫ µl
3. Micropipette 5 - 50µl
4. B p đi n ho c lò vi ba dùng đ đun agaroseế ệ ặ ể
5. Cân k thu t đ chính xác 0,1gr hay 0,01grỹ ậ ộ
6. ng đong 100ml và 500ml hay 1000mlỐ
7. Chai th y tinh ch u nhi t có n p, dung tích 250ml đ đun Agaroseủ ị ệ ắ ể
8. T đ gel (có h th ng hút h i Ethidium bromide)ủ ổ ệ ố ơ
9. H p nh a có n p đ y ch a rác th iộ ự ắ ậ ứ ả
10. V t li u khác: Găng tay, gi y lau tay, Gi y paraffin, H p đ u tip 10 -200ậ ệ ấ ấ ộ ầ µl

C . Thêm vào m t th tíchộ ể
100 ml dung d ch Tris HCl 0,5M (pH = 8). Khu y t trong 15 phút , đ yên dung d ch choị ấ ừ ể ị
đ n khi th y hai pha rõ r t, hút b pha bên trên. Ti p t c cho thêm m t th tích Trisế ấ ệ ỏ ế ụ ộ ể
HCL 0,1M (pH = 8). L p l i thao tác nh trên cho đ n khi đo đ c dung d ch phenol pHặ ạ ư ế ượ ị
= 8.
Phenol pH 4: Cân kho ng 100 g phenoltinh th , đ tan 68ả ể ể ở
0
C . Thêm vào m t th tíchộ ể
100 ml n c c t hai l n h p kh trùng. Khu y t trong 15 phút, đ yên dung d ch choướ ấ ầ ấ ử ấ ừ ể ị
đ n khi th y hai pha rõ r t, hút b pha bên trên. Ti p t c cho thêm m t th tích n cế ấ ệ ỏ ế ụ ộ ể ướ
c t nh trên. L p l i thao tác nh trên cho đ n khi đo đ c dung d ch phenol pH = 4ấ ư ặ ạ ư ế ượ ị
Phenol pH 8 : Chloroform : Isomyl alcolhol (25:24:1): Pha 100 ml dung d ch tách chi tị ế
b ng cách dùng đ u tip tinh s ch hút 2ml Isoamyl alcolhol vào 50ml phenol pH = 8, l cằ ầ ạ ắ
tr n đ u; sau đó thêm 48ml dung d ch cholroform vào tr n đ u.ộ ề ị ộ ề
Sodium Acetate 3M (pH: 5.2): Cân 40,8g NaOAc*3H
2
O, hòa tan trong 80 ml H
2
O. Sau đó
chu n pH 5.2 v i acid acetic. Thêm n c cho đ 100 ml.ẩ ớ ướ ủ
C n 70%:ồ Đong 70 ml c n tuy t đ i cho vào 30 ml Hồ ệ ố
2
O c t vô trùng. Ta đ c 100 mlấ ượ
c n 70%ồ
C n tuy t đ iồ ệ ố (100%)
H
2
O – DEPC : Hút 1ml DEPC (diethylpyrocarbonate) cho vào 1lít n c c t lo i Ion. ướ ấ ạ Ủ
qua đêm và đem h p vô trùng.ấ
Dung d ch TNị (20 mM Tris–HCl, 0.4 M NaCl, pH 7.4)

