i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
 TRẦN THỊ MINH TÚ
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN
GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY BƢỞI BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ

LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN TRẦN THỊ MINH TÚ
KHÓA: 2002 - 2006

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006

iii

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
FACULTY OF BIOTECHNOLOGY

iii

LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn:
- Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều
kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng.
- Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô trực tiếp giảng
dạy luôn tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt bốn
năm qua.
- TS. Lê Đình Đôn đã tận tình hƣớng dẫn và động viên tôi trong thời gian thực
hiện đề tài tốt nghiệp.
- TS. Bùi Minh Trí và anh Nguyễn Văn Lẫm và các anh chị phụ trách phòng Hóa
Sinh thuộc Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM đã
tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian làm đề tài.
- Toàn thể lớp CNSH 28 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian
làm đề tài.
Thành kính ghi ơn ông bà, cha mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo con đƣợc nhƣ ngày hôm nay,
cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo mọi điều kiện và động viên con trong
suốt quá trình học tập tại trƣờng.
Chân thành cảm ơn.
Tp. HCM, tháng 08 năm 2006

Sinh viên
Trần Thị Minh Tú v

Kết quả đạt đƣợc:
1. Phân lập đƣợc 4 dòng vi khuẩn, tất cả là gram âm, trên môi trƣờng YDC phân
thành 2 nhóm vàng sữa và vàng chanh
2. Tất cả 4 dòng phân lập đƣợc đều tạo vết thƣơng sau khi chủng bệnh nhân tạo,
triệu chứng bệnh có khác nhau.
3. Kết quả sắc ký có 1 dòng (XBDL1) có sắc tố phát sáng rõ sau khi chụp UV.
4. Thực hiện thành công phản ứng PCR trên 16s-23s rDNA ITS với cặp primer
Xan1330 và Xan332 cho sản phẩm 1,1 kb.
5. Không thực hiện đƣợc phản ứng PCR trên vùng hrpW gen với cặp mồi chuyên
biệt XACR và XACF.



Phần 2. TỔNG QUAN 3
2.1. Sơ lƣợc về nhóm cây có múi trên thế giới và trong nƣớc 3
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây bƣởi 3
2.1.2. Giá trị cây ăn quả có múi ở thế giới và trong nƣớc 3
2.1.3. Tình hình sản xuất cam quýt ở Việt Nam 4
2.1.4. Tình hình sản xuất cam quýt trên thế giới 4
2.2. Bệnh loét cam Xanthomonas citri (Hasse-Dowson) 5
2.2.1. Triệu chứng bệnh 5
2.2.2. Đặc điểm gây bệnh của chủng vi sinh vật gây bệnh (X. a. pv. citri) 7
2.3. Sơ lƣợc vùng rDNA-ITS 8 vii

2.3.1. Giới thiệu vùng rDNA 8
2.3.2. Vùng rDNA-ITS trên Xanthomonas ssp. 9
2.4. Sơ lƣợc về hrpW gen 9
2.5. Những cứu về bệnh loét cam quýt trên Thế Giới và Việt Nam 11
2.5.1. Trên Thế Giới 11
2.5.2. Tại Việt Nam 12
2.6. Quy trình định danh Xanthomona sp. . 12
2.6.1. Quy trình định danh Xanthomonas sp. theo phƣơng pháp
nuôi cấy, thực hiện phản ứng sinh hóa 12
2.6.2 Quy trình định danh theo phƣơng pháp phân tử 13
2.7 Phƣơng pháp PCR 13
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 16

4.6 Thực hiện PCR với cặp mồi XACR và XACF trên hrpW gen 29
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32
5.1. Kết luận 32
5.2. Đề nghị 32
Phần 6.TÀI LIỆU THAM KHẢO 33
Phần 7. PHỤ LỤC 35 ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình Trang
Hình 2.1. Triệu chứng bệnh loét trên lá bƣởi Da Láng 6
Hình 2.2. Triệu chứng bệnh loét trên trái bƣởi Da Láng 6


