MỤC LỤC
Bài 1. Phương pháp pha chế mơi trường ni cấy mơ thực vật
Bài 2. Phương pháp khử trùng mơ thực vật
Bài 3. Khử trùng ni cấy chồi ngủ cúc và hạt cam
Bài 4. Vi nhân giống dứa bằng ni cấy chồi ngủ
Bài 5. Phương pháp ni cấy tạo mơ sẹo ở thực vật
Bài 6. Kỹ thuật tạo áo bao hạt giống nhân tạo
Bài 7. Phương pháp tách và ni cấy đỉnh sinh trưởng
Bài 8. Phương pháp vi ghép ở thực vật
Bài 9. Phương pháp thuần hố cây ra vườn ươm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
42
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 1
BÀI I
PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MƠI TRƯỜNG
NI CẤY MƠ THỰC VẬT
1 - NGUN TẮC
1.1 - Ngun tắc pha chế mơi trường
Mơi trường ni cấy mơ thực vật khác với các loại mơi trường ni cấy vi sinh là
có thành phần rất phức tạp, sự hiện diện của rất nhiều loại hố chất với hàm lượng rất
nhỏ. Do vậy, để thuận tiện cho việc pha các mơi trường ni cấy (mơi trường làm việc),
người ta khơng cân hố chất mỗi lần pha mơi trường mà chuẩn bị trước dưới dạng nhiều
loại dung dịch với độ đậm đặc từ X10 – X100, chỉ cần pha với nước cất hai lần hay nước
vơ khống khi sử dụng. Các dung dịch này gọi là dung dịch mẹ (stock). Dung dịch mẹ
được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu. Thơng thường pha các
dung dịch mẹ: stock đa lượng, stock vi lượng, Fe – EDTA, stock vitamin, stock chất sinh
trưởng, và các stock cần thiết khác.
1.2 - Phân loại mơi trường ni cấy mơ thực vật
Tùy theo thành phần các chất có trong mơi trường, có thể phân thành 3 loại mơi
trường:
- Mơi trường nghèo chất dinh dưỡng: như mơi trường White, Knop. Mơi trường này

- CaCl
2
.5H
2
O
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 2
- KI
- Na
2
MoO
4
.2H
2
O
- CoCl
2
.6H
2
O
- H
3
PO
3
- MnSO
4
.4H
2
O
- ZnSO
4

Ghi chỳ
1 - Bỡnh nh mc: 100 ml cỏi 10
2 - Bỡnh nh mc: 500 ml cỏi 3
3 - ng ong: 100 ml cỏi 12
4 - ng ong 500 ml cỏi 3
5 - a khuy cỏi 15
6 - Bỡnh mu 200 ml cỏi 5
7 - Qu búp cao su cỏi 15
8 - B n nhit cỏi 1 Dựng pha Fe-EDTA
9 - Cc 100 ml cỏi 30
10 - Cc 200 ml cỏi 15
11 - Pipett: 1 ml cỏi 15
12 - Pipett: 5 ml cỏi 15
13 - Pipett: 10 ml cỏi 15
14 - Bỡnh nh mc 250 ml cỏi 15
15 - ng nghim ị 25 ng 100
16 - Bụng m g 200
17 - Bỡnh mu: 1000 ml cỏi 2 Bo qun cỏc stock
THệẽC HAỉNH NUOI CAY MO THệẽC VAT Trang 3
3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH
Học sinh chia nhóm thực hành pha chế các dung dịch mẹ (stock) của mơi trường
MS (Murashige – Skoog) như sau: dung dịch mẹ khống đa lượng (Skoog I), dung dịch
mẹ Fe – EDTA (Skoog II), dung dịch mẹ khống vi lượng (Skoog III), dung dịch mẹ chất
điều hồ sinh trưởng
4 - THỰC HÀNH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH MẸ (Stock) MƠI TRƯỜNG MS
(Murashige – Skoog)
4.1. Pha stock khống đa lượng mơi trường MS nồng độ đậm đặc 20 lần (x20)
Cân chính xác bằng cân phân tích các muối khống đa lượng. Dùng ống đong, đong
khoảng 400 ml nước cất hai lần vào becher 1000 ml. Cho lần lượt các muối đa lượng vào
theo trình tự nhất định sau:

