BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA NUÔI TR ỒNG THỦY SẢN
PHẠM THỊ THANH NH ÀN
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ
(IN SITU HYBRIDIZATI ON) PHÁT HIỆN TÁC NHÂN
GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TR ÊN ẤU TRÙNG
TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879)
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành Bệnh học Thủy Sản
Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2008
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA NUÔI TR ỒNG THỦY SẢN
PHẠM THỊ THANH NH ÀN
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ
(IN SITU HYBRIDIZATION) PHÁT HIỆN TÁC NHÂN
GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TR ÊN ẤU TRÙNG
TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879)
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành Bệnh học Thủy Sản
Cán bộ hướng dẫn:
1. TS. LÝ THỊ THANH LOAN
2. CN. ĐOÀN VĂN CƯ ỜNG
Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2008
i
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành c ảm ơn quý thầy cô trường Đại Học Thuỷ Sản Nha Trang
đặc biệt là thầy cô trong bộ môn Bệnh Học Thuỷ Sản đ ã tận tình truyền đạt kiến
thức cho chúng em trong thời gian qua.
Để hoàn thành tốt luân văn tốt nghiệp n ày tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận

2.1.5. Đặc điểm của ấu tr ùng 6
2.2. Bệnh trên ấu trùng tôm càng xanh 8
2.2.1.Các bệnh do vi khuẩn 8
2.2.1.1. Bệnh hoại tử do vi khuẩn 8
2.2.1.2. Bệnh phát sáng 8
2.2.1.3. Bệnh đốm nâu 9
2.2.1.4. Bệnh do Ricketsia. 9
2.2.2. Bệnh hoại cơ (Idiopathic Muscle Necrosis) (IMN). 9
2.2.3. Bệnh do nguyên sinh động vật 10
2.2.4. Một số bệnh chưa xác định rõ tác nhân gây bệnh 10
2.2.4.1. Bệnh giữa chu kỳ ấu tr ùng 10
2.2.4.2. Bệnh lột xác dính vỏ. 10
2.3. Bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh 11
2.3.1. Tình hình nghiên c ứu bệnh đục thân tr ên tôm càng xanh 11
2.3.2. Dấu hiệu của bệnh đục thân 11
iii
2.3.3.Tác nhân gây b ệnh 12
2.3.4. Sự lây nhiễm 13
2.4. Các phương pháp chu ẩn đoán bệnh đục thân trên tôm càng xanh 14
2.4.1. Phương pháp lai Dot – blot 14
2.4.2. Phương pháp ELISA 15
2.4.3. Phương pháp RT – PCR 16
2.4.4. Phương pháp mô học truyền thống 17
2.4.5. Phương pháp lai t ại chỗ 18 2.4.5.1. Nguyên t ắc 18
2.4.5.2. Kỹ thuật lai tại chỗ 19
2.4.5.3. Mẫu dò 22
PHẦN 3: VẬT LIỆU V À PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 26
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 26
3.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 26
3.2.1. Vật liệu và dụng cụ cho ứng dụng ph ương pháp lai tại chỗ và

và ISH 51
v
DANH MỤC CÁC HÌNH.
HÌNH NỘI DUNG TRANG
Hình 2.1. Hình Virus MrNV (Bonami và ctv, 2005) 13
Hình 2.2. Hình Virus XSV (Bonami và ctv, 2005) . 13
Hình 2.3 Sơ đồ tóm tắt kỹ thuật lai. 19
Hình 2.4 Digoxigenin – UTP/dUTP/ddUTP, alkali -stable 25
Hình 3.1 Sơ đồ xử lý mẫu 32
Hình 3.2 Sơ đồ nhuộm mẫu tự động . 33
Hình 4.1 Hình Post-larvae của tôm càng xanh với dấu hiệu: xuất hiện những đốm
trắng ở phần đuôi, phần bụ ng và phần đầu 38
Hình 4.2 Hình thái mô học tổ chức cơ tôm càng xanh 40
Hình 4.3 Hình tổ chức tế bào khối gan tụy 41
Hình 4.4 Sự xuất hiện thể vùi trên cơ quan mang của ấu trùng tôm càng xanh 41
Hình 4.5 Hình mô tôm kh ỏe mạnh mẫu A8 42
Hình 4.6 Tế bào nhiễm MrNV trên các cơ quan khác nhau c ủa tôm sau khi
nhuộm ISH 44
Hình 4.7 Tế bào nhiễm MrNV trên cơ quan gan t ụy sau khi nhuộm ISH 46
Hình 4.8 Tế bào nhiễm MrNV sau khi nhuộm ISH v à mô học truyền thống 49
vi
DANH SÁCH CÁC CH Ữ VIẾT TẮT.