x

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng Trang
Bảng 2.1. Môi trƣờng phân lập một số loài X. campestis 14
Bảng 2.2. Đặc tính sinh hóa Xanthomonas sp. 14
Bảng 3.3.Thành phần dung dịch đệm TE 20
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồiXan1330 và Xan332 22
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan332 22
Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi XACF và XACR 23
Bảng 3.5. Chu trình nhiệt phản ứng với cặp mồi XACF và XACR 23
Bảng 4.2. Hình thái vi khuẩn đƣợc phân lập từ bƣởi Da Láng
và bƣởi Đƣờng Cam 25
Bảng 4.3. Khả năng nhiễm bệnh của 4 dòng
XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 27

xi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1.1. Đặt vấn đề
Nƣớc ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa rất thuận lợi cho nhiều loại
cây nhiệt đới phát triển. Đặc biệt các loại cây ăn quả rất đa dạng và phong phú về
chủng loại. Trong đó bƣởi (Citrus grandis L Rutaceae) là loại cây ăn quả thuộc nhóm
cây có múi đƣợc trồng phổ biến và lâu đời tại các vùng đông Nam Bộ với các vùng
trồng bƣởi lâu đời và nổi tiếng nhƣ Vĩnh Cửu (Đồng Nai), Tân Uyên (Bình Dƣơng).
Cây bƣởi có tuổi thọ lâu hơn các loại cây có múi khác, thời gian bảo quản cũng lâu
hơn. Bƣởi còn là loại quả giàu vitamin đƣợc thị trƣờng trong nƣớc cũng nhƣ ngoài
nƣớc ƣa chuộng về hƣơng vị cũng nhƣ dinh dƣỡng nên ngƣời trồng bƣởi có thu nhập
cao và ổn định hơn so với các loại cây nông nghiệp khác. Vì vậy, cây bƣởi đã góp
phần cải thiện và nâng cao đời sống của ngƣời dân.
Tuy nhiên cho đến nay diện tích trồng bƣởi không tăng. Mặt khác, giống bƣởi
năng suất và phẩm chất rất tốt là cây Bƣởi Đƣờng Da Láng lại giảm rõ rệt. Nguyên
nhân chính là do bị nhiễm bệnh nghiêm trọng do vi khuẩn Xanthomonas sp. gây nên.
Vi khuẩn không ảnh hƣởng nhiều đến chất lƣợng quả nhƣng gây nên những vết sần sùi
trên mặt trái làm mất vẻ thẩm mỹ nên rất khó tiêu thụ trên thị trƣờng. Ngoài ra, vi
khuẩn còn gây bệnh trên cành, lá làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của
cây. Không chỉ gây hại trên cây bƣởi mà vi khuẩn Xanthomonas sp. gây hại hầu hết
các loại cây có múi từ mức độ nhẹ đến nặng.
Để xác định rõ dòng vi khuẩn gây bệnh này chúng tôi thực hiện đề tài “Xây
dựng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi bằng phƣơng
pháp sinh học phân tử”. Từ đó, chúng tôi có thể tìm ra phƣơng pháp phòng và trị
bệnh đạt hiệu quả nhằm khôi phục lại giống bƣởi Đƣờng Da Láng mang lại hiệu quả
kinh tế cao.
1.2. Mục đích
- Xây dựng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây có muối (cây
bƣởi).
- Phân loại tính độc của chủng gây bệnh.
2


