Tinh sạch protein
bằng phương pháp tủa (tt)

3. Tủa protein bằng phương pháp
điểm đẳng điện
Khi thay đổi pH của môi trường, mức
độ tủa của protein cũng thay đổi. Ở
pH thấp, protein tích điện dương vì
nhóm amide bị proton hóa (thu nhận
proton). Ở giá trị pH cao, protein tích
điện âm vì các nhóm carbocyl trong
phân tử protein bị mất đi proton (mất
H
+
). Tại giá trị pI (Isoelectrics point -
điểm đẳng điện), protein không tích
điện. Điều này làm giảm tính tan của
protein vì protein không còn khả năng
tương tác với môi trường, khi đó, các
phân tử protein sẽ tách ra khỏi môi
trường. Hiện tượng này được giải
thích bằng phương trình Cohn.
Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của 2
protein khác nhau thay đổi theo pH
+ m
j
)
Trong đó
µ
i
0
: điện thế hóa học chuẩn của phần
tử i
µ
i
: điện thế hóa học của phần tử i
R: hằng số khí
T: nhiệt độ tuyệt đối
m
i
, m
j:
nồng độ molar của phần tử i và
j
f
ii
: hệ số tương tác của phần tử i
f
ij
: hệ số tương tác giữa phần tử i và j
Khi protein tồn tại ở nồng độ cao, hay
pH môi trường vượt ra ngoài điểm
đẳng điện mới xảy ra quá trình tương
tác giữa các cấu tử trong protein.

giảm vì sự hiện diện của protein kia.
Thuận lợi của phương pháp tủa bằng
cách sử dụng non – ionic polymers là
protein sản phẩm bền, và có thể sử
dụng ở nhiệt độ phòng.

5. Tủa bằng ion kim loại
Trong phương pháp tủa này, ion kim
loại sẽ gắn với một phần của phân tử
protein. Thuận lợi của phương pháp
này là có thể tủa được protein trong
một dung dịch rất loãng. Các ion kim
loại có thể chia làm ba nhóm. Các ion
như Mn
2+
, Fe
2+
, Co
2+
, Ni
2+
, Zn
2+
và
Cd
2+
sẽ gắn chặt vào các acid
carboxylic và các hợp chất có chứa
nitrogen. Các ion như Ca
2+

0
C trong 60 phút.
5. Ly tâm ở 13.000 – 15.000 x g trong
vòng 10 phút.
6. Cẩn thận loại bỏ dịch nổi. Tránh
chạm tới phần cặn protein.
(Nếu muốn loại bỏ hoàn toàn các chất
tạp nhiễm, có thể lặp lại các bước từ 2
– 6) trước khi tiến hành bước 7)
7. Để cho acetone bay hơi tự do ở
nhiệt độ phòng trong vòng khoảng 30
phút.

Tủa bằng Acetone/TCA
(Trichloroacetic acid)
1. Chuẩn bị dung dịch TCA 10%
trong aceton. Bảo quản ở - 20
0
C cho
đến khi sử dụng.
2. Thêm 10 thể tích TCA 10% trong
acetone vào mẫu. Vortex. Ủ ở - 20
0
C
ít nhất 3h (tốt nhất nên ủ qua đêm).
3. Ly tâm ở 15 000 x g trong 10 phút.
Loại bỏ dịch nổi.
4. Thêm 1 thể tích acetone lạnh ( -
200C). Vortex. Để ở - 20
0

10. Làm khô cặn.

Tủa bằng Chloroform/Methanol
1. Thêm 4 thể tích Methanol vào mẫu.
Vortex kỹ.
2. Thêm 1 thể tích Chloroform.
Vortex.
3. Thêm 3 thể tích nước. Vortex.
4. Ly tâm 15 000 x g trong 2 phút.
(Lúc này, protein có thể còn trên phần
dịch nổi). Loại đi phần nước ở lớp
trên.
5. Thêm 4 thể tích Methanol. Vortex.
6. Ly tâm 15 000 x g trong 2 phút.
Cẩn thận loại bỏ hoàn toàn dịch nổi.
Tránh chạm đến phần cặn.
7. Làm khô mẫu bằng buồng hút chân
không hay bằng không khí.