TP.HCM : Thành phố Hồ Chí Minh.
MrNV : Macrobrachium rosenbergii nodavirus.
XSV : Extra Small Virus.
ISH : In Situ Hybridization.
RT-PCR : Reverse Transcriptase-Polymerase Chain
Reaction.
DNA : Deoxyribonucleic Acid .
RNA : Ribonucleic Acid .

Để tăng cường kiểm soát bệnh, cho đến nay đ ã có rất nhiều phương pháp
hiện đại đã và đang được phát triển và ứng dụng trong chẩn đoán bệnh thủy sản nh ư
phương pháp Mô h ọc truyền thống, một số ph ương pháp dựa trên cơ chế miễn dịch
đặc hiệu (ELISA, Dot -Blot), các kỹ thuật PCR (PCR, RT -PCR)…Tuy nhiên vi ệc
tìm ra được phương pháp có tính đ ặc hiệu cao, tính nhạy cao v à là một công cụ hữu
hiệu để chẩn đoán đ ược chính xác tác nhân gây bệnh th ì luôn là mối quan tâm của
các nhà nghiên c ứu bệnh học thủy sản. V à với phương pháp lai t ại chỗ (In Situ
2
Hybridization) đó là kỹ thuật lai phân tử nhằm phát hiện tr ình tự nucleic nhất định
trong lát cắt mô. Nên nó đáp ứng được yêu cầu trên và là công cụ hữu hiệu để chẩn
đoán tác nhân mà phương pháp m ô học truyền thống không thể thực hiện đ ược.
Vì vậy, xuất phát từ thực tiễn cần thiết, đ ược sự đồng ý của khoa Nuôi Trồng
Thủy Sản, bộ môn Bệnh học Thủy Sản – trường Đại Học Nha Trang. D ưới sự
hướng dẫn của Tiến Sĩ Lý Thị Thanh Loan – Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy
Sản II. Em được phân công thực hiện đề t ài:
“ Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ (In Situ Hybridization) phát hiện tác
nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh ( Macrobrachium
rosenbergii De Man, 1879)”.
Mục tiêu:
Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ (ISH) để phát hiện sự hiện diện của tác nhân gây
bệnh đục thân tr ên ấu trùng tôm càng xanh.
Nội dung nghiên cứu:
- Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ (ISH) phát hiện tác nhân gây bệnh
đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh.
- So sánh kết quả thu được của phương pháp ISH v ới phương pháp mô h ọc
truyền thống và kỹ thuật RT-PCR về độ ổn đinh, độ nhạy, độ chính xác v à tính hiệu
quả.
Nghiên cứu đề tài này thành công s ẽ là tiền đề để nghiên cứu phát triển ph ương
pháp lai tại chỗ và ứng dụng để phát hiệ n chính xác đư ợc tác nhân gây bệnh trên đối
tượng thủy sản, cụ thể l à bệnh đục thân do virus tr ên ấu trùng tôm càng xanh.

mắt) và 10 -15 răng dưới chủy.
