HÀ NỘI - 2008
BỘ Y TẾ
BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ VIRUS VIÊM NÃO
NHẬT BẢN (VNNB), XÁC ĐỊNH VAI TRÒ GÂY BỆNH CỦA VIRUS VNNB
GENOTYP 1 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. PHAN THỊ NGÀ
Cơ quan chủ trì đề tài: VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG
Cấp quản lý: BỘ Y TẾ
M· sè ®Ò tµi (nÕu cã):
Thời gian thực hiện: từ tháng 8 năm 2006 đến tháng 7 năm 2008
Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 300 triệu đồng
Trong đó kinh phí sự nghiệp khoa học: 300 triệu đồng
Nguồn khác nếu có
NĂM 2008
- TS. Vũ Thị Quế Hương
- Ths. Huỳnh Thị Kim Loan
Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương
Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương
Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương
Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương
Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương
Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương
Viện Vệ Sinh D
ịch tễ Trung ương
Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương
Quân Y viện 108
Viện Vệ Sinh Dịch tễ Tây Nguyên
Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh
Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh
8. Các đề tài nhánh (đề mục) của đề tài (nếu có):
(a) Đề tài nhánh 1 (đề mục 1)
- Tên đề tài nhánh:
- Chủ nhiệm đề tài nhánh:
(b): Đề tài nhánh 2
- Tên đề tài nhánh:
- Chủ nhiệm đề tài nhánh:
9. Thời gian thực hiệ
n đề tài từ tháng 8 năm 2006 đến tháng 12 năm 2008. NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
Envelope (vỏ bao)
Kilodalton
Non-structural protein - protein không cấu trúc
Plaque forming unit (đơn vị tạo đám hoại tử = 1 virus)
Reverse Transcriptase polymerase chain reaction
(Phản ứng chuỗi sao chép ngược)
Hội chứng não cấp
Tế bào có nguồn gốc thận chuột Hamster mới đẻ
(Baby Hamster Kidney cells)
Tế bào có nguồn gốc từ thận khỉ xanh châu Phi
Viêm não Nhật Bản
MỤC LỤC
PHẦN A: Báo cáo tóm tắt
1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu
2. Bản tự đánh giá kết quả nghiên cứu của đề tài
PHẦN B: Báo cáo chi tiết
Chương 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. Tóm lược những nghiên cứu trong và ngoài nước
1.2. Giả thiết nghiên cứu của đề tài.
1.3. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài.
Chương 2. TỔNG QUAN
2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước liên quan tới đề tài.
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước liên quan đến đề
tài.
Chương 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
71
72
78
79
của một số chủng virus VNNB genotyp 1
- Minh chứng về các bài báo khoa học liên quan đến đề tài
80
82
1
PHẦN A
BÁO CÁO TÓM TẮT
1.
TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1.1. Mục đích nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu thực hiện nhằm đạt được các mục đích sau:
- Nghiên cứu dịch tễ phân tử virus VNNB ở một số vùng của Việt Nam.
- Xác định vai trò gây bệnh của virus VNNB genotyp 1 bằng kỹ thuật sinh
học phân tử và mô hình thực nghiệm trên động vật cảm thụ.
1.2. Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
Để đạt đượ
c mục đích nghiên cứu của đề tài, chúng tôi đã sử dụng kỹ
thuật phân lập virus VNNB từ muỗi, lợn, người. Kỹ thuật sinh học phân tử
thuật sinh học phân tử và thực nghiệm trên động vật cảm nhiễm.
1.4. Vật liêu và phương pháp
1.4.1. Vật liệu
Trong nghiên cứu này, sinh phẩm và trang thiết bị cần thiế
t cho
nghiên cứu được cung cấp đầy đủ. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
được thực hiện theo quy trình chuẩn thức của phòng thí nghiệm và theo
hướng dẫn của nhà sản xuất sinh phẩm.