tích tăng dần). Do CaCl
2
.2H
2
O có thể phản ứng tạo kết tủa với MgSO
4
.7H
2
O nên hai chất
này phải pha tách rời nhau theo đúng trình tự ở trên, cho CaCl
2
.2H
2
O vào sau cùng.
Cho tất cả vào bình định, dùng nước cất hai lần chuẩn lại cho đúng 1000
ml. Như vậy ta có 1000 ml dung dịch mẹ khống đa lượng đậm đặc 20 lần. Dung dịch
này được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10
oC
, dùng 50 ml cho một
1000 ml mơi trường ni cấy.
4.2. Pha stock khống vi lượng nồng độ đậm đặc 1000 lần (x1000)
Do hàm lượng một số loại khống vi lượng trong stock khống vi lượng rất
nhỏ, khó có thể cân đong chính xác như một số các khống vi lượng khác. Vì vậy ở đây,
ta phải tiến hành pha riêng dung dịch các khống này (CuSO
4
.5H
2
O, CoCl
2
.6H

Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,25 250
KI 0,83 830
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 4
CuSO
4
.5H
2
O 0,025 25 2500
CoCl
2
.6H
2
O 0,025 25 2500
4.3. Pha dung dịch mẹ Fe-EDTA nồng độ đậm đặc 200 lần (x200)
Sắt là yếu tố rất cần thiết cho thực vật. Tuy nhiên, nhu cầu của thực vật đối
với sắt rất nhỏ và lượng liên tục. Vì vậy, để cung cấp đủ lượng sắt cho thực vật ta thường
dùng sắt dưới dạng hợp chất Fe-DETA. Hợp chất Fe-EDTA được hình thành do sự ngậm
Fe của EDTA dưới tác dụng của nhiệt độ. Ở dưới dạng hợp chất này, sắt sẽ được phóng
thích ra mơi trường tuỳ theo nhu cầu của thực vật. Phương pháp pha như sau:
Tên hố chất
Nồng độ mơi trường
ni cấy (mg/lít)
Nồng độ dung dịch stock
(x200) (mg/lít)

oC
, dùng 5ml cho một 1000 ml mơi
trường ni cấy.
4.4. Pha stock hormon
Các hormon khác nhau sẽ tan trong các dung mơi khác nhau. IAA, NAA,
BA pha trong NaOH 1N (thêm 2-3 ml NaOH 1N và lắc cho đến khi tan hết, sau đó thêm
nước đến thể tích cần). GA
3
,

2,4-D pha trong cồn 50
o
cho đủ thể tích.
Để pha các chất sinh trưởng, có hai cách khác nhau:
+ Cách 1: pha theo hệ mol
Ví dụ: Pha 100 ml dung dịch stock IAA (M=176,19) có nồng độ 1 mmol
(milimol) từ IAA tinh khiết.
176,19 g IAA pha trong 1000 ml nước →1000 ml dung dịch có nồng độ 1
mol/lít. Để pha dung dịch có nồng độ 1 mmol/lít cần 0,17619 g IAA. Như vậy, muốn có
100 ml dung dịch IAA nồng độ 1 mmol/lít cần 0,017619 g IAA. (MNAA: 186,2; M
2,4-D
:
221,04; MBA: 225,2)
+ Cách 2: pha theo hệ mg/lít: làm tương tự như cách pha khống.
Các dung dịch stock hormon sau khi pha song được bảo quản trong các
chai màu ở nhiệt độ lạnh 4-10
oC
.
4.5. Pha stock vitamin mơi trường MS nồng độ đậm đặc 500 lần (x500)
Dùng ống đong, đong 50 ml nước cất hai lần vào một becher 100 ml. Bổ