Các phụ bộ có hình dạng, kích cỡ và chức năng khác nhau với hai đôi râu có
chức năng xúc giác, một đôi h àm lớn, hai đôi hàm nhỏ và ba đôi chân hàm có ch ức
năng giữ và nghiền mồi. Năm đôi chân ngực có chức năng để bò, năm đôi chân
ngực để bơi và một đôi chân đuôi có chức năng như bánh lái. Hai đôi chân ng ực đầu
tiên của tôm chuyển hóa th ành hai đôi càng, đôi càng th ứ hai to dùng để bắt mồi và
tự vệ [37].
Ở tôm nhỏ có m àu sắc trong sáng, tr ên giáp đầu ngực có những sọc xanh đen
dọc hai bên. Tôm trưởng thành có màu xanh dễ nhận đôi khi có m àu nâu nhạt, cơ
thể có những vệt m àu xanh hơi sậm ngang lưng xen kẽ với màu trắng trong của cơ
thể [6], [9].
2.1.2. Vòng đời
Theo Ling và cộng sự (1962) và Phương (2003), v òng đời của tôm càng xanh
được chia thành 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, hậu ấu trùng và tôm trưởng thành. Khi
tôm trưởng thành, chúng thư ờng sống ở vùng nước ngọt và chính nơi này sẽ xảy ra
quá trình thành th ục, phát dục và giao vĩ đẻ trứng. Khi ôm trứng chúng có xu h ướng
bơi ra xa vùng nư ớc lợ từ 6 -8‰.
Ở đó ấu trùng được nở ra và sống trôi nổi theo kiểu ph ù du. Sau 11 lần lột
xác với 12 giai đoạn biến thái, ấu tr ùng (Nauplii) biến thành hậu ấu trùng (Post
larvae) lúc này tôm con di cư v ề vùng nước ngọt sống và lớn lên ở đó [35],[37].
2.1.3. Đặc điểm sinh sản
Ở tôm trường thành, tôm đực thường có kích thước lớn hơn tôm cái cùng
tuổi. Đầu ngực tôm đực to h ơn và khoang b ụng hẹp hơn so với tôm cái. Đôi c àng
thứ hai to, dài hơn và thường có màu xanh dương đ ậm. Các gốc chân ngực của tôm
đực xếp khít nhau h ơn so với tôm cái, hai lỗ sinh dục đực nằm đốt gốc của đôi chân
ngực thứ 5 [37].
Tôm cái thường có kích thước nhỏ hơn tôm đực, có phần đầu ngực v à đôi
càng thon nhỏ, ba tấm bụng đầu ti ên ở tôm cái rộng và dài tạo thành khoang bụng
làm buồng ấp trứng. Quá trình nở rộng của các tấm bụng n ày khi tôm tham gia sinh
5

Hiện nay được biết trên 100 loài, trong đó hơn m ột phần tư số này có ở châu Mỹ
[9]. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tôm c àng xanh phân bố ở tất cả các thủy
vực nước ngọt (đầm, hồ, ao, sông) v à các thủy vực nước lợ của nhiều v ùng trên thế
giới.Tôm càng xanh phân bố chủ yếu ở Đông Nam Á v à một khu vực khá hẹp của
Đông Bắc Á, giới hạn từ ấn Độ đến phía Đông của n ước Úc và đảo Solomon nh ư
Thái Lan, Ấn Độ, Sigapore, Nhật Bản, Hồng Kông, Philippine, Ondonesia,
Australia, Việt Nam và khu vực Tây Nam Thái B ình Dương chủ yếu khu vực từ
Châu Úc đến New Guinea [9].
Ở Việt Nam, tôm c àng xanh phân bố tự nhiên từ Nha Trang trở v ào đến
Đồng Bằng Nam Bộ v à tập trung chủ yếu ở các v ùng nước ngọt và vùng cửa sông
ven biển ở Đồng Bằng Sông Cửu Long [35].
