TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 9, SỐ11 -2006
Trang 59
NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE TỪ RUỘT CÁ
BASA (Pangasius bocourti)
Trần Quốc Hiền
(1)
, Lê Văn Việt Mẫn
(2)
(1)

Trung tâm Công nghệ Sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II
(2) Trường Đại học Bách khoa, ĐHQG-HCM
(Bài nhận ngày 26 tháng 08 năm 2005, hoàn chỉnh sửa chữa ngày 11 tháng 09 năm 2006
TÓM TẮT: Chế biến phụ phẩm của ngành thủy sản thành những sản phẩm có giá trị gia
tăng sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nhà sản xuất và giảm lượng phế liệu thủy sản gây ô
nhiễm môi trường. Nghiên cứu này khảo sát quá trình trích ly và tinh sạch enzyme protease từ
ruột cá Basa (Pangasius bocourti). Dịch chiết protease kiềm thu được từ ruột có tổng hoạt tính
cao nhất là 15,79UI/gCKNT (chất khô nội tạng) trong điều kiện chi
ết: tỷ lệ mẫu/dung môi
1/1(w/w); pH 9,5; nhiệt độ 35
o
C; thời gian chiết 10 phút. Dung môi isopropanol là tác nhân
thích hợp nhất để kết tủa protease trong dịch chiết từ ruột cá Basa. Với tỷ lệ thể tích dịch chiết
enzyme và thể tích isopropanol là 15/85, mức tinh sạch chế phẩm protease kiềm là 1,65 lần và
hiệu suất thu hồi enzym đạt được là 90,42%.
1.MỞ ĐẦU
Ngành chế biến thủy sản trong nước và trên thế giới hàng năm thải ra một lượng lớn các
phụ phế phẩm cần được xử lý hoặc chế biến tiếp.
Phụ phẩm thủy sản thường là nội tạng, đầu,
xương, da Để giải quyết một lượng lớn phụ phẩm như hiện nay, tại Việt Nam và trên thế giới
đang có xu hướng tận thu phần phụ phẩm để chế biến thành các sản phẩm có giá trị gia tăng[1].

Ý nghĩa của các hệ số phương trình hồi qui được kiểm tra theo tiêu
Science & Technology Development, Vol 9, No.11- 2006
Trang 60
chun Student v s tng thớch ca phng trỡnh hi qui vi thc nghim c kim tra theo
tiờu chun
Fisher [3].
Cỏc phng phỏp phõn tớch
Hot tớnh protease c xỏc nh theo phng phỏp Anson ci tin [1]. Hm lng protein
c xỏc nh theo phng phỏp Lowry [1]
Cụng thc tớnh toỏn
Hot tớnh riờng l s n v hot tớnh enzyme c tớnh trờn 1mg protein ca ch phm.
Hiu sut thu hi protease l t l gia tng hot tớnh enzyme thu c sau quỏ trỡnh tinh sch
v tng hot tớnh enzyme trong mu trc khi em tinh sch.
tinh sch l t l gia hot tớnh riờng ca enzyme thu c sau quỏ trỡnh tinh sch v
hot tớnh riờng ca mu enzyme trc khi em tinh sch

3.KT QU V BN LUN
3.1.Trớch ly enzym protease t rut cỏ Basa
3.1.1.Xỏc nh t l khi lng ni tng/ dung mụi (w/w) cho quỏ trỡnh trớch ly enzyme
protease
Rut cỏ basa c em trớch ly bng nc ct nhit 30
0
C trong thi gian l 10 phỳt. T
l rut/ nc ct (w/w) c thay i ln lt l: 1/1; 1/2; 1/3; 1/4 v 1/5. Kt qu thc nghim
c trỡnh by hỡnh 1.
12.421
8.579
4.808
4.161
5.748