- Đun sơi cho tan agar, quấy đều. Chia hỗn hợp mơi trường vào các bình ni
cấy, cần chia xong trước khi dung dịch mơi trường MS nguội xuống 50
oC
. Hấp khử trùng
(đối với các thành phần bị biến tính ở nhiệt độ cao sẽ được lọc vơ trùng và bổ sung vào
mơi trường sau khi hấp). Mơi trường sau khi hấp được bảo quản ở 25
oC
.
5 - BÁO CÁO THỰC HÀNH
1. Trình bày cách pha Skoog I, Skoog II và Skoog III.
2. Quan sát hiện tượng phản ứng khi pha stock Fe-EDTA. Giải thích.
3. Từ BA tinh khiết, trình bày cách pha 100 ml stock BA có nồng độ 100 mol/lít.
Biết MBA =225,2.
4. Cần bao nhiêu ml dung dịch stock IAA có nồng độ 150 µmol/lít để pha mơi
trường làm việc có nồng độ IAA là 0,1 µmol/lít.
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 6
BÀI 2
PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG MƠ THỰC VẬT
1 - NGUN TẮC
Một thí nghiệm ni cấy mơ thực vật khác với một thí nghiệm ni cấy vi sinh
thường tiến hành trong một thời gian rất lâu dài. Với một thí nghiệm trường diễn như thế,
chỉ cần một tế bào vi khuẩn, một bào tử nấm mốc rơi vào mơi trường ni cấy, sau một
thời gian ngắn sẽ sinh sơi làm hỏng mơi trường, làm hỏng thí nghiệm và phải tiến hành
làm lại từ đầu. Do đó việc vơ trùng tức loại bỏ hết nấm khuẩn trong ni cấy mơ thực vật
vơ cùng quan trọng.
Mơ cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phơi,
nỗn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ… tùy theo sự tiếp xúc với mơi trường bên ngồi, các bộ
phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm. Để chuyển mơ thực vật từ mơi trường tự
nhiên vào mơi trường ni cấy in vitro, mơ thực vật phải trải qua giai đoạn khử trùng để
loại bỏ hết các mầm vi sinh vật. Tuy nhiên q trình này phải đảm bảo là mơ thực vật còn

- Nồng độ chất khử trùng
- Thời gian khử trùng.
Vơ trùng mẫu là một thao tác khó, ít khi thành cơng ngay lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu
kiên trì tìm nồng độ và thời gian vơ trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt
kết quả.
2 - VẬT LIỆU - HỐ CHẤT – DỤNG CỤ
2.1 - Vật liệu
- Cây Trầu bà
- Hạt thuốc lá
2.2 - Hố chất
- Xà phòng bột
- Cồn 70
o
, 90
o
- Javel
- Ca(OCl)
2
(Caxi hypoclorid)
2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành
STT Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
1 - Dao mổ cái 15
2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn
3 - Ống đong: 100 ml cái 12
4 - Ống đong 500 ml cái 3