2.1.5. Đặc điểm của ấu tr ùng
Ấu trùng nở ra và sống trôi nổi theo ki êu phù du, sống trong vùng nước lợ 6 -
18‰. Ấu trùng có tính hư ớng quang mạnh, b ơi chủ động bụng ngửa đuôi h ướng về
phía trước. Có thể cho ấu trùng ăn bằng các loại Artemia, Moina, thịt cá, thịt mực,
Artemia tiền trưởng thành, trùng chỉ (giun đỏ), thức ăn chế biến, thức ăn nhân tạo
Tuy nhiên, thức ăn thường được sử dụng nhất l à ấu trùng Artemia và th ức ăn chế
biến. Ấu trùng qua 12 lần lột xác để trở thành hậu ấu trùng [36], [37].
Bảng 2.1. Đặc điểm phát triển các giai đoạn của ấu tr ùng tôm càng xanh
(Aquacop, 1983)
Giai
đoạn
phát
triển
Hình thái
Thời
gian tính
sau khi
nở
ngày

244 k 36h
VI
Dài 4 – 4,1mm, đốt đuôi kéo dài thêm và thu h ẹp
lại. phần sau có mang 3 đôi gai ở phía b ên và 5 đôi
lông cứng ở phía sau. Hai đôi cạnh đôi giữa có
lông chim. Nhánh ngoài telson dài quá mút telson,
chân bụng đã nhú.
286k 45h
9 – 15
VII
Dài 4,1 – 4,2 mm, mầm chân bụng nhú l ên với các
mức độ khác nhau, các m ầm to thì chẻ 2. Mỗi gai
trên chủy có 5 – 6 răng, ở mép dưới xuất hiện
nhánh 3 của nhánh antene.
330k 58h
10 - 17
VIII
Dài 4,4 – 4,7 mm, các chân bụng đều có 2 nhánh
chưa có mang lông hay ch ỉ có 1 – 2 lông ở nhánh
ngoài.
262k 56h
11 – 18
IX
Dài 5,6 – 5,8 mm, chân bụng phát triển d ài thêm,
nhánh ngoài có 4 – 5 lông cứng.
385k 69h
13 – 19
X
Dài 6 – 6,2 mm, chân ngực 1 và 2 có kẹp. Xuất
hiện 3 – 4 gai chủy phía trên.

xử lý kịp thời th ì tỷ lệ chết rất nhanh [6].
Giai đoạn cấp tính thì ấu trùng có màu xanh nh ạt, dạ dày rỗng yếu dần và
chìm xuống đáy bể chết [21].
2.2.1.2. Bệnh phát sáng
Tác nhân gây b ệnh: Vi khuẩn phát sáng Vibrio harveyi gây bệnh trên các ấu
trùng giai đoạn sớm, bệnh th ường gặp cả trên đối tượng tôm nước ngọt và nước
mặn [6].
Triệu chứng bệnh : Sự phát sáng có thể quan sát dễ d àng vào ban đêm.
Ngoài ra còn quan sát được cơ thể tôm mờ đục, b ơi lội yếu dần và chết. Đây là một
bệnh nghiêm trọng có thể gây chết đến 100%. Vi khuẩn n ày rất nhạy cảm với
Chloramphenicol và Novobiocin nhưng kháng l ại Streptomycin [5], [6].
2.2.1.3. Bệnh đốm nâu
Bệnh này hay còn được gọi là bệnh đốm đen, bệnh tr ên vỏ.
Tác nhân gây b ệnh: Có thể do các nhóm vi khuẩn nh ư Aeromonas,
Pseudomonas [14]. Ngoài ra các yếu tố như môi trường ô nhiễm, mật độ nuôi quá
9
dày, chế độ cho ăn và chăm sóc quản lý không tốt cũng gây cho bệnh phát triển
nhanh và tỷ lệ chết cao hơn [8], [14].
Bệnh này xuất hiện ở tất cả các giai đoạn phát triển c ủa tôm, bệnh n ày gây
thiệt hại về kinh tế rất lớn, năng suất có thể giảm tới 30% [7], [8].
