BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
-------    -------
TRƯƠNG THỊ NHƯ HIẾU
SO SÁNH TÁC DỤNG THỦY PHÂN
ĐẬU HŨ BẰNG PHỨC HỆ ENZYME
CỦA Bacillus subtilis sp. và Bacillus natto sp.
ĐỂ CHẾ BIẾN THỨC UỐNG CHỨC NĂNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ VI SINH VẬT HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2010

LỜI CẢM ƠN

Có được thành quả như ngày hôm nay, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:
Tôi xin cam đoan những số liệu trong luận văn này là trung thực, kết quả thí nghiệm được lặp lại tối thiểu 3
lần và chưa ai công bố. Tác giả luận văn
Trương Thị Như Hiếu
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Bs
TC
Bacillus subtilis sp. phân lập từ chao
Bn Bacillus natto phân lập từ sản phẩm nattospes
CP Môi trường cá peptone
ĐC Đối chứng
ĐVHT Đơn vị hoạt tính
MT Môi trường
NB Nutrient Broth
NA Nutrent agar
PGA Potato glucose agar
OD Trị số mật độ quang
TCA Trichloroacetic
TK
m
Lactobacillus sp. phân lập từ mẻ cơm lên men
PTHQ Phương trình hồi quy

MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ

uống chức năng có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa và có vai trò probiotic.
- Xây dựng được quy trình sản xuất thức uống chức năng từ đậu hũ.
- Đáp ứng xu hướng giảm tiêu thụ chất đạm và chất béo động vật thay bằng đậu nành có nguồn gốc
thực vật.
- Góp phần đưa đậu nành ra khỏi nhóm có cạnh tranh yếu trong nền kinh tế quốc dân.
3. NÉT MỚI CỦA ĐỀ TÀI
- Sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis sp. (sau khi so sánh với Bacillus natto sp.) thủy phân đậu hũ để
chế biến thực phẩm chức năng, là tác nhân probiotic thứ nhất.
- Dùng vi khuẩn lactic (là tác nhân probiotic thứ 2) ức chế hoạt động vi khuẩn Bacillus vừa đủ để
bảo quản thực phẩm mà không dùng hóa chất.
- Bước đầu tạo sản phẩm mới: thức uống chức năng từ đậu hũ thủy phân lên men lactic. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐẬU NÀNH
1.1.1. Lịch sử phát triển
Đậu nành được xem là một trong những cây trồng cổ nhất của nhân loại. Nhiều nghiên cứu
chứng minh rằng đậu nành có nguồn gốc từ Trung Quốc. Nó được trồng trên nhiều loại đất khác
nhau và có phạm vi khí hậu rộng khắp, trải dài từ vùng nhiệt đới Brazil đến hòn đảo Hokkaido đầy
tuyết nằm ở phía Bắc Nhật Bản. Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, con người đã tìm thấy vai
trò của đậu nành trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong lĩnh vực thực phẩm. Vì vậy, đậu nành ngày
càng lan rộng khắp thế giới. [36]
1.1.2. Cây đậu nành
Cây đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L) Merrill, thuộc:

Họ Fabaceae
Phân họ:
Faboideae
Chi Glycine
Loài
G. max

* Màu sắc: vàng, xanh, nâu hoặc đen và các màu trung gian nhưng màu vàng là tốt nhất nên
được trồng và sử dụng nhiều.
* Cấu trúc hạt: gồm 3 phần chính là vỏ hạt, phôi và tử diệp.
- Vỏ: là lớp ngoài cùng của hạt đậu nành, có nhiều loại màu sắc và là yếu tố cho việc xác
định giống đậu nành, có tác dụng bảo vệ phôi mầm.
- Phôi: là rễ mầm, là phần sinh trưởng của hạt khi nảy mầm.
- Tử diệp: gồm hai lá mầm tích trữ dinh dưỡng cho hạt.
Bảng 1.1. Thành phần các chất có trong hạt đậu nành (% khối lượng) [15]