1.4.2. Phương pháp
Phần mềm tin sinh học DNA Star-Lasegene (Madison, Wisconsin,
USA) và MEGA 4.0 (USA) được ứng dụng để nghiên cứu, đánh giá và phân
tích các đặc điểm di truyền ở mức độ phân tử các chủng virus VNNB. Trình
từ vùng gen E dài 1500 nucleotide của các chủng virus thực hiệ
n trong
nghiên cứu này và các chủng là đại diện cho các genotyp khác được lấy
trong ngân hàng gen được so sánh cặp và sắp xếp đa trình tự theo chương
trình ClustalW. Cây phát sinh loài được vẽ bằng phương pháp Neibour-
Joining (Saito&Nei 1987) với giá trị để tính phần trăm sự lặp lại (giá trị tin
3
cậy) tại mỗi nhánh phát sinh là 1000 lần. Chọn giá trị ngưỡng là 12 % khác
nhau về số nucleotide để phân chia các genotyp virus VNNB. Cây phát sinh
loài là cơ sở để xác định mối quan hệ về mặt di truyền của các chủng virus
VNNB. Tính tương đồng và không tương đồng về trình tự nucleotide của
các chủng virus VNNB được tính bằng phần mềm DNAStar-Lasegene.
Phần mềm vẽ bản đồ HealthMap 8.1 được sử dụng để xây dựng bản
đồ về sự
lưu hành các genotyp virus VNNB khác nhau ở mức độ địa giới
hành chính phân chia cấp độ tỉnh. Ngoài ra, có sử dụng các thuật toán thống
- Tham dự ba hội nghị khoa học trong nước và quốc tế.
- Đă
ng ký trình tự vùng gen E của một số chủng vi rút VNNB genotyp 1 và
genotyp 3 trên ngân hàng gen quốc tế.
- Đã áp dụng và chuẩn hoá được một số kỹ thuật sinh học phân tử như kỹ
thuật RT-PCR, kỹ thuật tinh sạch ADN, kỹ thuật giải trình tự gen trong
nghiên cứu dịch tễ phân tử của virus VNNB.
1.7. Từ kết quả nghiên cứu của đề tài có thể đưa ra kết luận sau
- Đã xây dựng được cây phát sinh loài và bản đồ
dịch tễ sự lưu hành của
virus VNNB genotyp 1 và genotyp 3 dựa trên trình tự vùng gen E của 34
chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân, muỗi, lợn, trong các năm 1988 –
2007. Xác định virus VNNB genotyp 1 lưu hành ở cả bốn miền Bắc, Trung,
Nam và Tây Nguyên ở muỗi, lợn trong các năm 2001 - 2007.
- Trong số 27 chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân trong các năm 1988
– 2007, tỷ lệ phân lập được virus VNNB genotyp 1 từ bệnh nhân chiếm tỷ lệ
rất thấp 3,7 % (1/27), phần lớn các chủ
ng phân lập từ bệnh nhân thuộc
genotyp 3, chiếm tỷ lệ rất cao 96,3 % (26/27). Xác định virus VNNB
genotyp 1 có độc lực và tính hướng thần kinh với động vật cảm thụ (chuột ổ
và chuột 11 – 13 gam). 5
2. BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
a. Tiến độ:
Đúng tiến độ
Rút ngắn thời gian nghiên cứu
Tổng số thời gian rút ngắn: 0 tháng
X X 6
d. Đánh giá việc sử dụng kinh phí
Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 300 triệu đồng.
Trong đó: Kinh phí sự nghiệp khoa học 300 triệu đồng
Kinh phí từ nguồn khác: không
Toàn bộ kinh phí đã thanh quyết toán: 299.470.000 đ
Chưa thanh quyết toán xong: 530.000 đ
Lý do (ghi rõ):
2000, hàng năm ở Việt Nam có khoảng 2000 – 3000 trường hợp viêm não
virus, trong những năm 1995, xác định khoảng 67 % trẻ em bị viêm não do
virus là do virus VNNB. Nhưng gần đây, nhờ tăng c
ường sử dụng vắc-xin
VNNB để phòng bệnh, đã góp phần làm giảm số trường hợp viêm não virus,
chỉ có khoảng dưới 1500 trường hợp viêm não virus trong những năm gần
đây và trong số này còn có khoảng 10 – 35 % trẻ em bị VNNB, cho thấy khả
năng khống chế bệnh VNNB ở Việt Nam là rất khả thi [4,22,24].
