Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
VŨ THỊ BƯỞI NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG CỦA VIRUS Y
TRÊN KHOAI TÂY TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.70

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Có thể tìm hiểu luận văn tại thư viện Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM VŨ THỊ BƢỞI

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG CỦA VIRUS Y
TRÊN KHOAI TÂY TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

phòng thí nghiệm Di truyền học, khoa Sinh-Trƣờng Đại học Sƣ phạm; phòng
thí nghiệm thuộc khoa Sinh-Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên
đã nhiệt tình hƣớng dẫn, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin dành cho những ngƣời thân yêu trong gia đình và
bạn bè những lời biết ơn sâu sắc.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
iii
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa có ai công bố
trong một công trình nào khác.

Thái Nguyên, tháng 9, năm 2009
Tác giả
Vũ Thị Bƣởi
cs
Cộng sự
DEPC
Diethyl pyrocarbonate
NXB
Nhà xuất bản
IPTG
Isopropylthio-β-D-galactosidase
Kb
Kilobase
LB
Luria and Bertani
RT-PCR
Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction
PVY
Potato virus Y
PVY
N
Potato virus Y strain N
PVY
C
Potato virus Y strain C
PVY
O
Potato virus Y strain O
PVY
NTN
Potato virus Y strain (variant) NTN
RNase
Ribonuclease

Hình 1.9. Vị trí các gen kháng PVY trên genome khoai tây
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
Hình 3.1. Một số hình ảnh về khoai tây ở các vùng nghiên cứu
Hình 3.2. Kết quả RT-PCR từ RNA của các mẫu lá khoai tây nghi
nhiễm bệnh
Hình 3.3. Kết quả điện di DNA thu đƣợc từ kỹ thuật thôi gel trên agarose 1%
Hình 3.4. Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phổ Yên
Hình 3.5. Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phú Bình
Hình 3.6. Kết quả điện di tách plasmid mang gen CP
Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide của gen CP-PVY trên 2 mẫu
nghiên cứu
Hình 3.8. So sánh trình tự acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu
nghiên cứu
Hình 3.9. Biểu đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của CP-
PVY phân lập đƣợc từ Phổ Yên và Phú Bình với 19 trình tự trong
ngân hàng gen

13

16
16

17
19

21
22
23
24
29

Bảng 3.1. Tỉ lệ có triệu chứng bị bệnh ở các cánh đồng khoai tây
nghiên cứu
Bảng 3.2. Trình tự mồi đặc hiệu nhân gen CP
Bảng 3.3. Trình tự mồi để thực hiện colony-PCR
Bảng 3.4. 19 trình tự trong ngân hàng gen đƣợc sử dụng để đƣa ra
so sánh
Bảng 3.5. Hệ số giống nhau và khác nhau về trình tự nucleotide
vùng mã hoá của gen CP ở mẫu nghiên cứu với các mẫu trên ngân
hàng gen NCBI
8
8
9
10
28
32
32
33
35
36

39
40
45

51 54

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14
14
14
16
17
18
20
24
24
27
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.2. Hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất
2.2.2. Thiết bị
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp thống kê
2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số
28
28
28
28
28
29
29
29
30
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
viii

34
34
35
36
38
38
40
40
42
43
44
46

47

47 50
55
56
57 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một cây lƣơng thực chủ lực đứng
đầu trong các loại cây lấy củ trên thế giới và đứng thứ 5 trong số các cây

là phổ kháng bệnh của những cây chuyển gen này phụ thuộc vào độ tƣơng
đồng về mặt di truyền của chủng virus có gen đƣợc sử dụng để tạo cây chuyển
gen và các dòng virus gây bệnh trong tự nhiên. Vì vậy khảo sát tính đa dạng
di truyền của gen mã hoá cho protein vỏ virus (coat protein- CP) có ý nghĩa
rất quan trọng trong việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus.
Xuất phát từ những lí do trên, tôi lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sĩ là:
“Nghiên cứu tính đa dạng của virus Y trên khoai tây trồng tại Thái
Nguyên”.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Xác định sự đa dạng trong cấu trúc gen mã hoá protein vỏ (CP- coat
protein) của PVY phân lập từ các mẫu lá khoai tây thu tại một số địa phƣơng
thuộc tỉnh Thái Nguyên.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.1. Khảo sát, thống kê và xác định tỉ lệ nhiễm PVY trên khoai tây ở Thái
Bình, Thái Nguyên, Hƣng Yên, Bắc Giang làm cơ sở cho việc thu mẫu và xác
định sự có mặt của virus PVY.
3.2. Tách chiết RNA của virus từ các mẫu khoai tây thu thập đƣợc.
3.3. Nhân gen CP, tách dòng và đọc trình tự gen CP của PVY trong các mẫu
khoai tây.
3.4. So sánh trình gen CP của PVY phân lập đƣợc với một số trình tự đã công
bố trong ngân hàng gen NCBI.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY KHOAI TÂY
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và giá trị của khoai tây
Cây khoai tây có tên khoa học là Solanum tuberosum L., thuộc họ cà
(Solanaceae).
Khoai tây có nguồn gốc từ vùng núi Andes của Bolivia và Peru. Vào thế