trỡnh trớch ly protease t rut cỏ
Chỳng tụi nhn thy rng dch trớch ly enzyme thu c cú tng hot tớnh protease cao nht
l 12,42UI/g CKNT (cht khụ ni tng) tng ng vi t l rut/ dung mụi l 1/1(w/w).
Theo lý thuyt, khi tng lng dung mụi thỡ quỏ trỡnh trớch ly enzyme t nguyờn liu vo
dung mụi s tr nờn d dng hn. Tuy nhiờn, khi ta thay i t l rut v nc ct s dng
trong quỏ trỡnh trớch ly thỡ giỏ tr pH dch trớch cng thay i theo v nú nh hng n hũa
tan v kh nng khuch tỏn ca cỏc protein t ru
t vo dch trớch. Khi chỳng tụi tng lng
nc ct lờn nhiu hn so vi t l rut/dung mụi =1/1(w/w) thỡ tng hot tớnh protease ca
dch trớch ly s gim.
3.1.2.Xỏc nh pH trớch ly
Thụng thng, h enzyme protease trong rut nhúm cỏ da trn hot ng ti u trong vựng
pH kim [5]. Chỳng tụi tin hnh trớch ly protease t rut cỏ basa, s dng cỏc dung dch m
cú giỏ tr pH khỏc nhau nh sau: dung dch m 0,2 N phosphate (pH 7,0), m 0,2 N Tris-HCl
(pH 8,0) v m 0,2 N Glycine-NaOH (pH 9,0-12,0). Nc ct c chn lm dung mụi i
chng.
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 9, SỐ11 -2006
Trang 61
Chọn tỷ lệ nội tạng/ dung mơi là 1/1 (w/w), nhiệt độ và thời gian trích ly lần lượt là 30
o
C
và 10 phút. Kết quả được trình bày ở hình 2.

Chúng tơi nhận thấy rằng tổng hoạt tính protease của dịch chiết thu được sẽ thay đổi khi ta
sử dụng các dung dịch đệm có giá trị pH khác nhau để trích ly enzyme.
Dịch trích ly từ ruột có
tổng hoạt tính protease cao nhất (15,67UI/g CKNT) khi sử dụng dung dịch đệm có giá trị pH
9,0. Khi tăng pH từ 7,0 đến 9,0, tổng hoạt tính protease của dịch trích ly enzyme thu được tăng
từ 12,79 đến 15,67UI/g CKNT, tức tăng 22,5%. Tuy nhiên, nếu ta tiếp tục tăng giá trị pH từ 9,0
đến 12,0 thì tổng hoạt tính protease của dịch trích ly enzyme thu được sẽ giảm.

o
C. Thời gian trích ly thay đổi lần lượt
là: 5, 10, 15, và 20 phút.
Kết quả được trình bày ở hình 4.
11.19
15.70 15.81
15.42
10.51
0
5
10
15
20
20 30 40 50 60
Nhiệt độ(
o
C)
Tổng hoạt tính protease

(
UI/
g
CKNT
)

0.00
15.4115.43
15.79
14.81
0

Chúng tôi sử dụng phương án trực giao cấp 2:
Số thí nghiệm tối ưu: N = 9, trong đó có một thí nghiệm ở tâm phương án. Ngoài ra, chúng
tôi thực hiện thêm ba thí nghiệm ở tâm nữa
để kiểm tra ý nghĩa các hệ số của phương trình hồi
qui.
Hai yếu tố cần khảo sát là:
+ X
1
là pH dung môi trích ly với mức dưới: 8,5; tâm: 9,0 và mức trên: 9,5
+ X
2
là nhiệt độ trích ly với mức dưới 35
o
C, tâm 40
o
C và mức trên: 45
o
C
Hàm mục tiêu Y: Tổng hoạt tính protease thu được trong dịch trích ly (UI/g CKNT).

Ma trận qui hoạch thực nghiệm quá trình trích ly protease từ ruột cá Basa được trình bày ở
bảng 1

Bảng 1. Ma trận và kết quả qui hoạch thực nghiệm quá trình trích ly protease từ ruột cá Basa

Mẫu thí
nghiệm
X
1
X

- 0 12.6888
M
8
+ 0 13.7048
M
9
0 0 14.1111
M
10
0 0 14.2650
M
11
0 0 14.0330
M
12
0 0 14.0985
Phương trình hồi qui: Y=13.9562+0.481x
1
-0.4436x
2
-0.5136x
1
x
2
-0.3703x
1
2
+0.6819x
1
2

o
C)
pH

Hỡnh 5. Tng hot tớnh protease ca dch trớch ly thu c t rut cỏ Basa trong thớ nghim
ti u húa qui hoch thc nghim