Virus VNNB có 5 genotyp, sự phân bố và lưu hành của các genotyp
virus VNNB rất khác nhau tuỳ từng vùng địa lý. Trước những năm 1990,
virus VNNB genotyp 1 lưu hành chủ yếu ở Thái Lan, Campuchia. Nhưng từ
năm 1990 đến nay, phát hiện có sự mới xuất hiện của virus VNNB genotyp
1 ở một số nước như Nhật Bản, Triều Tiên, Trung Quốc, miền Bắc Việt
Nam [1,2,32,42,63]. Tuy nhiên, phần lớn các chủng virus VNNB genotyp 1
được phân lập từ muỗi, lợn. Do vậy, virus VNNB genotyp 1 được cho là ít
có khả năng gây nhiễm cho người và chỉ thích ứng với muỗi và lợn. Chính
vì vậy, ở nhữ
ng nước lưu hành virus VNNB genotyp 1 như Thái Lan, cho
đến nay mới phân lập được 5 chủng virus VNNB genotyp 1 từ bệnh nhân
trong các năm 1979 – 1984, còn các nước khác trong khu vực châu Á, cũng
chưa có công bố nào về việc phân lập được virus VNNB genotyp 1 từ bệnh
8
nhân sau những công bố về các chủng virus VNNB genotyp 1 từ bệnh nhân
ở Thái Lan [42].
Nghiên cứu sự tiến hoá của virus VNNB trong công bố trước đây ở
Việt Nam sử dụng vùng gen PrM để phân tích các genotyp của virus VNNB,
đã xác định các chủng virus VNNB phân lập từ người bệnh, từ muỗi, từ lợn
trong những năm 1964 - 1988 thuộc genotyp 3 [23]. Nghiên cứu dịch tễ
1.2. Giả thiết nghiên cứu của đề tài:
Có sự xuất hiện của các genotyp mới của virus VNNB ở một số vùng
khác nhau ở Việt Nam.
Virus VNNB genotyp 1 có khả năng gây bệnh cho người.
1.3. Mục tiêu nghiên cứu:
- Xác định dịch tễ học phân tử virus VNNB ở một số vùng của Việt Nam.
- Xác định vai trò gây bệnh của virus VNNB genotyp 1 bằng kỹ thuật sinh
học phân tử và thực nghiệm trên động vật cảm thụ.
10
2. TỔNG QUAN
2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước liên quan đến đề tài
2.1.1. Tác nhân gây bệnh, véc-tơ, ổ chứa virus trong tự nhiên và sự lan
rộng của virus VNNB trên thế giới ở một số vùng địa lý.
2.1.1.1. Tác nhân gây bệnh
Virus VNNB, một virus Arbo do muỗi truyền gây bệnh viêm não cấp.
1
.
- Protein lõi - Nuleocapsid (C) còn gọi là V
2
.
- Protein vỏ bao - Envelop (E) còn gọi là V
3
. Có giả thiết rằng protein
vỏ bao đóng vai trò quan trọng cho sự xâm nhiễm của virus VNNB và
sự khác nhau về độc lực của virus VNNB trong tự nhiên.
Protein không cấu trúc NS (non-structural protein) gồm 7 protein ký
hiệu: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5.
- NS1 là glycoprotein rất kỵ nước.
- NS2a và NS2b kị nước.
- NS3 là protein đa chức năng giúp cho sự xâm nhiễm và nhân lên của
ARN trong tế bào nhiễm virus.
Hình 2.1. Mô hình cấu trúc gen của virus VNNB và sự phiên mã [16]
12
Đặc điểm của protein cấu trúc:
- Protein capsid (C) – protein lõi là protein hết sức cơ bản, trọng lượng
≈11kd. Protein C gấp vào trong một nhị hợp kết thành khối với mỗi
một đơn thể có chứa 4 hình xoắn alpha.
