NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN
LAI GNRH-TBK Ở E. COLI

Đặng Thành Nam & Phan Văn Chi*
Viện Công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN & CNQG
*Tác giả để liên hệ: Tel. 7561903; Fax. 8363144; E-mail:

1. MỞ ĐẦU

Trichobakin (TBK) là một protein bất hoạt ribosom lớp 1,
được tách chiết từ cây Trichosanthes sp. Bac Kan 8-98
thuộc họ Cucurbitaceae [1,2]. Trichobakin tái tổ hợp sau
khi được biểu hiện ở E.coli, đã được tinh sạch và chứng
minh là có hoạt tính N- glycosidase cao đối với ARN
ribosom và có khả năng ức chế quá trình sinh tổng hợp
lucierase trên mô hình RRL (Rabbit Reticulocyte Lysate).
Ngoài khả năng kháng vi khuẩn, virut, chúng còn có khả
năng gây ức chế các dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro
[3]. Để có thể có những ứng dụng hiệu quả hơn,
Trichobakin có thể được gắn thêm thành phần hướng đích
để tạo các protein lai theo dạng các “độc tố miễn dịch”
(ITs) nhằm tiêu diệt một cách chọn lọc các quần thể tế bào
mà ở đó có biểu hiện các thụ thể đặc hiệu của thành phần
hướng đích bằng công nghệ ADN tái tổ hợp [ 4, 5].

Hormon giải phóng kích dục tố (GnRH) hay hormon giải
phóng thể vàng (luteinizing hormone-releasing hormone:
LH-RH) là một neuro-decapeptide, không gây đáp ứng
miễn dịch và có ái lực rất cao (K
d
khoảng 10

England Biolabs (Anh). Vector biểu hiện pET 21d(+),
chủng vi khuẩn E.coli BL 21 (DE3) được mua của hãng
Novagen (Mỹ).

2.2 Phương pháp

2.2.1 Nhân gen gnrh- tbk bằng kỹ thuật PCR

Việc thiết kế gen lai gnrh- tbk được tiến hành trên cơ sở
gen tbk đã được tách dòng pQV 20 [1]. Gen mã hoá cho
GnRH của người được nối với gen mã hoá cho Trichobakin
thông qua một polynucleotid trung gian mã hoá cho 13 axit
amin (linker), có vai trò tạo nên sự mềm dẻo trong cấu trúc
và tính tan của protein lai HSP1. Tổ hợp gen này có kích
thước 813 bp mã hoá cho protein có kích thước khoảng 30
kDa. Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu để tạo ra
và nhân lên tổ hợp gen mã hóa cho protein lai GnRH-TBK.
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94
o
C, 48 giây; 56
o
C, 48
giây; 72
o
C, 84 giây; lặp lại 32 chu kỳ; 72
o
C, 8 phút.

2.2.2 Thiết kế vector biểu hiện protein tái tổ hợp



3.1 Thiết kế vector biểu hiện protein lai GnRH-TBK

3.1.1 Nhân gen mã hoá cho GnRH- TBK

Dựa trên trình tự các gen mã hoá cho các protein GnRH và
TBK cặp mồi phục vụ cho việc tạo ra và nhân gen tái tổ
hợp gnrh-tbk bằng kỹ thuật PCR đã được tổng hợp. Mồi
xuôi mang vị trí nhận biết của enzym giới hạn NcoI, toàn
bộ trình tự gen gnrh, trình tự đoạn linker và trình tự
nucleotid mã hóa cho 8 acid amin đầu tiên của TBK. Mồi
ngược mang vị trí nhận biết của enzym giới hạn BamHI và
trình tự nucleotidd mã hoá cho 7 acid amin cuối cùng của
gen tbk.

Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel
agarose 0.8 %(hình 1) cho thấy một băng duy nhất có kích
thước khoảng 813 bp. Kích thước này phù hợp với tính
toán lý thuyết về kích thước sản phẩm nối tạo thành giữa
gen gnrh, linker và gen tbk.