nước máy cho sạch bụi đất.
- Cắt thành những đoạn Trầu bà này thành những đốt khoảng 3cm, mỗi đốt mang
một chồi ngủ. Cắt bỏ lá, rễ.
- Rửa các đốt với nước có pha một ít xà phòng trong các erlen.
- Rửa lại bằng nước máy nhiều lần cho sạch xà phòng.
b. Thực hiện trong tủ cấy
- Lắc các đốt thân với cồn 70
o
trong 1 phút
- Chiết bỏ cồn. Ngâm các mẫu trong dung dịch Caxi hypoclorid 10% trong 10 phút
(hay dung dịch javel được pha lỗng với tỷ lệ 1:9 trong 5 phút).
- Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vơ trùng 5-6 lần
- Gạn bỏ nước.
4.2 - Khử trùng hạt thuốc lá
- Thực hiện trong phòng thí nghiệm, rửa hạt thuốc lá dưới vòi nước máy.
- Lắc hạt với nước có pha một ít xà phòng.
- Rửa lại nhiều lần bằng nước máy cho sạch xà phòng
- Thực hiện trong tủ cấy, lắc hạt với cồn 70
o
trong 1 phút.
- Chiết bỏ cồn, ngâm hạt trong dung dịch Caxi hypoclorid 10% trong 5 phút.
- Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vơ trùng 5-6 lần.
- Gạn bỏ nước.
4.3 - Cách cấy mẫu
a. Mẫu cây Trầu bà
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 9
- Trong tủ cấy vơ trùng, những đốt cây Trầu bà đã khử trùng, được đặt trên giấy cấy
vơ trùng. Dùng dao mổ và kẹp tách các lá.
- Ở mỗi nách lá có mang một mầm ngủ. Dùng dao mổ cắt một đoạn mẫu có kích
thước khoảng 1x1 cm cấy vào mơi trường MS đã hấp khử trùng trong các ống nghiệm.

Với những lồi thực vật có đỉnh sinh trưởng nhỏ (đỉnh sinh trưởng dấu hoa thị) thì
việc tách lấy đỉnh sinh trưởng rất khó thực hiện. Vì vậy, với những loại thực vật này,
phương pháp nhân giống vơ tính hiệu quả nhất là ni cấy chồi nách. Chồi nách đem
ni cấy thường gắn liền với một đoạn thân, do đó sức sống của chồi nách thường tốt hơn
rất nhiều lần so với đỉnh sinh trưởng tách rời, hiệu quả tạo cụm chồi cũng thường tốt hơn
so với phương pháp ni cấy đỉnh sinh trưởng
Việc tách chồi nách thường thực hiện với những đoạn nhánh có mang chồi của thực
vật. Những đoạn nhánh này được khử trùng trước khi cắt nhỏ thành những đoạn có mang
chồi nách. Bên cạnh đó, việc tách chồi nách cũng có thể thực hiện từ những cây vơ trùng
trong ống nghiệm được tạo ra do việc ni cấy hạt giống.
Trong bài thực hành này, sẽ đề cập tới phương pháp nhân giống vơ tính thực vật qua
ni cấy chồi nách và tạo nguồn cây cho phương pháp ni cấy chồi nách từ hạt giống.
2- VẬT LIỆU –HỐ CHẤT – DỤNG CỤ
2.1 - Vật liệu
- Cây hoa cúc
- Hạt cam
2.2 - Hố chất
- Cồn 70
o
, 90
o
- Mơi trường MS bổ sung 2,4 – D
- Xà phòng bột
- Cồn 70
o
, 90
o
- Javel
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 11
- NAA

3 - NI DUNG THC HNH
- Sinh viờn tin hnh ct t thõn cỳc, thc hin xỏc nh cụng thc kh trựng. Nuụi
cy thõn cỳc trờn mụi trng MS b sung.
- Sinh viờn tin hnh kh trựng, tỏch v v nuụi cy ht cam trờn mụi trng MS.
4 - THC HNH
4.1 - Kh trựng v nuụi cy thõn cỳc ct t
a. Kh trựng
THệẽC HAỉNH NUOI CAY MO THệẽC VAT Trang 12
- Lựa cây cúc còn tươi, non, lá ít bị dập. Dùng dao cắt bỏ hoa và gốc. Cắt lấy một
đoạn cách gốc 10÷15 cm.
- Rửa sạch đoạn thân cúc dưới vòi nước máy.
- Cắt thành những đoạn nhỏ. Cắt ở giữa hai chồi ngủ. Mỗi đoạn có một chồi ngủ.
- Lắc các đoạn trong nước xà phòng từ 10÷15 phút.
- Rửa sạch xà phòng dưới vòi nước máy.
- Lắc với cồn 70
o
trong 1 phút.
- Lắc với dung dịch javel/nước ở các tỷ lệ 1/9, 2/8, 3/7, 4/6, 1/1.
- Rửa sạch javel bằng nước cất vơ trùng 5÷6 lần.
b. Ni cấy
- Thân cúc sau khi khử trùng được ni cấy trên mơi trường MS bổ sung BA và
NAA với tỷ lệ NAA/BA <1.
- Cắm thân cúc vào mơi trường sao cho chồi ngủ vẫn nằm trên bề mặt mơi trường .
4.2 - Khử trùng và ni cấy hạt cam
a. Khử trùng hạt
- Rửa hạt cam dưới vòi nước máy.
- Lắc hạt với nước xà phòng 10÷15 phút.
- Rửa sạch xà phòng bằng nước máy.
- Lắc với cồn 70
o