1.1.3.2. Thành phần hóa học
So với các nguyên liệu thực phẩm chính hiện nay, đậu nành thực sự giàu dinh dưỡng, vừa có
nguồn protein cao nhất trong các loại đậu vừa là dược liệu quý.
Đậu nành có hàm lượng dinh dưỡng thay đổi rộng phụ thuộc vào giống và điều kiện trồng
trọt nhưng nhìn chung chúng chứa 35-40% protein, 15-25% chất béo, 15-30% carbohydrate; các
muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa,
cellulose và khoảng 5% tro. [29]
Theo số liệu phân tích của công ty Ajinomoto, Thái Lan 1994, hàm lượng dinh dưỡng của

35,56
17,10
8,00
2,05
0,54
38,06
18,00
8,45
0,39
0,59
47,81
1,50
0,60
2,66
0,61
42,94
3,00
1,40
2,72
0,57
Thành phần
% khối lượng
toàn hạt
Protein
(%)
Lipid
(%)
Carbohydrate
(%)
Tro

Leucin
Isoleucin
Serin
%
%
%
%
%
%
%
%
0,61
1,35
2,11
1,49
1,62
2,68
1,51
1,73
0,72
1,53
2,62
1,76
1,74
3,03
1,67
2,05
0,72
1,69
3,03

Biotin 0.8 mg/g Vitamin B
1
0.54 mg%
Pantothenic acid 13 – 21.5 mg/g Vitamin B
2
0.29 mg%
Folic acid 1.9 mg/g Vitamin PP 2.3 mg%

Enzyme quan trọng của đậu nành là lipoxygenase, được biết đến là lipoxydase xúc tác phản ứng
oxy hóa acid béo không bão hòa bởi O
2
, gây mùi đậu nành.
Enzyme urease có nhiều ở đậu nành sống, phân hủy ure thành amoniac, là một hợp chất độc
với cơ thể người do đó không nên ăn đậu nành sống. [15]
1.1.4. Công dụng của đậu nành [37]
Đậu nành có chứa rất nhiều protein, 8 loại acid amin thiết yếu và là nguồn cung cấp calci,
chất xơ, sắt và vitamin nhóm B. Các hợp chất isoflavon và hóa thảo (phytochemicals) khác trong
đậu nành có khả năng phòng ngừa và trị liệu một số bệnh như: đau tim, tai biến mạch máu não, ung
thư vú, ung thư kết tràng… (Theo Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ, Viện Đại học Havard, Viện Đại
học Alabama. Minnesota, Iowa và Helsinki, Phần Lan). Những hóa thảo đậu nành gồm:
- Protease inhibitors: ngăn ngừa sự tác động của một số gene di truyền gây nên chứng ung
thư, bảo vệ tế bào cơ thể khỏi tác hại của môi trường sống.
- Phytates: ngăn cản tiến trình gây bệnh ung thư kết tràng và ung thư vú, có khả năng tiêu
diệt chất làm tế bào bị ung thư và phục hồi những tế bào bị hư hại.
- Phytosterols: ngừa các bệnh tim mạch bằng cách kiểm soát lượng cholesterol máu, giảm sự
phát triển các bướu ung thư kết tràng và chống ung thư da.
- Saponins: hoạt động như chất chống oxy hóa bảo vệ tế bào cơ thể, trực tiếp ngăn cản sự
phát triển ung thư kết tràng và làm giảm lượng cholesterol trong máu.
- Phenolic acid: là một hóa thảo chống oxy hóa và phòng ngừa các DNA bị tế bào ung thư
tấn công.

lecithin có trong loại dầu đậu nành chưa lọc rất tốt cho não.
Thực phẩm đậu nành ăn nhanh (Fast food)
Số người ăn chay bằng thực phẩm đậu nành càng ngày càng gia tăng tại Hoa Kỳ nên các nhà
chế tạo thực phẩm đã biến chế thực phẩm đậu nành thành những loại thức ăn nhanh, tiện nghi và bổ
dưỡng như Vons, Lucky, Hughs v.v…
1.1.5.2. Những sản phẩm đậu nành ở phương Ðông

