26
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả thu thập và phân lập mẫu vi khuẩn gây bệnh
Qua quá trình khảo sát thực tế tại các ruộng trồng rau, chúng tôi đã tiến hành lấy
mẫu và phân lập đƣợc tổng cộng 8 dòng vi khuẩn nhƣ sau:
Bảng 4.1 Danh mục các dòng vi khuẩn sử dụng trong đề tài

Tên mẫu
Nơi lấy mẫu
Cây kí chủ
1
CC1
Huyện Củ Chi
Cải ngọt
2
CC2
Huyện Củ Chi
Cải ngọt
3
CC3
Huyện Củ Chi
Cải ngọt
4
HM1
Huyện Hóc Môn
Cải ngọt


Đốm bệnh do vi khuẩn
Đốm do bọ nhảy gây hại trên rau 27
Hình 4.1 Lá cải bị bệnh thu thập ngoài ruộng rau. Hình 4.2 Vết bệnh trên lá cải thu thập ngoài ruộng chụp dƣới
kính hiển vi soi nổi.

Hình 4.3 Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng thạch
(a) vi khuẩn ly trích từ lá bệnh trên môi trường PDA; (b) khuẩn lạc sau khi
phân lập trên môi trường YDC có màu vàng, lồi, bóng, nhầy.
a
b a
d
b
c 29
Hình 4.4 Vết bệnh sau khi chủng và vết thƣơng không bị nhiễm chụp
dƣới kính hiển vi soi nổi (a) đốm bệnh trên lá sau khi chủng 4 ngày; (b) vết thương
do kim châm tạo ra trên lá không bị bệnh; (c) đốm bệnh trên lá sau khi chủng 4 ngày
nhuộm bằng dung dịch Alcohollic lactophenol; (d) vết sẹo ở lá chủng không nhiễm
bệnh nhuộm bằng dung dịch Alcohollic lactophenol. Đốm bệnh

Hình 4.5 Lá cải sau khi chủng bệnh 4 ngày, bên phải gân lá không bị nhiễm và
bên trái bị nhiễm (a) lá cải sau khi chủng bệnh 4 ngày; (b) lá cải sau khi chủng bệnh
4 ngày nhuộm bằng dung dịch Alcohollic lactophenol.

4.3. Kết quả ly trích và pha loãng DNA vi khuẩn
a
b


hoàn thiện đƣợc quy trình phản ứng PCR đáng tin cậy cho việc khuếch đại đoạn gen
trong vùng ITS, chúng tôi tiến hành phản ứng trên các mẫu DNA đã ly trích. Kết quả
thu đƣợc rất khả quan. So sánh với thang DNA chuẩn 1,5kb, chúng tôi nhận thấy sản
phẩm PCR từ các dòng thu đƣợc là đoạn có kích thƣớc 1,1kb. Kích thƣớc sản phẩm
hoàn toàn trùng khớp với nghiên cứu của Goncalves, E.R. và Rosato, Y.B.
Hình 4.8 Kết quả khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA
1: CC1, 2: CC2, 3: CC3, 4: Ladder 1,5kb, 5: HM1, 6: HM2, 7: Q12-1, 8: DC.

Sản phẩm PCR này sẽ đƣợc tinh sạch và đọc trình tự. Trình tự DNA có đƣợc sẽ so
sánh với dữ liệu trên ngân hàng gen để định danh vi khuẩn gây bệnh.
1,1kb 32
4.4.2. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR
Chọn hai mẫu CC1 và HM2 để tiến hành tinh sạch theo quy trình GFX PCR and
Gel band Purification Kit (Amersham Company). Cf1 HM2 Hình 4.9 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR.
4.4.3. Kết quả PCR vùng hrpF
Theo Young Jin Park và ctv (2004), primer XCR và XCF thiết kế dựa trên trình tự
gen hrpF có tính chuyên biệt cao, dùng để khuếch đại đoạn DNA trong vùng hrpF của
vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris có kích thƣớc 535 bp. Chúng tôi đã

các khuẩn lạc tròn, màu vàng, nhầy, bóng để phân tích.
Chủng bệnh trên cây cải ngọt sạch bệnh trồng trong nhà lƣới bằng phƣơng
pháp tạo vết thƣơng bằng cách xâm kim và nhiễm vi khuẩn trên vết thƣơng.
535 bp
1 kb 34
Ly trích DNA từ vi khuẩn bằng phƣơng pháp sử dụng CTAB với sinh khối vi
khuẩn tăng sinh bằng môi trƣờng LB lỏng.
Phƣơng pháp PCR khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA có kích thƣớc 1,1 kb sử
dụng cặp primer Xan1330 và Xan322 làm vật liệu giải trình tự. Thực hiện
phản ứng với thành phần nêu trong Bảng 3.1 theo chu trình nhiệt Bảng 3.2.
Phƣơng pháp PCR dùng cặp primer XCF và XCR khuếch đại đoạn DNA
trong vùng hrpF . Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt nhƣ trình bày ở
Bảng 3.1 và Bảng 3.3. Phản ứng tạo sản phẩm có kích thƣớc 535 bp khẳng
định vi khuẩn gây bệnh thuộc loài Xanthomonas campestris pv. campestris.
Chúng tôi đã xác định đƣợc các dòng CC1, CC2, HM1 và Q12–1 gây bệnh đốm lá
trên cây cải ngọt tại Tp. HCM là vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris.
5.2. Đề nghị
Tiến hành khảo sát, nghiên cứu ở quy mô rộng với số lƣợng mẫu phân tích lớn hơn
trên các cây rau họ thập tự. Cụ thể là mở rộng địa bàn (Đồng Bằng Sông Cửu Long,
Lâm Đồng, Long An và các tỉnh có canh tác rau), nghiên cứu trên phổ kí chủ rộng hơn
(cây họ thập tự).
Hoàn thành đề tài ở mức giải trình tự vùng 16S – 23S rDNA của vi khuẩn gây
bệnh, đối chiếu với dữ liệu ngân hàng gen, giúp quy trình định danh có cơ sở.
Nghiên cứu đa dạng di truyền các dòng vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật RFLP.

2. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục.
Trang 197 – 206.
3. Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999. Bệnh vi khuẩn và virút hại cây trồng.
NXB Giáo Dục Hà Nội. Trang 99 – 100.
4. Mai Thị Vinh và Phạm Văn Biên, 1985. Bệnh hại rau cải ở một số vùng rau
ngoại thành Tp Hồ Chí Minh. Thông báo khoa học, Viện Khoa Học Kỹ
Thuật Nông Nghiệp Miền Nam.
5. Nguyễn Văn Thắng và Trần Khắc Thi, 1996. Sổ tay người trồng rau . Nhà
xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội, 114 trang.
6. Trần Thanh Tùng, 1997. Những bệnh hại quan trọng trên một số loại rau
trồng phổ biến tại Tp Hồ Chí Minh và biện pháp phòng trừ. Thông báo
khoa học, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam. 36
TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI
7. Bradbury, J.F., 1986. Guide to plant pathogenic bacteria. Wallingford, UK:
CAB International.
8. Gaetan, S., and Lopez, N., 2005. First outbreak of bacterial leaf spot
caused by Xanthomonas campestris on Canola in argentina. Plant Disease.
89: 683 – 684.
9. Goncalves, E.R., and Rosato, Y.B., 2002. Phylogenetic analysis of
Xanthomonas species based upon 16S-23S rDNA intergenic spacer
sequences. Inetrnational Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology. 52: 355 – 361.
10. John P. Curran, 2002. Automated DNA sequencing (ABI PRISM 3100).
Training Manuals/Protocols.
11. Klement, Z., 1982. Hypersensitivity. Phytopathogenic Prokaryotes. Pages
149 – 177.
12. M. S. Krause, M.S., De Ceuster, T.J.J., Tiquia, S.M., Michel Jr.F.C.,

20. Van Gijsegem, F., Genin, S., and Boucher, C.A., 1993. Conservation of
secretion pathways for pathogenicity determinants of plant and animal
bacteria. Trends Microbiol. 1: 175 – 180.
21. Veronique Hugouvieux, Barber, C.E., and Daniel, M.J., 1998. Entry of
Xanthomoas campestris pv. campestris into hydathodes of Arabidopis
thalian leaves: a systems in bacterial pathogenis. Molecular Plant –
Microbe Interaction. 11: 537 – 543.
22. Vicente, I.G., Everett, B., and Robert, S.J., 2006. Identification of isolates
that cause z leaf spot of brassica as Xanthomonas campestris pv. raphani
and pathogenic and genetic coparison with related pathovars.
Phytopathology. 96: 735 – 745.
23. Youfu Zhao, Damicone, J.P., and Bender, C.L., 2000. Bacterial leaf spot of
leaf crucifery in Oklahoma caused by pathovars of Xanthomonas
campestris. Plant disease. 84: 1008 – 1014.
24. Youfu Zhao, Damicone, J.P., and Bender, C.L., 2000. Bacterial leaf spot of
leafy crucifer in Oklahoma caused by Pseudomonas syringae pv.
maculicola. Plant Disease. 84: 1015 – 1020.
25. Yuong Jin Park, Byuong Moo Lee, Jang Ho-Hahn, Gil Bok Lee, and Dong
Suk Park, 2004. Sensitive and specific detection of Xanthomonas 38
campestris pv. campestris by PCR using species specific primer based on
HrpF gene sequence. Microbiological Resarch. 159: 419 – 423.

- Khoai tây gọt sạch vỏ 500 g
- Dextrose 10 g
- Agar 15 g
- Nƣớc cất 1 lít 2
Khoai tây cắt thành miếng, cho vào 1 lít nƣớc đun sôi trong 40 phút.
Lọc, thêm nƣớc cho đủ 1 lít, cho dextrose, agar vào, khuấy tan bằng máy khấy từ, dịch
môi trƣờng cho vào bình tam giác 250 ml, đem khử trùng bằng nồi hấp ở 121
o
C trong
30 phút. Sau khi hấp, để nguội đến 50
o
C và đổ vào đĩa petri.
- Môi trƣờng YGC:
Glucose 5g
Yeast extract không có agar 5 g
Calcium carbonate 40 g
Agar 15g
Nƣớc 1 lít
- Môi trƣờng LB:
NaCl 10g
Yeast extract 5g
Peptone 10g
Nƣớc 1 lít
Hòa tan lần lƣợt các chất trong nƣớc bằng máy khuấy từ. Hấp ở 121
o
C trong 20 phút.
3. Pha dung dịch Alcohollic lactophenol