Chỳng tụi nhn thy rng c hai yu t pH v nhiờt u nh hng n quỏ trỡnh trớch ly
protease t rut cỏ basa theo mt qui lut phc tp. Giỏ tr cao nht ca hm mc tiờu Y khi X
1

cú giỏ tr trong khong t 0,5 n 1,0 v X
2
cú giỏ tr trong khong t -1,0 n -0,75.
Chỳng ta cú th xỏc nh c pH v nhit ti u cho quỏ trỡnh trớch ly enzyme t rut
cỏ Basa khi gii phng trỡnh hi qui
(1). Da theo kt qu thu c trờn hỡnh 5, chỳng tụi
chn iu kin thớch hp chit enzyme t rut cỏ basa cho nhng thớ nghim tip theo nh
sau: X
1
=1 v X
2
=-1 tng ng vi pH 9,5 v nhit chit 35
o
C.
3.2.Tinh sch enzyme protease trong dch chit t rut cỏ Basa bng tỏc nhõn
(NH
4
)
2

2
SO
4
s lm tng tinh sch ca ch phm protease so vi phng phỏp ch
kt ta enzyme bng mui (NH
4
)
2
SO
4
. tinh sch ch phm tng t 1,40 lờn 1,75, tc tng
25%. Tuy nhiờn, hiu sut thu hi enzyme protease gim t 89,70% xung 75,39%. Do trong
quỏ trỡnh thm tớch, ngoi lng mui thoỏt qua mng cellophan thỡ mt lng protein cng cú
th b tht thoỏt.
Science & Technology Development, Vol 9, No.11- 2006
Trang 64
100.00
89.70
75.39
1.00
1.40
1.75
0
30
60
90
120
Dòch enzym
ban đầu
K e át tu ûa b ằn g

88.50
77.95
64.17
47.71
1.00
1.14
1.22
1.36
1.22
1.01
0.84
0
30
60
90
120
100:0 10:90 15:85 20:80 25:75 30:70 35:65
T y û le ä V m a ãu /V d m
HS thu hồi protease (%)
0
1
2
3
4
Mức tinh sạch (lần)
Hiệu suất thu hồi (%) Mức tinh sạch (lần)

Hình 7.
Hiệu suất thu hồi và mức tinh sạch protease kiềm trong dịch trích ly từ ruột cá Basa (tác nhân
kết tủa: ethanol)

dm
là 20/80 thì hiệu suất thu hồi
protease cao nhất (88,50%) và mức tinh sạch của chế phẩm cũng cao nhất (1,36 lần). Nếu ta
tiếp tục tăng tỷ lệ ethanol trong tổng thể tích hỗn hợp vượt q 80% thì hiệu suất thu hồi
protease và mức tinh sạch của chế phẩm sẽ giảm.

TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 9, SỐ11 -2006
Trang 65
Kết tủa protease bằng acetone
Kết quả được trình bày ở hình 8. Chúng ta thấy rằng khi tăng tỷ lệ aceton trong tổng thể tích
hỗn hợp (dịch enzyme thơ và aceton) thì hiệu suất thu hồi enzyme cũng như mức tinh sạch của
chế phẩm sẽ tăng. Khi tỷ lệ V
mẫu
/V
dm
là 20/80 thì hiệu suất thu hồi enzyme cao nhất (78,78%)
và mức tinh sạch của chế phẩm cũng cao nhất (1,51 lần). Nếu tăng tỷ lệ aceton trong thể tích
hỗn hợp vượt q 80% thì hiệu suất thu hồi protease và mức tinh sạch của chế phẩm sẽ giảm.
10 0 . 0 0
73.84
76.04
78.79
67.86
60.56
52.15
1. 0 0
1. 2 2
1. 3 9
1. 5 1
1. 3 5

1.00
1.40
1.65 1.63
1.61
1.53
1.44
0
30
60
90
120
100:0 10:90 15:85 20:80 25:75 30:70 35:65
T y û le ä V m a ãu / V d m
Hiệu suất thu hồi protease(%)
0
2
4
6
8
Mức tinh sạch (lần)
Hiệu suất thu hồi (%) Mức tinh sạch (lần)

Hình 9.
Hiệu suất thu hồi và mức tinh sạch protease kiềm trong dịch trích ly từ ruột cá Basa (tác nhân
kết tủa: isopropanol)