Những sự hiểu biết về đậu nành thực sự bắt đầu ở Ðông phương và đã trở thành một phần của
nền văn hóa Châu Á. Họ đã chế biến thành những thức ăn như là một nghệ thuật của gia đình và
từng địa phương. Những thực phẩm này bao gồm đậu hũ, sữa, nước tương, mì căn, tàu hũ ky,
tempeh, miso, natto..v..v..
* Tempeh là bánh làm từ đậu nành và bột gạo lên men, nổi tiếng tại Indonesia, chứa 9%
protein đậu nành, nhiều chất xơ và ít chất béo hơn đậu hũ và sữa đậu nành.
Hình 1.3. Sản phẩm tempeh
* Miso là hỗn hợp lên men gồm đậu nành, bột gạo, muối
và nước, rất phổ thông tại Nhật Bản và Trung Hoa.
Có sáu loại miso khác nhau nhưng mỗi thứ đều có chứa
khoảng 13% protein, 13% muối, bảo quản trong tủ lạnh. Hình 1.4. Các loại miso
* Nước tương (soy sauce) rất phổ thông ở Châu Á.
Làm từ hỗn hợp đậu nành, gạo nếp, muối, nấm mốc và
nước; ủ từ 3 đến 12 tháng tùy theo loại.

Có ba loại là loại loại cứng (firm tofu), loại mềm
(soft tofu) và loại đậu hũ lụa (silken tofu).
Hình 1.8. Sản phẩm đậu hũ
Bảng 1.5. Thành phần dinh dưỡng đậu hũ
Thành phần dinh dưỡng Đậu hũ cứng Đậu hũ mềm Đậu hũ lụa
Calories 120 86 72
Protein (g) 13 9 9,6
Chất béo (g) 6 5 2,4
Chất béo bão hòa (g) 1 1 0
Carbohydrates (g) 3 2 3,2
Calci (mg) 120 130 40
Natri (mg) 9 8 76
Cholesterol (mg) 0 0 0
Sắt (mg) 8 7 1
Xơ (mg) 1 0 0
% calories từ protein 43 39 53
% calories từ carbohydrate 10 9 17
% calories từ chất béo 45 52 30
Nguồn: Composition of Foods: Legumes and Legume Products. United States Department of
Agriculture, Human Nutrition Information Service, Agriculture Handbook 8-16. Revised 12-1986.
1.2. KHÁI QUÁT VỀ THỨC UỐNG CHỨC NĂNG
1.2.1. Định nghĩa [41]
* Thực phẩm: tất cả các chất đã hoặc chưa chế biến nhằm sử dụng cho con người gồm đồ
ăn, uống, nhai, ngậm, hút và tất cả các chất được sử dụng để sản xuất, chế biến hoặc xử lý thực
phẩm, nhưng không bao gồm mỹ phẩm hoặc những chất chỉ được dùng như dược phẩm.
* Thực phẩm chức năng
Cho đến nay chưa có một tổ chức quốc tế nào đưa ra định nghĩa đầy đủ về thực phẩm chức
năng, mặc dù đã có nhiều Hội nghị quốc tế và khu vực về thực phẩm chức năng. Gần đây các định
nghĩa về thực phẩm chức năng được đưa ra nhiều hơn và có xu hướng gần thống nhất với nhau.
+ Hiệp Hội thông tin thực phẩm quốc tế (IFIC), định nghĩa: “ Thực phẩm chức năng là thực