của phương pháp này là tốc độ nhân giống cao, hệ số nhân giống lớn.
Đặc điểm của phương pháp này là chồi ngủ được tách từ cụm chồi ngủ ở ngọn dứa,
sau đó được ni cấy tạo cụm chồi trên mơi trường in vitro. Các chồi có hình dạng giống
như vảy cá hoặc hạt gạo nằm ép sát vào thân (lõi), có màu trắng. Mỗi chồi được tách
riêng để ni cấy để tạo thành cụm chồi.
2 - VẬT LIỆU – HỐ CHẤT – DỤNG CỤ
2.1 - Vật liệu
Chồi ngủ được tách từ ngọn dứa dùng làm vật liệu ni cấy.
2.2 - Hố chất
- Cồn 70
o
, 90
o
- Mơi trường MS bổ sung NAA, BA
- Javel
- Xà phòng bột
2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành
STT Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
1 - Dao mổ cái 15
2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn
3 - Ống đong: 100 ml cái 12
4 - Ống đong 500 ml cái 3
5 - Đũa khuấy cái 15
6 - Cốc 500 ml cái 15
7 - Quả bóp cao su cái 15

- Rửa nhẹ nhàng cùi dứa dưới vòi nước máy, tránh làm tổ thương các chồi ngủ.
- Dùng dao cắt lấy bốn mặt của cùi dứa có mang chồi ngủ.
- Lắc nhẹ nhàng các mảnh có mang chồi ngủ này trong nước xà phòng trong 10
phút.
- Rửa sạch nước xà phòng dưới vòi nước máy.
- Lắc các mảnh mơ dứa trong cồn 70
0
trong 2 phút.
- Khử trùng với nước javel (tỷ lệ 3:7) trong 7 phút.
- Rửa sạch lại bằng nước cất vơ trùng 5÷6 lần.
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 15
Hình 1. Cắt các mặt có mang chồi ngủ từ cùi dứa
4.2 - Phương pháp ni cấy
- Dùng dao mổ cắt những đường dọc, ngang tách rời từng chồi ngủ muốn lấy.
- Cắt vát 4 cạnh dưới của miếng mơ dứa có mang chồi ngủ tạo thành hình tháp.
- Cắm phần đầu hình tháp ngập vào mơi trường ni cấy.
- Đặt các bình ni cấy trong điều kiện ánh sáng 3000 lux, ở nhiệt độ 25
oC
.
4.3 - Phương pháp tạo cụm chồi
Sau thời gian ni cấy từ 20-30 ngày các chồi được cấy chuyền sang mơi trường
ni cấy để tạo cụm chồi. Mơi trường ni cấy có nồng độ chất điều hồ sinh trưởng
NAA 1mg/lít, BA 0,1mg/lít. Sau 30-40 ngày, các chồi nhỏ xuất hiện ở phía gốc chồi. Số
lượng các chồi nhỏ tăng dần lên, sắp xếp chồng chất lên nhau thành một cụm chồi
(thường là sau 3-4 tháng ni cấy). Các chồi nhỏ được tách và chuyển sang mơi trường
tái sinh cây hồn chỉnh. Điều kiện ni cấy để tạo cụm chồi dứa: cường độ ánh sáng
4000 lux, thời gian chiếu sáng 10-14 giờ/ngày, nhiệt độ 25-27
0
C.
Hình 2. Cách cắt rời chồi ngủ dứa