Kết tủa protease bằng isopropanol
Kết quả được trình bày ở hình 9. Chúng ta thấy rằng isopropanol làm kết tủa enzyme theo
qui luật tương tự như ethanol và aceton. Khi tỷ lệ isopropanol trong tổng thể tích hỗn hợp tăng
dần thì hiệu suất thu hồi enzyme cũng như mức tinh sạch của chế phẩm sẽ tăng cao. Khi tỷ lệ

phức tạp, tốn nhiều thời gian và chi phí hơn so với phương pháp sử dụng các tác nhân kết tủa
khác.
Khi sử dụng tác nhân kết tủa enzyme là các dung mơi hữu cơ như ethanol, aceton và
isopropanol thì mức tinh sạch chế phẩm thu được thấp hơn đơi chút so với phương pháp kết tủa
enzyme bằng muối (NH
4
)
2
SO
4
kết hợp với phương pháp thẩm tích qua màng cellophan nhưng
hiệu suất thu hồi protease lại cao hơn. Trong các dung mơi hữu cơ đã khảo sát, khi sử dụng
isopropanol với tỷ lệ V
mẫu
/V
dm
là 15/85, hiệu suất thu hồi protease từ dịch trích ly ruột cá basa
đạt giá tại cao nhất là 90,42%
hình 10. Việc sử dụng dung mơi để tinh sạch enzyme nhìn chung
có chi phí tương đối thấp, qui trình thực hiện đơn giản.
Chúng tơi chọn isopropanol là tác nhân kết tủa thích hợp nhất cho việc thu nhận chế phẩm
protease kiềm từ ruột cá Basa
.
89.70
75.39
88.50
78.79
90.42
1.40
1.75

Hiệu suất thu hồi (%) Mức tinh sạch (lần)

Hình 10. Mức tinh sạch và hiệu suất thu hồi protease có trong dịch trích từ ruột cá Basa khi
sử dụng các tác nhân kết tủa khác nhau

4. KẾT LUẬN
Dịch trích ly enzyme protease thu được từ ruột cá basa có tổng hoạt tính cao nhất là
15,78UI/gCKNT trong điều kiện trích ly: tỷ lệ mẫu/dung mơi: 1/1 (w/w); pH 9,5; nhiệt độ
35
o
C; thời gian trích ly 10 phút.
Dung mơi isopropanol được xem là tác nhân thích hợp nhất để kết tủa protease từ ruột cá
Basa. Nếu sử dụng isopropanol với tỷ lệ V
mẫu
/V
dm
là 15/85 thì hiệu suất thu hồi enzyme là
90,42% và chế phẩm protease kiềm đạt mức tinh sạch 1,65 lần. Tuy nhiên, dịch trích ly enzyme
protease thu được từ ruột cá basa có tổng hoạt tính chỉ bằng 5,16% so với dịch trích ly enzyme
từ ruột cá ngừ vây vàng [5] và chỉ bằng 1,26% khi so với dịch trích ly enzyme protease thu
được từ
Bacillus subtilis PE-11 [2].
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 9, SỐ11 -2006
Trang 67
Chúng tôi đang tiếp tục nghiên cứu xác định các tính chất và thông số động học của chế
phẩm protease thu được từ ruột cá basa và thử ứng dụng chế phẩm để thủy phân protein trong
công nghệ thực phẩm.
EXTRACTION AND PURIFICATION OF PROTEASE FROM BASA
CATFISH INTESTINE (Pangasius bocourti)
Tran Quoc Hien

, Region workshop on low value and trash fish in the Asia-pacific region,
Ha Noi, Viet Nam, 3p (2005)
[5].
Klomklao. S, Bebjakul. S and Visessanguan. S, Comparative studies on proteolytic
activity of splenic extract from three tuna species commonly used in Thailand, Journal
of Food Biochemistry 28, pp 355-372 (2004)
[6].
Rodney. F. B, Modern experimental biochemistry, The Benjamin/ Cummings
Publishin Company, Inc, 555p (1993)
[7].
Roe. S, Protein purification techniques, Oxford University press, 262p ( 2001)
[8].
Rustad, T, Utilisation of marine by products, Electronic journal of inveromental,
agricultural and food chemistry, No.2, 6p (2003)
[9].
Thangam. E. B. and Rajkumar. G. S, Purification and characterization of alkaline
protease from Alcaligenes faecalis,
Biochem 35, pp149-154 (2002)