Vi sinh vật trong chế phẩm probiotic muốn đạt hiệu quả mong muốn cần phải đáp ứng đúng
một số yêu cầu:
- Phải được định danh chính xác, đúng tên chủng loài vi sinh vật.
- Cư trú ở người, không độc, không gây bệnh.
- Đủ số lượng để trị liệu: khoảng 10
8
-10
9
tế bào trong một ngày.
- Có khả năng tồn tại khi đi qua dạ dày, nơi có môi trường acid, pH từ 1-4 .
- Chịu đựng được khi qua ruột non, nơi dịch mật toàn phần tiết ra cao nhất.
- Sinh ra một số chất kháng sinh, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể.
- Di truyền ổn định.
- Không chuyển gen đề kháng kháng sinh sang những vi sinh vật khác.
- Không được mang vào cơ thể những vi sinh vật gây bệnh.
- Có khả năng cạnh tranh và lấn át với những vi sinh vật gây bệnh và bám vào niêm mạc
đường tiêu hóa.
1.2.2.4. Các chủng vi sinh vật thường dùng làm probiotic
Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ yếu thuộc
Lactobacillus và Bifidobacterium, còn Enterococus và Streptococus cũng được sử dụng nhưng ít
hơn. Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces boulardii cũng được xem là
probiotic.
Bảng 1.6. Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic ở người


B. adolescentis
B. laimalis
B. bifidum
B. brevis
B. infantis
B. lactis
B. longum
Propionibacterium
freudenreichii
Enterococcus faecalis
Lactococus lactis
Leuconostoc mesenteroides
Streptococus thermophilus
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces boulardii

- Soy Biotic trị các triệu chứng khó chịu của phụ nữ vào thời kỳ tắt kinh.
- Magic 851 giúp tăng sự hoạt động của hệ miễn nhiễm và ngăn ngừa ung thư với các chất cô
đặc từ đậu nành . [37]
1.3. CÁC GIỐNG VI SINH VẬT SỬ DỤNG
1.3.1. Bacillus subtilis và Bacillus natto
1.3.1.1. Hệ thống phân loại [40]
Giới: Prokaryota
Ngành: Protophyta
Lớp: Schyzomycetales
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
Bacillus natto Hình 1.11. Bề mặt vi khuẩn Bacillus

(C=Capsule, S=S-layer, P=Peptidoglycan)
S-layer
Hiện diện trong một số thành viên của giống Bacillus. Chức năng chưa được xác định rõ ràng
nhưng dường như có liên quan đến tính kết dính của vi khuẩn.
Giáp mạc (capsules)
Thành phần hóa học của lớp vỏ nhầy ở các vi khuẩn khác nhau cũng khác nhau, thường là
được tạo nên từ các polysaccharide, nitrogen, phosphorite và có thể có cả polypeptide nhưng thành
phần chủ yếu là nước (98%), có nhiệm vụ như một hàng rào thẩm thấu để bảo vệ tế bào chống lại
quá trình khô.
Vách tế bào
Vách tế bào rất mỏng (100-200A
0
), trong suốt không màu. Vách tế bào có tính chất đàn hồi
và có độ bền rất lớn, có thể chịu được áp suất cao. Thành phần hóa học chủ yếu là glucid, một số
chất béo, protide, các acid amin và chúng thay đổi tùy loại vi khuẩn, tùy môi trường sống.
Tiên mao (flagella)
Hầu hết các vi khuẩn tạo bào tử hiếu khí đều di động nhờ vào các tiên mao là các sợi lông rất
mảnh mọc trên những phần xác định của tế bào vi khuẩn, có cấu trúc là protid. Chiều dài tiên mao
thường bằng chiều dài tế bào nhưng cũng có thể dài hơn tùy loại vi khuẩn. Số lượng và vị trí tiên
mao ở các tế bào vi khuẩn khác nhau ở mỗi loài. Chúng có thể mọc ở một đầu, hai đầu hoặc mọc
xung quanh, …
1.3.1.5. Sự hình thành bào tử [5]
Một trong những đặc điểm quan trọng của B.subtilis và B.natto là khả năng tạo bào tử trong
những điều kiện nhất định. Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng bức xạ, kháng hoá chất, kháng áp suất