sản phẩm thơm ngon, có giá trị dinh dƣỡng cao. Khoai tây cũng đƣợc sử dụng
trong công nghiệp sản xuất cồn, cao su nhân tạo (Hồ Hữu An và cs, 2005) [1].
Đặc biệt, khoai tây cũng là một dƣợc phẩm. Củ khoai tây có vị ngọt,
tính bình, có tác dụng bổ khí, kiện tỳ, tiêu viêm. Nó dùng để chữa chứng khó
tiêu, đau bụng, viêm loét dạ dày, viêm tuyến nƣớc bọt, say nắng, sốt, bỏng
nhẹ, eczema, vết thƣơng…Hoa khoai tây chữa bệnh tăng huyết áp và là
nguyên liệu chiết rutin để chữa bệnh. Quả và mầm củ khoai tây ít đƣợc dùng
làm thuốc vì dễ gây độc. Trong công nghiệp dƣợc phẩm, chúng đƣợc chiết lấy
solanin để làm thuốc giảm đau, chữa đau bụng, đau nhức xƣơng khớp, chữa dị
ứng, chống hen, viêm phế quản, động kinh (Hƣơng Tú, 2008) [11].
Trong củ khoai tây có nhiều chất chống oxi hoá, nó có khả năng ngăn
ngừa quá trình lão hoá, hạn chế sự phát triển của ung thƣ và một số bệnh
khác. Các nhà nghiên cứu tại trƣờng Đại học Y Harvard-Mỹ đã phát hiện ra
rằng: những ngƣời thƣờng xuyên ăn khoai tây có khả năng giảm ung thƣ
tuyến tiền liệt (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12].
Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy củ khoai tây rất giàu sterol,
giúp tăng cƣờng khả năng miễn dịch của cơ thể. Có nghiên cứu cho thấy,
khoai tây có tác dụng làm chậm sự tấn công của HIV/ AIDS. Theo dõi trên
một nhóm bệnh nhân HIV thấy những ngƣời ăn khoai tây có khả năng sống
thêm đƣợc ít nhất 2 năm nữa so với những bệnh nhân không ăn (Vũ Hƣớng
Văn, 2007) [12].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5
1.1.2. Một số đặc điểm sinh học của cây khoai tây
Cây khoai tây thuộc loại thân thảo, bao gồm các bộ phận thân, lá, rễ,
hoa, quả, hạt. Thân và lá khoai tây có nhiều lông, lá kép lông chim không đối
xứng. Hoa cân đối, cánh hoa có gốc dính liền nhau. Nhị đực kết dính thành
ống hoặc chóp cụt, nhị cái ở trên và dễ rụng. Cây khoai tây chủ yếu là tự thụ,
một số trƣờng hợp giao phấn. Cánh hoa có các màu: trắng, tím- đỏ, tím xanh,
xanh thẫm. Quả có hai ô, hạt rất nhỏ có mầm uốn cong. Khoai tây thƣờng