Triệu chứng bệnh: Tôm bị bệnh thường xuất hiện những đốm có m àu nâu,
sau đó chuyển dần sang màu đen. Tại các vết đen viêm dẫn đến lở loét. Các vết n ày
nằm phía trong của lớp vỏ kitin n ên khi tôm lột vỏ thì các vết này không mất đi.
Tôm bị bệnh nặng thường kém ăn, gầy yếu, các phần phụ bị cụt hết v à chết [7], [8].
2.2.1.4. Bệnh do Ricketsia
Triệu chứng bệnh : Sự suy thoái khối gan tụy của ấu tr ùng bị bệnh.
Tác hại: Bệnh này gây thiệt hại rất lớn đến sản l ượng tôm postlarvae, tỷ lệ tử
vong có thể đạt đến 95%. Giai đoạn ấu tr ùng rất dễ mẫn cảm với bệnh n ày, đặc biệt
là giai đoạn ấu trùng IV – V [21].
2.2.2. Bệnh hoại cơ (Idiopathic Muscle Necrosis) (IMN )

thịt lẫn nhau, những con yếu, bị bệnh sẽ bị con khỏe h ơn ăn thịt. Ấu trùng nhiễm
bệnh có màu xám lơ, bơi l ội yếu ớt và thường bơi theo hình xoắn ốc. Chúng chết
hàng loạt và nhanh chóng trong vòng 2 -3 ngày. Thường khi bắt đầu chết, m àu sắc
ấu trùng biến đổi trở lên nhạt hơn (mất sắc tố) [9], [10].
2.2.4.2. Bệnh lột xác dính vỏ
Bệnh này chủ yếu xảy ra ở giai đoạn ấu tr ùng, đặc biệt là sự lột xác biến thái
sang giai đoạn postlarvae.
Nguyên nhân gây b ệnh: Vẫn chưa được xác định, có thể l à do chất lượng
nước kém, lọc không kỹ hoặc do dinh d ưỡng không tốt, thiếu [9].
Triệu chứng bệnh: Ấu trùng bị bệnh này không thể lột vỏ hoàn toàn ra khỏi
các phần phụ, mắt hay chủy khi chúng thay vỏ, l àm tôm không hoạt động được,
không ăn được chết nhiều ở giai đoạn 11, không phát triển đến hậu ấu tr ùng [9].
Hay sau khi lột vỏ thì bị di tật các phụ bộ l àm cho chúng khó khăn trong quá tr ình
di chuyển và dần dần chết. Tỷ lệ chết có thể l ên tới 80% [6].
11
2.3. Bệnh đục thân tr ên ấu trùng tôm càng xanh
2.3.1. Tình hình nghiên c ứu bệnh đục thân tr ên tôm càng xanh
Bệnh đục thân hay c òn gọi là bệnh đục cơ, bệnh trắng đuôi [16], [18], [30] .
Bệnh này được nghiên cứu và phát hiện đầu tiên ở Guadeoupe [19]. Sau đó
bệnh xuất hiện ở Martinique ( Ấ n Độ) và Đài Loan [31], 5 tỉnh khác ở Trung Quốc
[24]], Thái Lan [32].
Bệnh này gây thiệt hại kinh tế nghi êm trọng cho ngành công nghiệp nuôi
trồng thủy sản của Ấn Độ v à các trại nuôi tôm càng xanh [26], [28]. Bệnh này có
thể gây chết rất nhiều, tỷ lệ tử vong có thể đạt tới 100% [27], [28].
Ở Việt Nam, bệnh đục thân l à một bệnh mới xuất hiện tr ên tôm càng xanh,
các nghiên cứu ở nước ta còn ít, mới chỉ bước đầu khảo sát dấu hiệu để t ìm ra tác
nhân. Có hai luận văn tốt nghiệp của sinh vi ên thực hiện tại Viện Nghiên Cứu Nuôi
Trồng Thủy Sản II.