- Glycoprotein membrane (prM) – glycoprotein màng: glycoprotein
prM có trọng lượng ≈ 26 kd.
- Glycoprotein Envelope (E) – glycoprotein vỏ có trọng lượng ≈ 53 kd,
ng với các virus trong phân nhóm
virus Tây sông Nil, với các virus Dengue trong phân nhóm virus Dengue.
Bằng phản ứng ELISA (MAC-ELISA) đã chứng minh virus VNNB có tính
kháng nguyên gần với những virus thuộc phân nhóm virus Tây sông Nil, ít
có phản ứng chéo với những virus thuộc phân nhóm Dengue [1,2,8,22,27].
Do vậy, để xác định vai trò gây bệnh của các genotyp virus VNNB không
thể dựa vào chẩn đoán huyết thanh học [1].
2.1.1.2. Sự thích ứng của virus VNNB trên động vật cảm thụ và trên tế bào
Virus VNNB thích ứng với một số động vật cảm thụ như chuột ổ, chu
ột
11 – 13 gam, chuột Hamster, phôi trứng 9 – 11 ngày tuổi. Đối với một số
loài muỗi, virus VNNB thích ứng và nhân lên ở một số loài muỗi như Aedes
albopictus, Toxrhynchites. Đối với các dòng tế bào nguyên phát tế bào phôi
gà, tế bào thường trực có nguồn gốc từ động vật có vú như tế bào Vero, tế
bào BHK
21
, hoặc có nguồn gốc muỗi như tế bào C
6
/36 là những dòng tế bào
nhậy cảm với virus VNNB [25,38]. Chính vì vậy, vắc xin VNNB đã được
nghiên cứu sản xuất từ não chuột gây nhiễm virus VNNB cho mục đích
phòng bệnh. Cho đến nay, vắc-xin VNNB được nghiên cứu sản xuất từ
nhiều nguồn khác nhau như từ não chuột, từ tế bào thường trực Vero
nhưng vắc-xin VNNB bất hoạt sản xuất từ não chuột vẫn là vắc-xin được sử
dụng r
ộng rãi [24,57]. 14
2.1.1.3. Véc-tơ, ổ chứa virus VNNB trong tự nhiên
là khoảng thời gian thích hợp cho virus nhân lên trong cơ thể muỗi và cũng
là thời gian chỉ số mật độ muỗi cao nhất trong năm [17,24,60]. 15
2.1.1.3. Sự lan rộng và xuất hiện của genotyp mới virus VNNB ở một số
vùng địa lý trên thế giới
Bệnh viêm não do virus VNNB lan truyền rộng rãi ở Châu Á bao gồm
Nhật Bản, Trung Quốc, Triều Tiên, Philippin, vùng Viễn đông, hầu hết các
nước ở Đông Nam Châu Á và Ấn Độ, theo số liệu thống kê hàng năm ở
Châu Á có khoảng 50.000 trường hợp mắc [24,33,60].
Việc tăng cường sử dụng vắc-xin VNNB đ
ã khống chế bệnh VNNB ở
một số nước như Nhật Bản, Nam Triều Tiên. Ngược lại, tỷ lệ VNNB lại tăng
lên ở Srilanca, Nepal, Ấn Độ và Trung Quốc. Do vậy, VNNB vẫn còn là một
đề cần quan tâm ở nhiều nước trong đó có Việt Nam, vì tỷ lệ sử dụng vắc-
xin VNNB để phòng bệnh còn thấp [7,24].
Trong vài thập kỷ gần đây, bệnh VNNB đã lan rộng tới mộ
t số vùng
trước đây không có bệnh dịch này như quần đảo thuộc eo biển Torres cách
xa lục địa Australia. Có giả thiết về sự lan rộng của virus VNNB ở một số
vùng địa lý mới là do chim di cư mang virus đến, nhưng cho đến nay vẫn
chưa có công bố nào về kết quả phân lập virus từ chim di cư [14,15,20].