mơ sẹo ở thực vật xảy ra khi mơi trường ni cấy được bổ sung một lượng auxin (2,4-D)
thích hợp.
Sự tạo mơ sẹo do tác dụng của auxin do 3 q trình:
- Sự phản phân hố của tế bào nhu mơ: xảy ra ở các tế bào nhu mơ mộc và libe, nhu
mơ vỏ hay lõi.
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 17
- Sự phân chia của các tế bào tượng tầng: các tế bào bào tượng tầng của phần lớn
cây hai lá mầm dễ dàng phân chia dưới tác động của auxin.
- Sự xáo trộn của các mơ phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ).
2 - VẬT LIỆU – HỐ CHẤT – DỤNG CỤ
2.1 - Vật liệu
Hạt thuốc lá (Nicotiana tabacum) được gieo trên mơi trường MS. Sử dụng các cây
con làm vật liệu thí nghiệm.
2.2 - Hố chất
- Cồn 70
o
, 90
o
- Mơi trường MS bổ sung 2,4 - D
2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành
STT Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
1 - Dao mổ cái 15
2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn
3 - Ống đong: 100 ml cái 12
4 - Ống đong 500 ml cái 3

C cho nảy mầm.
- Cây con được ni cấy trong điều kiện có ánh sáng.
- Sau 15-20 ngày ni cấy, khi cây có từ 6-8 lá, cao khoảng 10-15cm, có thể sử
dụng là ngun liệu cho ni cấy mơ sẹo
b. Mơ cấy từ cây thuốc lá mọc ngồi tự nhiên
Cây thuốc lá mọc ngồi tự nhiên có sức tăng trưởng mạnh, khả năng hình thành mơ
sẹo rất lớn. Những mơ đặt cấy lấy từ cây thuốc lá mọc ngồi tự nhiên phải trải qua giai
đoạn vơ trùng mẫu để loại bỏ hết nấm, khuẩn tồn tại trong và trên mẫu cấy.
4.2 - Chuẩn bị mẫu cấy
a. Cắt đốt thân
- Dùng kẹp gắp một cây thuốc lá trong bình ni cấy đặt lên giấy cấy.
- Dùng dao mổ cắt rời tất cả lá, rễ ra khỏi thân.
- Cắt thân thuốc lá thành những đoạn nhỏ, mỗi đoạn là một đốt thân. Từ các đốt này,
tiếp tục chia nhỏ thành các đoạn, mỗi đoạn có kích thước khoảng 0,2 – 0,4 cm. Các đoạn
nhỏ này được ni cấy tạo mơ sẹo.
- Điều lưu ý khi cắt các đoạn thân là phải bỏ tất cả các phần mắt của đốt. Các phần
này khơng có khả năng tạo sẹo, chỉ có thể được sử dụng để ni cấy tạo chồi.
b. Cắt mảnh lá
- Từ các lá ở phần trên, sử dụng dao mổ cắt bỏ gân chính và rìa lá.
- Các phần lá này được cắt thành các mảnh nhỏ có kích thước 0,2 x 1 cm.
- Các mảnh lá này được ni cấy tạo mơ sẹo.
c. Cắt đoạn rễ
- Sau khi cắt các đoạn thân, lá, phần rễ còn lại được rửa sạch agar trong nước cất vơ
trùng.
- Dùng dao cắt rễ thành các đoạn nhỏ có kích thước 0,2 - 0,4 cm. Các đoạn này được
ni cấy tạo mơ sẹo.
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 19
Hỡnh 4. Phng phỏp ct mnh lỏ (A), t thõn (B), on r (C)
4.3 - Nuụi cy to mụ so
a. Nuụi cy thõn, lỏ