+ Thiếu giống có chất lƣợng tốt, phù hợp với điều kiện khí hậu.
+ Chƣa có biện pháp phòng trừ bệnh đặc biệt là bệnh virus có hiệu quả
(Trƣơng Quang Vinh, 2007) [14].
1.2. VIRUS GÂY BỆNH Ở KHOAI TÂY
Hiện tƣợng thoái hoá khoai tây, do virus gây ra, đã đƣợc mô tả và phát
hiện ngay từ thế kỉ XVIII, nhƣng tác nhân gây ra nó phải đến tận thế kỉ XX
mới đƣợc xác định. Virus cuốn lá (potato leafroll virus viết tắt là PLRV) là
virus đƣợc phát hiện đầu tiên vào năm 1916 bởi Quanfer, Vanderlek và O.
Botfes. Những virus chủ yếu gây khảm trên khoai tây (potato virus M, potato
virus X, potato virus Y, potato virus A) đƣợc xác định trong những năm 1920
và 1930. Những virus quan trọng khác chỉ đƣợc phám phá trong những năm
1950 (tobacco rattle virus, potato virus S) hoặc giữa những năm 1960 (potato
mop-top virus) (Vũ Triệu Mân, 1986) [6], (Kerlan, 2008) [40]. Trong 4 thập
kỉ gần đây, ngƣời ta đã phát hiện thấy số lƣợng virus ngày càng gia tăng ở
châu Mỹ La Tinh, đặc biệt là trong châu thổ Andean, nơi đƣợc xem là khởi
nguồn của khoai tây. Nhiều virus phổ biến ở các cây chủ khác, đôi khi lại
nhiễm vào khoai tây. Một số chúng, ví dụ nhƣ virus đốm héo cà chua (tomato
spotted wilt virus), gây bệnh cho khoai tây và có thể trở nên nghiêm trọng
trong tƣơng lai. Nhiều tác giả cũng lƣu ý rằng, một virus truyền qua con
đƣờng tiếp xúc, nhƣ pepino mosaic virus, cho đến nay vẫn chƣa đƣợc phát
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7
hiện trên khoai tây, cũng có khả năng nhiễm vào nhiều cây khoai tây quan
trọng và trở thành một hiểm họa trong tƣơng lai.
Những ngƣời trồng khoai tây ở nhiều quốc gia đã thừa nhận rằng khoai
tây giống ảnh hƣởng lớn tới hiệu quả sản xuất. Chƣơng trình sản xuất khoai
tây giống phát triển trong những năm 1940 và 1950. Khoai tây giống đƣợc
chứng nhận với mức độ nhiễm virus thấp bây giờ đã trở thành nhân tố chính
trong cuộc chiến chống virus. Nhân giống kháng mạnh với virus cuộn lá
(potato leafroll virus) đƣợc sử dụng ít nhất là từ những năm 1925 và khả năng

1931
Rất cao
Rộng khắp
Potato leafroll virus
(PLRV)
Polerovirus
1916
Rất cao
Rộng khắp
Potato virus X (PVX)
Potexvirus
1931
Cao
Rộng khắp
Potato virus A (PVA)
Potyvirus
1932
Vừa phải
Rộng khắp
Potato virus S (PVS)
Carlavirus
1952
Vừa phải
Rộng khắp
Potato virus M (PVM)
Carlavirus
1923
Vừa phải
Rộng khắp
Tobacco rattle

Ecuador, Peru
Andean potato mottle
virus (APMoV)
Comovirus

1977
Chƣa biết
Chili, Ecuador,
Peru, Brazil
Arracacha virus B-
oca strain (AVB-O)
Nepovirus

1981
Chƣa biết
Bolivia, Peru
Potato deforming
mosaic virus (PDMV)
Begomovirus

1985
Cao ở
một cây
Bắc Brazil
Potato rough dwart
virus (PRDV)
Carlavirus
1995
Rất thấp
Argentina,

Hiếm thấy
Eggplant mottled
Dwarf virus
(EMDV)
Nucleorhabdovirus

1987

Rất thấp
Iran
Potato aucuba
Mosaic Virus
(PAMV)
Potexvirus
1961

Thấp
Hiếm thấy
Potato latent virus
(PotLV)
Carlavirus
1996

Chƣa biết
Bắc Mỹ
Potato virus V
(PVV)
Potyvirus
1986


Khảm lá
Trọng lƣợng
củ (g/khóm)
30,0
225,0
240,0
295,0
Tỉ lệ % củ lớn
(%)
0,0
9,2
7,7
10,4
Tỉ lệ % củ
trung bình(%)
38,0
42,4
56,3
55,8
Tỉ lệ củ
nhỏ(%)
62,0
48,4
36,0
30,8
Tác hại của bệnh virus phụ thuộc vào nhiều yếu tố: điều kiện sống (khí
hậu, thổ nhƣỡng, biện pháp chăm sóc), cây trồng có khả năng chống chịu khác
nhau và loại, chủng virus gây bệnh. Có những vùng ở Tây Âu, virus cuốn lá
làm giảm tới 90% sản lƣợng dự thu khi bệnh nặng. Trong khi đó, thiệt hại ở
Đông Âu phần lớn lại do virus Y gây ra. Ở Việt Nam, virus cuốn lá gây hại