Phạm Duy Lãm (2005), Ứng dụng kỹ thuật RT -PCR xác định MrNV và
XSV trên TCX. Kết quả thu được phát hiện thấy sự hiện diện của cả hai virus

bọc, có đường kính khoảng 26 – 27 nm (Hình 2.1). Bộ gen của MrNV gồm 2 sợi
đơn RNA (RNA – 1 và RNA – 2) với kích thước tương ứng là 2,9kb và 1,3kb. V ỏ
capsid là một chuỗi protein có khối l ượng 43kDa [16]. Với những đặc điểm n ày và
kết quả giải tr ình tự đoạn RNA1 của MrNV thì MrNV được xếp vào họ
Nodaviridae [16].
XSV là một tiểu thể giống virus có kích th ước nhỏ hơn virus MrNV, h ình đa
diện 20 mặt, không có m àng bao, có đường kính 14 - 16 nm (Hình 2.2). Bộ gen của
XSV là một sợi đơn RNA có kích thư ớc khoảng 0,8 – 0,9 kb [24]. Sau khi giải trình
tự bộ gen của XSV cho thấy RNA d ài 796 nucleotide và m ột đoạn poly (A) khoảng
15 – 20 nucleotide kết thúc ở đầu 3
’
[29]. Phân tích protein b ằng SDS – PAGE cho
thấy thể XSV chứa hai polypeptide l à capsid 17 kDa (CP – 17) và capsid 16 (CP –
16) [24].
13
Hình 2.1: Virus MrNV Hình 2.2: Virus XSV (Bonami và ctv, 2005)
Vai trò và mối quan hệ giữa MrNV v à XSV chưa được rõ ràng. Một điểm
đặc biệt là MrNV có thể xuất hiện một m ình trong các mẫu tôm bệnh, trong khi đó
XSV chỉ xuất hiện trong các mẫu tôm bệnh khi đ ã nhiễm MrNV [24]. Nên sự hiện
diện đồng thời của MrNV v à XSV trong bệnh trắng đuôi đ ược đặt ra giả thuyết l à
vai trò của mỗi loại virus n ày như thế nào trong việc phát triển cũng nh ư trong quá
trình phát sinh mầm bệnh? Theo Widada v à Bonami (2004) cho r ằng XSV không có
gen mã hóa cho RNA polymease. Nên có gi ả thuyết cho rằng XSV l à một satellite
virus và XSV s ử dụng enzyme RNA polymerase của MrNV nh ưng XSV sẽ mã hóa
một chức năng cần thiết cho sự phát triển của MrNV hay l àm phát sinh thêm m ầm
bệnh của MrNV th ì không xác định được [36]. XSV là một kiểu virus satellite đầu
tiên được báo cáo là gây bệnh ở động vật v à được ghi nhận là một satellite –
nodavirus cộng hưởng đầu tiên [36].
2.3.4. Sự lây nhiễm
Virus MrNV và XSV truyền từ bố mẹ sang con, virus n ày hiện diện trong mô

Mẫu dò là một đoạn DNA thu đ ược từ RNA-1 của MrNV. Đoạn DNA đ ược
đánh dấu bằng PCR với tác nhân l à digoxygenine. M ẫu dò này được sử dụng để lai
với mẫu RNA- 1 thu được từ mẫu tôm bị nhiễm. Mỗi mẫu (1µl) là một điểm trên
màng lai. Mẫu sau khi qua các công đoạn xử lý bằng dung dịch lai v à tiên lai, mẫu
dò được thêm vào để quá trình lai xảy ra. Tiến hành rửa để loại đi mẫu d ò không lai
ra khỏi màng lai. Rồi thêm vào phản ứng kháng thể k háng DIG có gắn enzyme
Alkaline phosphatase để phát hiện các phân tử có tr ên màng lai.Các kháng thể này
15
sẽ kết hợp với DIG có trong các thể lai giữa tr ình tự đích và mẫu dò. Rửa tiếp để
loại bỏ các kháng thể tự do. Sau đó ủ với c ơ chất của enzyme để thực h iện phản ứng
màu ngay trên màng lai.