CH NGƯƠ 3: PH NG PHÁPƯƠ
I. CHU N B M U Ẩ Ị Ẫ
M u tôm có th đ c s d ng tr c ti p (g i là m u t i) ho c đ c b o qu n trongẫ ể ượ ử ụ ự ế ọ ẫ ươ ặ ượ ả ả
dung d ch c n 95ị ồ
0
. Trong tr ng h p m u đ c b o qu n trong c n thì ph i thay m iườ ợ ẫ ượ ả ả ồ ả ớ
dung d ch c n sau m t tu n b o qu n đ u tiên đ m u đ c b o qu n đ c lâu h n.ị ồ ộ ầ ả ả ầ ể ẫ ượ ả ả ượ ơ
Nh ng m u đ c b o qu n trong c n c n đ c lo i c n tr c khi s d ng. Có thữ ẫ ượ ả ả ồ ầ ượ ạ ồ ướ ử ụ ể
dùng gi y th m đ lo i c n kh i m u tr c khi tinh s ch v t li u di truy n. M u t iấ ấ ể ạ ồ ỏ ẫ ướ ạ ậ ệ ề ẫ ươ
s d ng cho phân tích PCR là t t nh t.ử ụ ố ấ
1. M u DNA virus: MBV, WSSV, HPVẫ
M u tôm gi ng (PL): l y kho ng 50-70 con.ẫ ố ấ ả
M u tôm nuôi: l y m t ph n nh mang c a 10 -15 con (t ng l ng m u không qúa 1ẫ ấ ộ ầ ỏ ủ ổ ượ ẫ
gram).
Tôm b m : l y m u cu n m t, chân bò, ho c chân b i ho c m t ph n mang.ố ẹ ấ ẫ ố ắ ặ ơ ặ ộ ầ
M u giáp xác hoang dã: l y m t ph n mang các lo i đ ng v t này (t ng l ng m uẫ ấ ộ ầ ạ ộ ậ ổ ượ ẫ
không qúa 500 microgram).
2. M u RNA virus: TSV, YHVẫ
M u tôm gi ng: l y kho ng 30-50 PL ẫ ố ấ ả
M u tôm nuôi: l y m t ph n nh mang c a 10-15 con (t ng l ng m u không qúa 200ẫ ấ ộ ầ ỏ ủ ổ ượ ẫ
microgram).
Tôm b m : l y m u cu n m t, chân bò, ho c chân b i ho c m t ph n mang.ố ẹ ấ ẫ ố ắ ặ ơ ặ ộ ầ
M u giáp xác hoang dã: l y m t ph n mang các lo i đ ng v t này (t ng l ng m uẫ ấ ộ ầ ạ ộ ậ ổ ượ ẫ
không qúa 200 microgram).
II. QUY TRÌNH TÁCH CHI T VÀ TINH S CH V T LI U DI TRUY NẾ Ạ Ậ Ệ Ề
1. Tách chi t thô DNA ế
Nguyên t c: Ph ng pháp d a trên nguyên t c ph i h p c h c (nghi n), hóa h cắ ươ ự ắ ố ợ ơ ọ ề ọ
(NaOH-SDS) và s c nhi t đ tách chi t DNA virus ra d ch chi t. ố ệ ể ế ị ế
1. M u tôm đ c nghi n k trong eppendorf v i 600-800ml d ch tách chi t DNA (NaOHẫ ượ ề ỹ ớ ị ế
0.25N, SDS 0,125%)

7. Ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút
8. Dùng miropipette hút b ph n n c n i b ng cách v a hút c n d n v a cho đ uỏ ầ ướ ổ ằ ừ ạ ầ ừ ầ
tip vào d c thành ng đ i di n v i ch đóng c n lóng DNA. R a c n lóng DNAọ ố ố ệ ớ ỗ ặ ử ặ
v i 1ml Ethanol 70%, không vortex mà ch úp ng a vài l n.ớ ỉ ử ầ
9. Ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút, hút b Ethanol, và làm khô c n lóng b ng cách đunỏ ặ ằ
cách th y hay đun trong block nhi t khô nhi t đ 50-56ủ ệ ở ệ ộ
0
C cho đ n khi khô hoànế
toàn (không còn th y các gi t n c đ ng trên thành ng). ấ ọ ướ ọ ố
10. Hoà tan c n lóng DNA trong 50 - 100ặ µl đ m TE.ệ
3. Tinh s ch RNA t ng s b ng Trizolạ ổ ố ằ
Nguyên t cắ : Ph ng pháp này dùng Guanidine Thiocyanate và Amoniumthiocyanate,ươ
ph i h p v i phenol acid và các ch t t y khác đ làm ch t gây bi n tính các protein, nhố ợ ớ ấ ẩ ể ấ ế ờ
đó tách chi t đ c RNA toàn ph n ra kh i DNA và protein. RNA tách chi t đ c s dế ượ ầ ỏ ế ượ ẽ ễ
dàng b k t t a b i isopropanol và ethanol.ị ế ủ ở
Nghi n 150 - 200 mg mô tôm trong ề 300 µl. Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 10 phút. Hút
150 µl dung d ch n i cho vào eppendorf 1,5 ml.ị ổ
1. Thêm 1ml dung d ch Trizolị
2. nhi t đ phòng trong 5 phútỦ ở ệ ộ
3. Thêm vào 200 µl Chloroform
4. Vortex trong 20 giây
13
5. nhi t đ phòng trong 3 phútỦ ở ệ ộ
6. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút
7. Thu d ch n i có ch a RNA vào ng eppendorff 1,5ml khác (hút kho ng 600 µl choị ổ ứ ố ả
m i ng)ỗ ố
8. Thêm vào 600 µl Isopropanol l nh -20ạ
0
C ( Tuỳ theo d ch n i thu đ c mà cho m tị ổ ượ ộ
th tích Isopropanol t ng ng)ể ươ ứ