2.1.2. Nghiên cứu dịch tễ phân tử virus VNNB ở khu vực châu Á
Phân tích về sự phát triển, tiến hoá c
ủa virus VNNB dựa vào cấu trúc
3
3
3
3
3
3
3
1
1
1
1
1
1
3
3
3
3
3
3
5
5
4
4
1
1
1
1
1
1
1979 ở muỗi, tuy nhiên trong số 135 chủng virus VNNB được sequencing
vùng gen E để xác định genotyp, mới phát hiện được virus VNNB genotyp 1
từ muỗi và máu lợn, nhưng chưa phát hiện được virus VNNB genotyp 1 từ
bệnh nhân [62].
Mặc dù có sự xuất hiện của các genotyp mới ở một số vùng địa lý
trong những năm gần đây, tuy nhiên chưa có bằng chứng khoa học để gi
ải
thích cho sự mới xuất hiện genotyp mới này. Nghiên cứu dịch tễ học phân tử
của virus VNNB thường dựa vào kết quả phân tích trình tự các vựng gen mã
hoá cho protein cấu trúc và phi cấu trúc như vùng gen E, PreM hoặc NS5
[52,53]. Xác định virus VNNB genotyp 1 chủ yếu mới xuất hiện ở vùng Bắc
Á và đông Nam châu Á, chưa thấy có sự xuất hiện virus VNNB genotyp 1 ở
các nước vùng Nam Á như Ấn Độ, Malaysia [45,50].
18
Nghiên cứu sinh học phân tử virus VNNB được nhiều nhà khoa học
trên thế giới quan tâm nghiên cứu trong nhiều thập kỷ qua đã làm phong phú
số lượng các vùng gen của virus VNNB đã được giải mã và đăng ký trong
ngân hàng gen. Hơn thế nữa, nghiên cứu giải mã toàn bộ gen của một chủng
virus VNNB cũng đã được nhiều nhóm nghiên cứu thực hiện, đăng ký trong
ngân hàng gen. Tuy nhiên, kết quả giải mã toàn bộ vật liệu di truyền của các
chủng virus VNNB phân l
ập từ người đã công bố trong ngân hàng gen chủ
yếu là các chủng virus VNNB genotyp 3 như chủng Nakayama, Beijing -1
Cho đến nay, chưa có công bố nào trong ngân hàng gen về kết quả giải mã
gen đối với virus VNNB genotyp 1 phân lập từ bệnh nhân [12,37,39].
2.1.3. Sự phát triển và ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên
cứu trên thế giới
giai đoạn PCR. Mỗi một giai đoạn sử dụng một ống nghiệm riêng biệt với
những thành phần cần thiết và chu trình nhi
ệt riêng, được gọi là kỹ thuật RT-
PCR gián tiếp. Ưu điểm của kỹ thuật này có độ nhạy cao hơn kỹ thuật RT-
PCR trực tiếp. Tuy nhiên, khả năng dương tính giả cao hơn kỹ thuật RT-
PCR trực tiếp do dễ bị nhiễm. Do vậy, kỹ thuật RT-PCR trực tiếp có hiệu
quả hơn so với kỹ thuật RT-PCR gián tiếp, vì nó sẽ làm giảm tối đa khả
n
ăng tạp nhiễm hoặc kết quả đương tính giả. Để thực hiện kỹ thuật, tất cả
các thành phần cần thiết cho cả hai quá trình sao chép ngược và PCR được
cho vào một ống nghiệm, thực hiện trong một lần duy nhất, chu trình nhiệt
không bị ngắt quãng. Một trong hai đoạn mồi sử dụng cho quá trình sao
chép ngược được sử dụng cho PCR [28,56].
Sản phẩm khuếch đại của phả
n ứng PT-PCR được khẳng định và kiểm
tra bằng phương pháp chạy điện di trên gel. Cho đến nay có nhiều loại thuốc
nhuộm đã được nghiên cứu để ứng dụng cho việc phát hiện sản phẩm PCR
như Ethidium bromide, SYBR Green, FABIO , nhưng Ethidium bromide
Copyright: Tài liệu đại học ©