Các phương pháp phát hiện virus gây
bệnh cho lan
Hai loại virus chính gây hại nghiêm
trọng cho lan là virus CymMV
(Cymbidium mosaic virus) và ORSV
(Odontoglossum ringspot virus). Việc
phát hiện sớm để ngăn ngừa và kiểm
soát virus gây nhiễm là vấn đề then chốt
đặt ra cho các nhà nông cũng như là các nhà nghiên cứu nuôi trồng lan.

Đối với các nhà vườn lan, thì việc khó khăn và nguy hại nhất là sự gây hại
nghiêm trọng của các tác nhân gây bệnh cho cây lan, gồm có côn trùng,
nấm, vi khuẩn, virus. Trong đó, mức độ tác hại do virus gây ra là nghiêm
trọng nhất vì không phát hiện sớm ở giai đoạn đầu và mức độ lây lan cao.
Trong đó hai loại virus chính gây hại nghiêm trọng cho lan là
virusCymMV (Cymbidium mosaic virus) và ORSV (Odontoglossum ringspot
virus). Do vậy, việc phát hiện sớm để ngăn ngừa và kiểm soát virus gây
nhiễm là vấn đề then chốt đặt ra cho các nhà nông cũng như là các nhà
nghiên cứu nuôi trồng lan. Mà đặc biệt là làm sao có thể dễ dàng phát hiện
và chẩn đoán sớm 2 loại virus này bằng các kỹ thuật thật đơn giản, ít tốn
kém là điều bận tâm rất lớn của các nhà nông. Cũng đã có rất nhiều nghiên
cứu tìm phương pháp tối ưu nhất để phát hiện 2 loại virus này, bao gồm các
phương pháp miễn dịch như ELISA, RIPA (rapid immunofilter paper assay);
phương pháp PCR; các test nhanh; phương pháp sắc ký;… Hiện nay, cũng
có nhiều sản phẩm đang lưu hành trên thị trường dùng để phát hiện 2 loại
virus này như: kit DAS-ELISA của hãng DSMZ (D-0187, D-0493, D-0100),
các test thử nhanh của Agdia, các kit Monoplex, Multiplex RT-PCR,…

I. Phát hiện virus gây hại lan bằng cách test thử nhanh
Các loại test thử nhanh này dùng để sàng lọc và phát hiện sớm các mẫu
nghi ngờ bị nhiễm bệnh, nhằm ngăn ngừa và kiểm soát bệnh hiệu quả. Cách

vạch màu (chi tiết ở hình 1): Hình minh h
ọa kết quả phát hiện
virus CymMV và ORSV b
ằng
kit Agdia (www.agdia.com)

2. Pocket Diagnostics Orchid virus screen - Cymbidium mosaic virus
and Odontoglossum ringspot virus
Sản phẩm gồm có 1 pack silica chứa 1 test phát hiện CymMV, 1 test phát
hiện ORSV, 1 ống chứa dung dịch tách chiết (extraction bottle), 1 pipett
nhựa, vài vòng bi thép sạch. Các sản phẩm của kit Pocket Diagnostics Orchid virus screen
(http://jwund.homestead.com/pdviruskit.html)

Cách thực hiện kit này rất dễ dàng tiện dụng, không cần kinh nghiệm và
dễ bảo quản (lưu trữ ở nhiệt độ phòng, khô thoáng):
· Sử dụng mẫu lá mới nhất nghi ngờ nhiễm bệnh.
· Cắt các mẫu mô lá này thành những mảnh nhỏ có kích thước
khoảng 5-7mm theo chiều rộng, và chiều dài khoảng 1-2cm, sau đó
lát mỏng các mẫu lá này theo chiều dọc. Đối với mẫu hoa, chỉ cần
cắt nhỏ.
· Thực hiện 3 vạch cắt chéo ngang mẫu lá đã lát mỏng, và đặt vào
trong extraction bottle.
· Lắc trong vòng 30 giây. Lấy vài giọt mẫu sau khi lắc nhỏ vào
giếng tròn của dụng cụ test phát hiện virus.

· Bổ sung 450µl RX buffer. Trộn đều.
· Lọc dung dịch qua cột (Shearing tube column).
· Rửa cột với 230µl ethanol tuyệt đối. Lọc dung dịch qua cột
(Plant total RNA tube column) của kit.
· Rửa cột 1 lần với dung dịch WF, và 2 lần với dung dịch WS.
· Hòa RNA tổng số trong 50µl nước cất 2 lần.
· Đo nồng độ RNA thu được.
· Lưu trữ -80
o
C đến khi dùng.

Trình tự primer:
Cặp primer tổng hợp gene CP của virus CymMV; sản phẩm có kích
thước 669bp:
CymMV CP-F1: ATGGGAGAGYCCACTCCARCYCCAGC
CymMV CP-R1 TTCAGTAGGGGGTGCAGGCA.

Cặp primer tổng hợp gene CP của virus ORSV; sản phẩm có kích
thước 474bp:
ORSV CP-F1 ATGTCTTACACTATTACAGACCCG.
ORSV CP-R1 GGAAGAGGTCCAAGTAAGTCC.

Cặp primer tổng hợp gene nad5 mRNA của thực vật dùng làm chứng
nội; sản phẩm có kích thước 185 bp:
mt-F2 GCTTCTTGGGGCTTCTTGTTCGATA
mt-R1 ATCTCCAGTCACCAACATTGGCAT

a. Thực hiện phản ứng Monoplex RT-PCR:
Chuẩn bị phản ứng RT:
Đối với mẫu phân tích: (Chuẩn bị mẫu đối chứng tương tự ngoại trừ

DyNAzyme
™
II DNA polymerase enzyme (2 U/ µl, Finnzymes Inc.)
0.4µl
Nước cất 2 lần 11.6µl.

Sau khi đã chuẩn bị, tiếp theo là đặt các phản ứng vào máy PCR và thiết
lập chương trình phản ứng như sau:
Bước 1: biến tính ở 96
o
C trong 5 phút.
Bước 2: 96
o
C trong 30 giây.
Bước 3: 52
o
C trong 30 giây.
Bước 4: 72
o
C trong 30 giây.
Lặp lại 30 chu kỳ từ Bước 2 đến Bước 4.
Bước 5: 72
o
C trong 7 phút.

Và cuối cùng là phân tích sản phẩm khuếch đại trên gel agarose, nhuộm
gel và quan sát trên máy đọc UV để xác định kích thước các vạch DNA xuất
hiện trên gel khi so sánh với thang chuẩn DNA ladder 1kb Plus (Invitrogen).
Từ đó suy ra kết quả.