0.5µl môi F1 (100pmol/̀ µl)
0.5µl môi R1 (20pmol/̀ µl)
0.5µl môi R2 (30pmol/̀ µl)
0.5µl môi R3 (50pmol/̀ µl)
21 µl n c cât hai lân vô trung, ướ ́ ̀ ̀
Hut 1,5 - 2 ́ µl dich chiêt DNA t mâu phân tich. ̣ ́ ừ ̃ ́
b. Th c hiên phan ngự ̣ ̉ ứ
Th c hiên phan ng trên may luân nhiêt theo cac chu ky sau:ự ̣ ̉ ứ ́ ̣ ́ ̀
Giai đoan 1 (1 chu ky): ̣ ̀ 93
0
C trong 5 phut́
14
Giai đoan 2 (5 chu ky):̣ ̀ 93
0
C trong 20 giây
70
0
C trong 20 giây
72
0
C trong 20 giây
Giai đoan 3 (20 chu ky):̣ ̀ 93
0
C trong 20 giây
55
0
C trong 20 giây
72
0
C trong 20 giây

M : Thang DNA
Gi ng 1, 3 : M u tôm nhi m WSSVế ẫ ễ

n ngặ
Gi ng 2, 8 : M u tôm không nhi m WSSVế ẫ ễ
Gi ng 4, 5, 6, 7 : M u tôm nhi m WSSV nhế ẫ ễ ẹ
1 2 M 3 4 5
6 7 8
20 µl n c DEPC ướ
2-5µl RNA YHV (đã biên tinh trên may luân nhiêt 70́ ́ ́ ̣
0
C trong 10 phut, lam lanh nhanh́ ̀ ̣
băng may luân nhiêt 4̀ ́ ̣ ở
0
C).
T t c cho vào micro tube PCR 0.2 ml. Sau đó th c hi n ph n ng trên máy luânấ ả ự ệ ả ứ
nhi tệ
b. Th c hiên phan ngự ̣ ̉ ứ
Th c hiên phan ng trên may luân nhiêt theo cac chu ky sau:ự ̣ ̉ ứ ́ ̣ ́ ̀
01 chu ky ̀ 42
0
C trong 45 phut́
01 chu ky ̀ 94
0
C trong 5 phut́
35 chu ky ̀ 94
0
C trong 30 giây
58
0

C trong 10 phut, lam lanh nhanh́ ̀ ̣
băng may luân nhiêt 4̀ ́ ̣ ở
0
C ho c trong n c đá).ặ ướ
T t c cho vào micro tube PCR 0.2 ml. Sau đó, th c hi n ph n ng trên máy luânấ ả ự ệ ả ứ
nhi tệ
b. Th c hiên phan ngự ̣ ̉ ứ
Th c hiên phan ng trên may luân nhiêt theo cac chu ky sau:ự ̣ ̉ ứ ́ ̣ ́ ̀
01 chu ky ̀ 42
0
C trong 45 phut́
01 chu ky ̀ 94
0
C trong 5 phut́
35 chu ky ̀ 94
0
C trong 45 giây
60
0
C trong 45 giây
72
0
C trong 30 giây
1 chu ky ̀ 72
0
C trong 7 phut́
Gi nhi t đ 4ữ ở ệ ộ
0
C
Xac đinh san phâḿ ̣ ̉ ̉ : S dung 10ử ̣ µl san phâm khuêch đai điên di trên gel agrose 1,5% th ỉ ̉ ́ ̣ ̣ ờ