- amylase nấm mốc.
-

- amylase của vi khuẩn B. subtilis cũng như của B.natto thủy phân tinh bột tạo ra các
dextrin có mạch dài khoảng 6-8 gốc glucose. Các dextrin này lại bị phân giải tiếp tục theo sơ đồ:
G
6
→ G
1
+ G
5
G
7
→ G
1
+ G
6
hay G
2
+ G
5
(ít)
G
8
→ G
2
+ G
6
hay G
3

Giống: Lactobacillus
Pesiococcus
Họ: Enterococcaceae
Giống: Enterococcus
Họ: Leuconoscaceae
Giống: Leuconostoc
Họ: Streptococcaceae
Giống: Streptococcus
Lactococcus
* Căn cứ vào kiểu lên men, người ta chia vi khuẩn lactic thành hai nhóm [8]:
- Vi khuẩn lactic đồng hình
Tham gia vào quá trình lên men lactic đồng hình mà sản phẩm chính tạo thành là acid
lactic (90-98% tổng sản phẩm lên men), có thể có một ít các sản phẩm phụ như: ethanol, acid acetic,
acetoin, CO
2
.
Điều này có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp sản xuất acid lactic và công nghiệp thực
phẩm, đặc biệt là trong công nghiệp sữa như sản xuất sữa chua, phomai. Chúng đóng vai trò quan
trọng cùng với vi khuẩn propionic trong việc tạo hương cho các loại phomai rắn.
- Vi khuẩn lactic dị hình
Tham gia vào quá trình lên men lactic dị hình mà sản phẩm lên men ngoài acid lactic còn
có hàng loạt các sản phẩm khác với tỷ lệ khá cao như sau: acid lactic 40%, acid acetic 10%, các chất
khí 20%.
Nhiều sản phẩm nên việc tách và cô lập các sản phẩm khác nhau rất tốn kém nhưng cũng
có vai trò quan trọng trong chế biến thực phẩm. Vi khuẩn lactic lên men dị hình có thể làm cho sản
phẩm có mùi vị thơm ngon và đặc trưng hơn.
1.3.2.2. Lactobacillus [31]
Tế bào hình que ngắn, kích thước 0.5 – 1.2 x 1 – 10µm, đôi khi có
dạng hình cầu kết chuỗi ngắn.
Là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, hiếm khi di động

Leuconostoc gelidum Phổ kháng khuẩn rộng, được sinh ra vào
đầu chu kỳ tăng trưởng.
Helveticin L.helveticus 481 Phổ kháng khuẩn hẹp.
Carnobacteriocin
Carnobacterium piscicola
LV17
Phổ kháng khuẩn hẹp, được sinh ra vào
đầu chu kỳ tăng trưởng.

* Probiotic
Vi khuẩn lactic được chú ý sử dụng nhiều trong vai trò probiotic, có nhiều loài được sử dụng
như đã trình bày ở phần 1.2.2 của luận văn này.
* Một số ứng dụng khác
- Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa để sản xuất sữa chua, kefir, phomai, koumis…
- Ứng dụng trong muối chua rau quả: bắp cải muối, dưa chuột muối, …
- Ứng dụng trong ủ chua thức ăn gia súc dùng trong chăn nuôi.
- Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất acid lactic và các loại muối lactate.
- Acid lactic được ứng dụng trong ngành thuộc da, dệt, công nghiệp tổng hợp chất dẻo, công
nghiệp thực phẩm.
- Lactate calci là loại dược phẩm bổ sung calci dưới dạng dễ hấp thu, lactate sắt dùng để chữa
bệnh thiếu máu, lactate đồng dùng làm dung môi, … CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Nguyên liệu
* Đậu hũ: đậu hũ Vina Tofu
- Dụng cụ thí nghiệm bao gồm: ống nghiệm, becher, erlen, ống đong, pipet, đĩa Petri, buret,
phễu lọc, giấy lọc, ….
- Thiết bị thí nghiệm như tủ cấy, kính hiển vi, máy lắc, tủ hấp, cân điện tử, bể ổn nhiệt, máy
Kjeldahl bán tự động, máy Soxhlet, máy đo quang phổ, …
2.1.4. Môi trường dùng trong thực nghiệm
- Môi trường giữ giống Bs
TC
và Bn.:
Môi trường thạch nước mắm (CP: cá peptone).