nerosis virus). Nhiều loài virus Andean có thể truyền bởi hạt (true potato seeds)
và phấn hoa. Trong hầu hết các trƣờng hợp thì nguồn lây nhiễm là bản thân cây
khoai tây (Kerlan, 2008) [40].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
12
1.2.2.3. Phƣơng pháp phòng chống bệnh virus khoai tây
* Quản lí khoai tây giống
Mục đích của công việc này là phân loại chất lƣợng về phạm trù thƣơng
mại của khoai tây giống. Tiêu chuẩn này phụ thuộc vào từng nƣớc, tuy nhiên
mức độ nhiễm không nên quá 10% với tất cả các virus (Kerlan, 2008) [40].
Quá trình sản xuất khoai tây giống đảm bảo chất lƣợng gồm các bƣớc
chính sau:
+ Nhân giống trong điều kiện mức độ nhiễm virus rất thấp. Ví dụ nhƣ
trong ống nghiệm, hay trong nhà kính, ống nhựa ngăn chặn đƣợc vector hay
trong những cánh đồng cô lập ở vùng mà khả năng nhiễm virus thấp.
+ Kiểm tra cánh đồng bao gồm:
- Tỉa cây bị bệnh
- Diệt tất cả các nguồn lây nhiễm
- Có biện pháp xử lí chống lại các vector (sinh vật trung gian
truyền bệnh), đặc biệt là các côn trùng
+ Sử dụng kĩ thuật trồng đặc biệt tính đến ngăn chặn các vector nhƣ tỉa
cành khoai tây, trồng cây hàng rào.
+ Quản lí vụ thu hoạch: Kiểm tra ở phòng thí nghiệm trên diện rộng,
thông thƣờng sử dụng ELISA, đôi khi là các kĩ thuật phân tử.
* Nhân giống kháng virus
Có 3 kiểu kháng virus là: Resistance to infection hay field resistance;
hypersensitivity resistance (HR); extrem resistance (ER).
Resistance to infection đƣợc di truyền đa gen, đƣợc xác định bởi số củ
con cháu bị nhiễm. Nó bao gồm cả sự kháng với virus lẫn với tác nhân truyền
bệnh. Mức độ kháng phụ thuộc mạnh vào điều kiện môi trƣờng, thời gian

virus lạ từ một quốc gia hay một lục địa khác. Cho đến bây giờ, chƣa có một
loại virus hay chủng nào trong danh sách kiểm dịch truyền ra ngoài vùng khởi
đầu của nó. Các kĩ thuật cần thiết cho việc kiểm tra các vật liệu xuất nhập
khẩu (củ, cành, hạt, phấn hoa, cây non trong ống nghiệm) đã đƣợc thiết lập.
Các virus đƣợc chuẩn đoán bởi các thí nghiệm sinh học trên cây chỉ thị đƣợc
chọn lựa, phần lớn kiểm tra bởi ELISA. Các kĩ thuật sinh học phân tử và kính
kiển vi điện tử cũng có thể đƣợc sử dụng (Kerlan, 2008) [40].
1.3. POTATO VIRUS Y
1.3.1. Phân loại
Potato virus Y (PVY) thuộc chi potyvirus và họ potyviridae. Đây đƣợc
xem là một họ lớn nhất và gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế nhất của virus
thực vật (Dimitre và cs, 2004) [28], (Tetsuji Ogawa và cs, 2008) [66].
1.3.2. Cây chủ
Phạm vi cây chủ tự nhiên của PVY gồm những cây thuộc 9 họ. Có thể
kể đến các cây sau: Khoai tây (S. tuberosum ssp.tuberosum); một vài loài
khoai tây địa phƣơng ở Andes nhƣ A. andigena; nhiều cây dại họ cà; hồ tiêu
(Capsicum spp.); thuốc lá (Nicotiana spp.); cà chua (Lycopersicon spp.); cà
tím (S. melongena); các cây cảnh (Petunia spp., Dahlia spp.); các cây lâu năm
(Physalis virginiana, P. heterophyla); một số cây hàng năm hoặc cây tự nhân
giống lâu năm. Nhiều cây ở những vùng riêng biệt cũng là cây chủ của PVY
nhƣ Cotula australis ở New Zealand hoặc Sorbaria tomentosa ở Himalaya.
Cỏ dại thuộc họ cà thƣờng là nguồn lây nhiễm PVY cho cà chua, hồ
tiêu. Chúng gồm:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15
+ S. nigrum và S. dulcamara ở nhiều quốc gia
+ S. chacoense và P. viscosa ở nam Mỹ
+ S. Florida, P. gracile, S. aculeatissimum, P. angulata, P. ciliosa và P.
floridana ở Floria
+ P. virginiana và P. heterophyla là những cây chủ qua đông ở bắc Mỹ,