nhũ, vỏ và phơi ở hạt nhân tạo là phơi vơ tính (phơi soma) (hình 1). Hạt giống nhân tạo
gồm 3 phần (hình 2):
- Phơi vơ tính
- Vỏ bọc polymer như alginat
- Màng ngồi: được cấu tạo từ alginat canxi
Phơi soma ở hạt nhân tạo giống như phơi hợp tử ở hạt tự nhiên là có hai cực (đỉnh
chồi và đỉnh rễ), như thế có thể phát triển thành một cây hồn chỉnh tương tự như hạt nảy
mầm. Cấu trúc phơi soma giống như phơi hợp tử nhưng phơi soma của hạt giống nhân
tạo khơng có vỏ bao hạt cũng như mơ dự trữ.
Hình 5 - So sánh cấu trúc hạt tự nhiên và hạt nhân tạo
THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trang 21
Hình 6 - Cấu tạo hạt nhân tạo
Hạt nhân tạo thườmg có vỏ làm bằng alginat Na và alginat Ca hay B-hydrogel.
Alginat Na là một chất cao phân tử được chiết suất từ rong biển (rong Mơ
Sargassum sp là một loại rong nâu). Trong rong Mơ alginat Na tồn tại dưới dạng alginit
khơng tan là hợp chất của các axid manuronic. Để chiết tách alginat , thường tiến hành
nấu rong với Na
2
CO
3
.
[(C
5
H
7
O
4
COO)
2
Ca]

[(C
5
H
7
O
4
COO)
2
Ca]
n
+ 2nNaCl
Alginat Na Alginat Ca
Ở dạng này, alginat Ca kết tủa, trở thành dạng khơng tan, tạo thành màng khơng thấm
nước. Tồn bộ bề mặt của gịot hỗn hợp trên sẽ được bao bọc bằng một lớp áo alginat Ca
khơng thấm nước và tạo thành một hạt. Phần alginat Na bên trong vẫn ở trạng thái tan.
Vỏ hạt nhân tạo được tạo ra theo ngun tắc này.
Hạt nhân tạo có thể bảo quản, tồn trữ và trồng trọt bằng những kỹ thuật canh tác
truyền thống. Và đặc biệt là có thể chủ động trong sản xuất, trồng trọt, canh tác khơng
phụ thuộc vào các điều kiện thời tiết, mùa vụ.
Trong bài thực hành này, chúng ta sẽ tìm hiểu kỹ thuật tạo áo bao cho phơi vơ tính
để cấu thành một hạt giống nhân tạo hồn chỉnh.
2 - NGUN LIỆU - HỐ CHẤT – DỤNG CỤ
2.1 - Ngun liệu, hố chất
STT Tên hố chất, phụ liệu
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
1 Alginat Na 4% ml 100