Ứng dụng: J. Sri Widada và c ộng sự (2003; 2004) đã sử dụng kỹ thuật lai
Dot-blot để phát hiện virus MrNV và XSV trên tôm càng xanh. V ới mẫu dò là một
đoạn acid nucleic từ genome của virus đ ược tạo dòng trong các vector như
tpCR2.1-TOBO.
2.4.2. Phương pháp ELISA ( A sandwich enzyme linked immunosorbent assay)
Đây là một phương pháp thử nghiệm hấp thu miễn dich nhờ enzym kết nối
với kháng thể đơn dòng và đa dòng. Đây là một trong các kỹ thuật phân tích miễn
dịch dùng để phát hiện kháng nguyên một cách đặc hiệu.
Nguyên tắc
Sử dụng kháng thể phủ lên các đĩa giếng, nếu có sự hiện diện của kháng
nguyên mục tiêu trong dung dịch mẫu thì kháng nguyên s ẽ bị giữ lại trên bề mặt
giếng bởi kháng thể. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiên nhờ kháng thể thứ
cấp có gắn enzyme alkaline phosphate . Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu vào giếng các
enzyme này sẽ xúc tác phản ứng thủy phân c ơ chất để tạo ra các sản phẩm có m àu.
Bằng cách theo dõi sự biến đổi của m àu có thể phát hiện sự hiện diện c ủa kháng
nguyên.
Kỹ thuật S-ELISA (Sandwich -ELISA) được Romestand và Bonami (2003)
sử dụng để chẩn đoán bệnh đục thân tr ên tôm càng xanh. Sử dụng kháng thể của
nodavirus, IgG (Immunoglobulin G) đ ể phát hiện protein capsid của MrNV. Các

PCR là một chuỗi phản ứng li ên tục, gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi
chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
17
Giai đoạn biến tính (Denaturation): Được tiến hành ở nhiệt độ cao 90 -
95
0
C trong thời gian 30 giây-60 giây. Các liên k ết hidro bị phá vỡ, sợi DNA xoắn
kép trở thành sợi đơn [1].
Giai đoạn bắt cặp (Annealing): khi nhiệt độ được hạ xuống thì các đoạn
mồi sẽ bắt cặp với các mạch đ ơn DNA khuôn ở các đầu 3’ theo nguy ên tắc bổ sung.
Nhiệt độ của giai đoạn n ày tùy thuộc vào Tm của các cặp mồi đ ược sử dụng, thông
thường từ 40-70
0
C trong 30 giây - 60 giây [1].
Giai đoạn tổng hợp (Elongation): Khi nhiệt độ tăng lên 70-72
0
C thì các
enzyme DNA polymerase sẽ hoạt động gắn th êm các nucleotide vào cu ối các đoạn
mồi theo nguyên tắc bổ sung với sợi DNA khuôn v à kéo dài theo chi ều 5’-3’. Thời
gian của giai đoạn này tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA cần khuyếch đại,
thường kéo dài từ 30 giây đến vài chục phút [12].
Một chu kỳ bao gồm 3 b ước như trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần
lặp lại làm tăng gấp đôi số lượng các bản sao tr ước đó, nghĩa là số lượng các bản
sao được tăng lên theo cấp số nhân [1].
2.4.4. Phương pháp mô h ọc truyền thống
Mô học là khoa học nghiên cứu sự phát triển, cách cấu tạo v à sự hoạt động
của các mô, các c ơ quan của động vật, thực vật. Từ đó mô học giúp chẩn đoán bệnh
dựa trên những biến đổi vi thể của cấu trúc tế b ào, mô, cơ quan.
Các bước làm tiêu bản mô học truyền thống ( Theo Lightner D V,1996).
 Cố định mẫu