01 chu ky ̀ 94
0
C trong 2 phut́
40 chu ky ̀ 94
0
C trong 45 giây
60
0
C trong 45 giây
60
0
C trong 45 giây
1 chu ky ̀ 72
0
C trong 7 phut́
Gi 4ữ
0
C cho đên khi phân tich́ ́
Xac đinh san phâḿ ̣ ̉ ̉ : S dung 10ử ̣ µl san phâm khuêch đai điên di trên gel agrose 1,5% th ỉ ̉ ́ ̣ ̣ ờ
gian 30-40 phut va 100V.́ ̀ ở
Kêt qua điên di:́ ̉ ̣
4. Qui trình ch n đoán MBV (ẩ Surachetpong W., 2005)
18
1: M u TSVẫ
M: Thang DNA
2, 3, 4, 5: M u tôm không nhi m TSVẫ ễ
6, 7: M u tôm nhi m TSVẫ ễ
1 M 2 3 4 5
6 7
Qui trinh: S d ng m t c p m i khu ch i m t o n gen (Genbank: AY819785) cú

Thanh phõn 50 àl phan ng PCR gụm:
25 àl PCR Master mix (Promega),
1 àl mụi HPV F (40pmol/àl)
1 àl mụi HPV R (40pmol/àl)
21 àl n c cõt hai lõn vụ trung,
Hut 1,5 - 2 àl dich chiờt DNA t mõu phõn tich.
b. Th c hiờn phan ng
Th c hiờn phan ng trờn may luõn nhiờt theo cac chu ky sau:
Giai oan 1 (1 chu ky): 95
0
C trong 5 phut
Giai oan 2 (35 chu ky): 94
0
C trong 40 giõy
55
0
C trong 30 giõy
72
0
C trong 30 giõy
Giai o n 3 chu ky 72
0
C trong 7 phut
Gi 4
0
C cho ờn khi phõn tich
19
K t qu đi n diế ả ệ
6. Qui trình RT-nested PCR ch n đoán virus VNN gây b nh trên cá Mú (Leobert D.ẩ ệ
De la Pena, 2002)

0
C trong 45 phut́
01 chu ky ̀ 95
0
C trong 4 phut́
30 chu ky ̀ 95
0
C trong 40 giây
55
0
C trong 40 giây
72
0
C trong 40 giây
1 chu ky ̀ 72
0
C trong 7 phut́
Gi 4ữ
0
C cho đên khi phân tich́ ́
Ph n ng Nested PCRả ứ
Th c hiên phan ng b c 2 trên may luân nhiêt theo cac chu ky sau:ự ̣ ̉ ứ ướ ́ ̣ ́ ̀
01 chu ky ̀ 95
0
C trong 4 phut́
30 chu ky ̀ 95
0
C trong 30 giây
60
0

2-5µl RNA GAV (đã biên tinh trên may luân nhiêt 70́ ́ ́ ̣
0
C trong 10 phut, lam lanh nhanh́ ̀ ̣
băng may luân nhiêt 4̀ ́ ̣ ở
0
C ho c trong n c đá).ặ ướ
T t c cho vào micro tube PCR 0.2 ml. Sau đó, th c hi n ph n ng trên máy luânấ ả ự ệ ả ứ
nhi tệ
b. Thanh phân 50 ̀ ̀ µl phan ng Nested PCR b c 2 gôm: ̉ ứ ướ ̀
25 µl PCR Master mix (Promega),
0.7µl môi ̀ GAV1 (50pmol/µl)
0.7µl môi ̀ GAV2 (50pmol/µl)
21.6 µl n c cât hai lân vô trungướ ́ ̀ ̀
2 µl s n ph m khu ch đ i b c 1ả ẩ ế ạ ướ
c. Th c hiên phan ngự ̣ ̉ ứ
Ph n ng RT-PCRả ứ
Th c hiên phan ng trên may luân nhiêt theo cac chu ky sau:ự ̣ ̉ ứ ́ ̣ ́ ̀
01 chu ky ̀ 45
0
C trong 45 phut́
01 chu ky ̀ 95
0
C trong 4 phut́
35 chu ky ̀ 95
0
C trong 45 giây
58
0
C trong 60 giây
72