Ghi chú
1 Bình chiết 500ml cái 2 Tạo giọt nhỏ
2 Pipette 10 ml cái 2 Hút và chuyển phơi
3 Kẹp gắp 25cm cái 2 Gắp hạt
4 Phễu lớn cái 2
5 Erlen 500ml cái 2
6 Erlen 250 cái 2
7 Quả bóp cao su cái 2
8 Đồng hồ cá nhân cái 2
9 Đĩa petri cái 2
10 Cốc 1000 ml cái 2
11 Cốc 250ml cái 2
3. NỘI DUNG THỰC HÀNH
- Học sinh tiến hành nhỏ giọt và chuyển phơi tạo hạt
- Học sinh thực hiện ngâm hạt trong dung dịch CaCl
2
và nước để tạo hạt hồn chỉnh
4 – THỰC HÀNH
4.1 – Tạo giọt nhỏ
- Hồ tan 100 ml Alginat Na 4% vào 1 lít mơi trường MS có chứa các mi khống,
đường, vitamin, các chất sinh trưởng. Cho hỗn hợp này vào bình chiết.
- Mở khố nhỏ giọt của bình chiết, nhỏ từng giọt nhẹ nhàng hỗn hợp này vào một
cốc dung dịch CaCl
2
2,5%. Mỗi lần nhỏ, khi giọt dung dịch vừa ló ra ở đầu ống nhỏ giọt
của bình chiết, vặn khố lại để dừng giọt dung dịch ở đầu ống nhỏ giọt
4.2 – Chuyển phơi và tạo hạt
- Dùng pipette hút một phơi trong dung dịch MS chuyển vào trong giọt nhỏ đang
dừng ở đầu bình chiết.
- Mở khố bình chiết để giọt có chứa phơi nhỏ vào trong erlen đựng CaCl

Ngâm nước và thu hạt nhân tạo
BÀI 7
PHƯƠNG PHÁP TÁCH VÀ NI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG
1 - NGUN TẮC
Mơ phân sinh đỉnh chứa những tế bào đỉnh sinh trưởng, được bao bọc bởi một lớp
vỏ bề mặt có cấu tạo cutin hạn chế thấp nhất q trình mất nước và lớp cutin này bao bọc
cả chồi đỉnh.
Ở thực vật, sự hình thành mới các cơ quan bắt đầu trong các mơ phân sinh đỉnh,
các mơ này phân hố ngay từ những giai đoạn phát triển đầu của phơi và giữ lại trong
suốt đời sống của cây. Điều này xảy ra là do mơ phân sinh có sự phân hố của những tế
bào khởi sinh. Tất cả các tế bào còn lại đều xuất phát từ các tế bào khởi sinh.
Q trình sinh trưởng của cơ quan diễn ra theo 3 giai đoạn:
- Giai đoạn thứ nhất: thường được gọi là giai đoạn phơi sinh. Trong các
điểm sinh trưởng (trong các mơ phân sinh đỉnh) xảy ra sự hình thành mầm cơ quan và sự
phân chia đầu tiên của nó thành các mơ riêng biệt.
- Giai đoạn thứ hai: giai đoạn dài ra do sự sinh trưởng nhanh chóng, mầm
cơ quan đạt đến kích thước tối đa và trở nên có hình dạng nhất định.
- Giai đoạn thứ ba: giai đoạn kết thúc sự phân hóa tế bào, bắt đầu sự hố gỗ
các thành tế bào, xuất hiện ở trên đó những chỗ dầy lên có cấu tạo và kết quả là khơng
còn khả năng tiếp tục sinh trưởng.
Ở mỗi nách lá đều có chồi nách. Chồi nách thực chất có cấu tạo khơng khác đỉnh
sinh trưởng của thân. Do hiện tượng ưu thế ngọn, chồi nách khơng phát triển, nhưng khi
được đánh thức và bắt đầu sinh trưởng, chúng có cấu tạo lá đầy đủ như thân chính.
Q trình sinh tổng hợp DNA của virus thực vật khơng xảy ra trong tế bào đỉnh
sinh trưởng do một cơ chế hiện nay khơng rõ. Vì vậy mơ đỉnh sinh trưởng là mơ duy nhất
sạch virus. Do đó trong kỹ thuật ni cấy mơ tế bào, mơ đỉnh sinh trưởng được sử dụng
là vật liệu ni cấy mơ tế bào nhằm tạo các cây khơng nhiễm virus và các loại vi khuẩn
hay nấm gây bệnh.
Ni cấy đỉnh sinh trưởng là phương pháp nhân giống quan trọng vừa tạo ra
những loại cây trồng sạch vius vừa có hệ số nhân giống rất cao. Phương pháp này đã áp