- Môi trường nhân giống Bs
TC
và Bn.
Môi trường dịch nước mắm (CP: cá peptone).
Môi trường sữa đậu nành.
- Môi trường giữ giống Lactobacillus sp.: môi trường cà chua (N
2
)
- Môi trường định tính enzyme.
Môi trường thạch Czapek – Dox + 1% tinh bột định tính enzyme amylase.
Môi trường thạch Czapek – Dox + 1% casein để định tính enzyme protease.
Môi trường thạch Czapek – Dox + 1% fibrin để định tính enzyme protease.
(Thành phần các môi trường được trình bày rõ ở phần phụ lục của luận văn này).
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính hệ enzyme (amylase, protease) của
Bs
TC
và Bn trong điều kiện khác nhau của các yếu tố ảnh hưởng như thời gian, nhiệt độ, pH. Sau đó,
tối ưu hóa điều kiện các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính các enzyme của hai chủng giống vi khuẩn


Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu hình thái các chủng vi sinh vật có trong đề tài (vi khuẩn
Bacillus subtilis sp., Bacillus natto sp., Lactobacillus sp.)
2.2.2.1. Phương pháp nhuộm Gram [14]
* Nguyên tắc
Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào với thuốc tím kết tinh (crystal violet) và iod mà vi
khuẩn chia làm 2 nhóm khác nhau là:
Xác định thành phần hóa học trong nguyên liệu đậu hũ
Xây dựng đường cong sinh trưởng. Xác định sinh khối tối đa của
Bs
TC
, Bn trong môi trường CP và trong môi trường sữa đậu nành.
Khảo sát hoạt tính enzyme amylase, protease trên cơ chất đậu của Bs
TC
và
Bn từng yếu tố thời gian, nhiệt độ, pH rồi tối ưu hóa thực nghiệm.
Từ đó chọn chủng tối ưu.
Khảo sát quá trình lên men
Xác định tỷ lệ giống (Bs
TC

-
Dùng que cấy khử trùng để nguội lấy một ít sinh khối vi khuẩn hòa vào giọt NaCl 9 ‰
trên lame.
-
Dàn mỏng thành vết bôi, hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn.
-
Đặt tiêu bản lên thanh thủy tinh chữ U, trên thau nhựa.
-
Đặt miếng giấy lọc lên vòng phết kính.
-
Nhỏ dung dịch crystal violet thấm ướt hết giấy lọc, để yên từ 30 giây - 1 phút, rửa trôi
thuốc nhuộm dư với nước.
-
Nhỏ dung dịch Lugol, để 30 giây, rửa lại nhẹ nhàng với nước.
-
Tẩy màu bằng cồn 96
o
từ 15-20 giây: giữ phiến kính ở góc nghiêng nhỏ và cẩn thận nhỏ
giọt cồn cho cồn chảy ngang qua vết bôi cho đến khi không thấy vết thuốc nhuộm chảy
theo. Ngay lập tức rửa vết bôi lại với nước. Thời gian khử màu trong bước này đóng vai
trò quyết định kết quả của quá trình nhuộm.
-
Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin, để yên trong 30 giây, rửa với nước.
-
Thấm khô phiến kính với giấy thấm. Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới kính
hiển vi với vật kính dầu x100.
2.2.2.2. Phương pháp nhuộm bào tử [14]
Với thuốc nhuộm Fuchsin, HCl 0,5%, H
2
SO