3.1.2 Vector biểu hiện protein lai GnRH-TBK

Sản phẩm PCR gnrh-tbk và vector biểu hiện pET 21d(+)
cùng được xử lý bằng hai enzym giới hạn NcoI và BamHI,
và sau đó được nối lại với nhau bằng enzym T4 ADN
ligase nhằm tạo ra plasmid mới mang tổ hợp gen gnrh-tbk
và hệ biểu hiện phù hợp, phục vụ cho việc biểu hiện protein
tái tổ hợp được nghiên cứu. Kết quả phân tích bằng điện di
trên gel agarose 0.8% (hình 1).

hiện một băng protein mới có trọng lượng phân tử khoảng
30 kDa so với mẫu tế bào không được cảm ứng bởi IPTG
(đường chạy 5). Như vậy, hệ biểu hiện của vector pET
21d(+) mang tổ hợp gen gnrh-tbk đã hoạt động ổn định,
dẫn đến sự biểu hiện một loại protein mới. Protein này có
trọng lượng phân tử phù hợp với tính toán lý thuyết về
trọng lượng phân tử của protein tái tổ hợp GnRH-TBK. Để
có thể khẳng định một cách chắc chắn hơn chúng tôi tiến
hành phản ứng Western blot với kháng thể một là huyết
thanh kháng TBK kết quả thu được thể hiện ở hình 3.

Hình 2. Điện di SDS-PAGE các sản phẩm protein tái tổ
hợp GnRH-TBK biểu hiện ở E.coli.

M: thang protein chuẩn; 1-4: protein tổng số của vi khuẩn
sau 0, 1, 2, 3h sau cảm ứng bằng IPTG; 5: protein tổng số
của vi khuẩn sau 3 h không cảm ứng IPTG

Hình 3. Phân tích GnRH-TBK bằng Western blotting.

M: Thang protein chuẩn; 1-3: Biểu hiện protein lai tái tổ
hợp GnRH- TBK (mũi tên)ở các thời điểm 1 , 2, 3 giờ sau
cảm ứng bằng IPTG. 4. KẾT LUẬN

Đã tạo được được tổ hợp gen gnrh-tbk có kích thước 813
bp dựa trên cơ sở gen mã hoá cho GnRH có nguồn gốc từ
người và gen mã hoá cho Trichobakin bằng kỹ thuật PCR.

Schultz, K.D. and Schally, A.V. (1993) // J. Clin.
Endocrinol. Metab. 77, 1458-1464.
8. Eidne, K.A., Flanagan, C.A., Harris, N.S. and Millar,
R.P. (1987)// J. Clin. Endocrinol. Metab. 64, 425-432.
9. Quayum, A., Gullick, W., Clayton, R.C., Sikora, K.
and Waxman, J. (1990)// Br. J. Cancer 62, 96-99.
10. Imai, A., Ohono, T., Lida, K., Furui, T. and Tamaya,
T. (1994) // Cancer 74, 2555-2561.
11. Srkalovic, G., Bokser, L., Radulovic, S., Korkut, E.
and Chally, A.V (1990)// Endocrinology 127, 3052-3060.
12. Imai, A., Horibe, S., Takagi, A., Tadaki, H., Ohno,
T., and Tamaya, T., (1997) // Eur. J. Obstet, Gynecol.
Report. Biol.74, 73-78.
13. Imai, A., Takagi, A., Horibe, S., Tagaki, H., and
Tamaya, T. (1997) // Int. J. Oncol. 13, 97-100.
14. Laemmli, U.K. (1970)// Nature (London) 227, 680-
685.
15. Towbin, H., Staehelin, T. and Gordon, J. (1979) //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354. SUMMARY

Construction and expression of the fusion protein
GnRH-TBK in E. coli

Đang Thanh Nam & Phan Van Chi
Institute of Biotechnology (IBT),
National Center for Natural Science & Technology (NCST)


recombinant plasmid, designated as pGnRH-TBK was used
for the expression of the protein in E.coli strain BL 21
(DE3). The extression was induced by the addition of
IPTG. The identity of recombinant protein has been
confirmed on SDS-PAGE by its size with the molecular
mass of about 30 kDa and Western blot using rabbit
antiserum against Trichobakin. The purification and
biochemical characterization of the recombinant protein is
now under study and will be reported in the next papers.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Đinh Duy Kháng.