th i gian 30-40 phut va 100V.ờ ́ ̀ ở
8. Qui trình ch n đoán b nh SVCV trên cá chép và cá c nhẩ ệ ả
a. Chuân bi phan ng RT-PCR ̉ ̣ ̉ ứ
Hút 25 µl AccessQuick
TM
Master mix (Promega)
1 µl môi SCVCF1 (50 pmol/̀ µl)
1 µl môi SCVCR2 (50 pmol/̀ µl)
1 µl Enzyme reverse transcriptase M-MLV(Promega)
19 µl n c DEPC ướ
2-5µl RNA SCVC (đã biên tinh trên may luân nhiêt 70́ ́ ́ ̣
0
C trong 10 phut, lam lanh́ ̀ ̣
nhanh băng may luân nhiêt 4̀ ́ ̣ ở
0
C ho c trong n c đá).ặ ướ
T t c cho vào micro tube PCR 0.2 ml. Sau đó, th c hi n ph n ng trên máy luânấ ả ự ệ ả ứ
nhi tệ
b. Thanh phân 50 ̀ ̀ µl phan ng Semi-Nested PCR gôm: ̉ ứ ̀
25 µl PCR Master mix (Promega),
1 µl môi SCVCF1 ̀ (50pmol/µl)
23
618
bp
317
bp
S n ph m khu ch đ i RT-nested PCR trên RNA GAV&LOVả ẩ ế ạ
1 µl môi SCVCR4 ̀ (50pmol/µl)
21µl n c cât hai lân vô trungướ ́ ̀ ̀
2 µl s n ph m khu ch đ i b c 1ả ẩ ế ạ ướ

0
C trong 60 giây
55
0
C trong 60 giây
72
0
C trong 60 giây
1 chu ky ̀ 72
0
C trong 7 phut́
Giữ 4
0
C cho đên khi phân tich́ ́
9. Qui trình multiplex RT-PCR ch n đoán virus gây b nh tr ng đuôiẩ ệ ắ
Nguyên t cắ : Nguyên t c ph n ng là s d ng hai m i ắ ả ứ ử ụ ồ MrNVR và XSVR là hai m iồ
ng c s b t c p v i t ng ng v i RNA c a t ng virus, sau đó s t o cDNA trongượ ẽ ắ ặ ớ ươ ứ ớ ủ ừ ẽ ạ
m t th i gian, r i gia nhi t đ b t ho t enzym phiên mã ng c, chu kỳ ti p t c đ cộ ờ ồ ệ ể ấ ạ ượ ế ụ ượ
th c hi n cùng v i hai m i ự ệ ớ ồ MrNVF - MrNVR và XSVF - XSVR cho t ng virus. Kíchừ
th c s n ph m khu ch đ i 681 bp là ướ ả ẩ ế ạ MrNV và 500 bp là XSV.
a. Chuân bi phan ng ̉ ̣ ̉ ứ
Hút 25 µl AccessQuick
TM
Master mix (Promega)
1 µl môi ̀ MrNVF (20 pmol/µl)
24
1 µl môi ̀ MrNVR (20 pmol/µl)
1 µl môi XSVF (20 pmol/̀ µl)
1 µl môi XSVR (20 pmol/̀ µl)
1 µl Enzyme reverse transcriptase M-MLV(Promega)

0
C cho đên khi phân tich́ ́
Xac đinh san phâḿ ̣ ̉ ̉ : S dung 10ử ̣ µl san phâm khuêch đai điên di trên gel agrose 1,5% th ỉ ̉ ́ ̣ ̣ ờ
gian 30-40 phut va 100V.́ ̀ ở
Kêt qua điên di:́ ̉ ̣
10. Qui trình RT-nested PCR ch n đoán virus IMNV (Poulos và ctv, 2006)ẩ
25
0 1 2 3 4 5 M 1 2 34 5 0
XSV
M rNV
A B