2.3. Nhân gene và kỹ thuật giải
trình tự ADN.

Sau đây là những nét chung
nhất của kỹ thuật PCR:
Nguyên tắc cơ bản của PCR:
+ Khái quát chung:
PCR là phương pháp dùng
enzym khuyếch đại chọn lọc một
đoạn ADN theo luật số mũ. Phản
ứng nhân gene được thực hiện với
enzym ADN chịu nhiệt, hai mồi
tổng hợp và 4 loại
deoxyribonucleic (dATP, dGTP,
dCTP và dTTP). Mỗi một chu kỳ
phản ứng nhân gene gồm 3 bước
(xem hình vẽ minh hoạ): Bước 1 là
biến tính ADN, có tác dụng tách
hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép.
Bước 2 là bắt cặp hai mồi vào hai
sợi đơn của khuôn. Bước 3 là kéo
dài chuỗi theo mồi, chiều 5’-3’ với
quá trình trùng hợp gắn các dNTP
dọc theo sợi khuôn để tạo thành
phiên bản mới theo nguyên tắc bổ

từ E.coli. Tuy nhiên, enzym này bị
biến tính tại 94
o
C và như vậy cần
phải bổ sung enzym mới sau mỗi
chu kỳ phản ứng. Đến nay quá trình
này đã được cải thiện do dùng
enzym Taq ADN
polymerase (Taq = Thermus
aquaticus ) chịu nhiệt. Enzym này
được tách ra từ vi khuẩn sống ở
suối nước nóng. Tốc độ xúc tác cho
phản ứng của enzym này rất nhanh,
có thể đạt khoảng 8000 bp/phút tại
755
o
C. Hoạt tính enzym giảm một
nửa khi xử lý tại 92.5
o
C trong 230
phút hoặc 40 phút tại 95
o
C. Như
vậy khi dùng enzym này thì không
cần bổ sung enzym mới sau mỗi
chu kỳ phản ứng.

+ Các thông số kỹ thuật:

Bất kỳ một phản ứng PCR nào

PCR.

Thành
phần
Số lượng
ADN khuôn

10-100 ng
dNTP (mỗi
loại)
200 mM
Mồi xuôi 0.1 – 1.0
mM
Mồi ngược 0.1 – 1.0
mM
Taq
polymerase
1 U
KCL 50 mM
Tris HCL
(pH 8.4) tại
25
o
C
10 mM
MgCl
2
2.85 mM
Gelatin 100 mg/l
Nonidet-40 0.05%

Việc ứng dụng kỹ thuật RFLP
với sản phẩm PCR có thể là cách
nhanh chóng để tìm sự khác biệt
đối với các gene khác nhau. Với
cách này yêu cầu sản phẩm PCR
phải sạch và đồng nhất. Theo cách
này trình tự có thể được thực hiện
như sau: Sau khi điện di kiểm tra
độ sạch của sản phẩm PCR, tiến
hành kết tủa với ethanol. Kết tủa
được hoà với đệm thích hợp và sau
đó được xử lý với enzym cắt hạn
chế thích hợp. Kiểm tra kết quả
thông thường trên gel agarose,
trong một số trường hợp có thể trên
gel polyacylamid để thu được độ
phân giải cao hơn. Chú ý rằng
thông thường hoạt tính enzym giảm
5% sau mỗi chu kỳ nhiệt. Như vậy
có thể ước lượng 50% hiệu quả
khuyếch đại mất đi trong toàn bộ
quá trình phản ứng.
+ Một số khó khăn với phản
ứng PCR:

PCR là kỹ thuật có ý nghĩa lớn
trong nghiên cứu sinh học phân tử
nhưng cũng nảy sinh một số vấn đề
cần chú ý đặc biệt khi phát hiện
một số bệnh virus hay vi khuẩn.

ngoài gene và sản phẩm của nó lại
làm khuôn cho phản ứng sau cho
đoạn nằm trong gene. Như vậy
phản ứng sau cần 1 hay 2 mồi để
nhân phần gene nằm trong sản
phẩm PCR từ hai mồi phía ngoài
tạo ra. Vai trò kỹ thuật này làm
tăng độ nhạy và đặc hiệu của phản
ứng PCR.
Phản ứng PCR phiên mã
ngược được dùng để nhân ADN từ
ARN của virus. Việc kết hợp phản
ứng này với PCR lồng có tác dụng
phát hiện ARN tại thời điểm nhất
định của mẫu.
Kỹ thuật PCR một chiều được
ứng dụng trong phương pháp giải
trình tự ADN trực tiếp từ sản phẩm
PCR.phẩm PCR.
+ Sử dụng kỹ thuật PCR cho
xác định typ vi sinh vật:
Như đã trình bày ở trên, dùng
cặp mồi đặc hiệu có thể xác định
được gene đặc trưng cho loài hay
thậm chí một chủng vi sinh vật nào
đó. Các chiến lược ứng dụng lợi thế
của kỹ thuật PCR dùng trong xác
định typ vi sinh vật trong nghiên
cứu dịch tễ học được chia làm 4
nhóm sau:

al (1992)
Clostridium spp. Gurtler et al.
(1991)
Helicobacter
pylori
Foxall et al.
(1992)
Hepatilis C virus

Okamoto et
al.(1992)
Mycobacterium
tuberculosis
Ross
&Dwyer(1993
)
Nitrobacter spp. Navarro et
al.(1992)
Rickettsia spp. Regnery et al.
(1991)
Streptococcus sp
p.
McClellADN
et al. (1992)

+ Dùng kỹ thuật PCR cho
ribotyping:
Kỹ thuật PCR ribotyping là
ứng dụng các cặp mồi đặc hiệu để
nhân các vùng gene của ARN

Bảng 1.10 Một số ví dụ sử dụng
kỹ thuật PCR cho ribotyping.
Vi sinh vật Tác giả và tài
liệu dẫn
Vi khuẩn
lactic
Klijin
etal.(1991)
Listeria Czajka et
al.(1993)
Mycoplasma
Van Kuppeveld
et al.(1992)
Pseudomonas
cepacia
Kostman et
al.(1992)
Pseudomonas
solanacearum

Seal et
al.(1992b)
Staphylococc
us spp.
Welsh
&McClellADN
(1992)
Streptococcus McClellADN(1
spp. 992)


dò bảo thủ có thể lai với cả hai
đoạn ADN lặp lại: đoạn có kích
thước 126bp (Enterobacterial
repetitive intergeneic concensus-
ERIC) và đoạn 38bp (repetitive
extrageneic palindromic-REP) từ
bộ gene của Enterobacteriaceae vi
khuẩn gram âm và một số chủng có
quan hệ xa khác. Có thể trực tiếp
thiết kế cặp mồi cho các đoạn gene
bảo thủ để thu được kết quả finger
printing sau khi nhân gene dùng bộ
gene của các vi sinh vật có mang
các đoạn gene bảo thủ này. Sau khi
điện di có thể phát hiện được trên
agarose các đoạn gene có kích
thước khác nhau từ các nguồn vi
sinh vật khác nhau. Kỹ thuật này
được ứng dụng đã đem lại kết quả
tốt khi nghiên cứu mối quan hệ trên
các đối tượng Bacillus
subtilis (Versalovic và cộng sự,
1992), Citrobacterdiversus (Woods
và cộng sự,
1991), Rhizobium meliloti (Brujin,
1992). Thực tế phương pháp tạo ra
kết quả finger printing đa dạng từ
hầu hết các đại diện
củaEnterobacteriaceae (Versalovic
và cộng sự, 1991) và được ứng