3

Phần 2. TỔNG QUAN
2.1. Sơ lƣợc về nhóm cây có múi trên thế giới và trong nƣớc
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây bƣởi
Cây có múi hiện đang trồng ở nhiều nƣớc trên thế giới đều có nguồn gốc từ các
nƣớc vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đông Nam Á. Đƣờng ranh giới của vùng xuất xứ
cây ăn quả có múi nằm ở dãy chân núi Himalaya, phía đông Ấn Độ qua miền nam
Trung Quốc, về phía nam đƣờng ranh giới vùng đi qua Australia (theo Taraka, 1971).
Lịch sử trồng cây có múi ở nƣớc ta xuất hiện từ rất lâu đời cách đây 3000-4000
năm (Đƣờng Hồng Dật). Ngày nay, cây có múi đƣợc trồng trên khắp đất nƣớc ta từ
Lào Cai đến Cà Mau, từ Quảng Ninh đến Lai Châu. Đặt biệt là bƣởi với nhiều giống
đƣợc trồng ở nƣớc ta: bƣởi Da Láng, bƣởi Năm Roi, bƣởi Lông Cổ Cò, bƣởi Đƣờng
Cam, bƣởi Da Xanh, bƣởi Lông Hồng.Các vùng trồng bƣởi nổi tiếng ở nƣớc ta nhƣ
Đồng Nai và các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long.
2.1.2. Giá trị cây ăn quả có múi ở thế giới và trong nƣớc
Cây ăn quả có múi nhƣ cam, quýt, bƣởi là một trong những loại quả cao cấp
đƣợc nhiều ngƣời ƣa chuộng và đƣợc sản xuất ở nhiều nƣớc trên thế giới. Giá trị dinh
dƣỡng cây ăn quả có múi rất cao. Trong thành phần thịt quả có chứa 6-12% đƣờng,
chủ yếu là sacaroza. Hàm lƣợng vitamin C trong quả là 40-90% mg/100g tƣơi. Các
loại axit hữu cơ chứa trong thịt quả là 0,4-1,2%, trong đó có nhiều axit có hoạt tính
sinh học cao. Trong quả còn chứa các chất khoáng và dầu thơm. Tinh dầu đƣợc cất từ
vỏ quả, lá, hoa đƣợc dùng trong công nghiệp thực phẩm. Đặc biệt là chanh yên, một
tấn quả có thể đạt đƣợc 67 lít tinh dầu, tinh dầu ca quýt có giá trị khá cao trên thị
trƣờng quốc tế.
Ở nhiều nƣớc trên thế giới, từ những thời xa xƣa, ngƣời ta đã biết dùng các
thuộc chi Citrus làm thuốc chữa bệnh. Ở thế kỷ thứ XVI, các thầy thuốc Trung Quốc,

Năm 1995, diện tích trồng cây ăn quả trong cả nƣớc là 346.400 ha trong đó
ĐBSCL 175.000 ha (50,7%), trung du miền núi Bắc Bộ 47.600 ha (13,7%), ĐBSH
33.800 ha (9,8%), miền Đông Nam Bộ 32.700 ha (9,5%), khu IV cũ 27.400 (7,9%),
duyên hải miền Trung 20.600 ha (6,9%), Tây Nguyên 8.600 ha (2,5%).
Theo Tổng cục thống kê năm 1996, vùng ĐBSCL đứng đầu về sản lƣợng cũng
đứng hàng đầu chiếm tỷ trọng 49, 05%. (Trần Thế Tục, 1998).
2.1.4. Tình hình sản xuất cam quýt trên thế giới
Trong những năm nửa sau thế kỷ XX, sản xuất cam quýt trên thế giới tăng
nhanh. Theo tài liệu của Tổ chức lƣơng thực và nông nghiệp của Liên hợp quốc (FAO)
5

trong vòng 20 năm (từ năm 1975 đến năm 1995), sản lƣợng cam quýt trên thế giới
tăng từ 22 triệu tấn lên đến 48 triệu tấn, tăng cao nhất là cam, quýt đỏ rồi đến chanh
yên, bƣởi chùm và chanh. Trong vòng 15 năm tính từ năm 1970 đến năm 1984, sản
lƣợng cam tăng bình quân là 51%, quýt 7,5%, chanh 4,7%, bƣởi chùm là 4,3%/ năm.
Tổng sản lƣợng cam quýt trên thế giới trong những thập niên 90 của thế kỷ XX bình
quân hàng năm là 60-70 triệu tấn với tổng diện tích là 2,5 triệu ha, tập trung ở các
nƣớc có khí hậu á nhiệt đới và một phần nhiệt đới ở các vĩ độ cao hơn 20-22
o
C bắc và
nam bán cầu.
Hiện nay có 75 nƣớc trồng cam quýt trên thế giới đƣợc chia thành 4 khu vực :
Châu Mỹ, các nƣớc Địa Trung Hải, các nƣớc Châu Phi và các nƣớc Châu Á. Những
nƣớc trồng nhiều cam quýt nhất là Mỹ 9,6 triệu tấn /năm, Braxin 7,2 triệu tấn/ năm,
Tây Ban Nha 1,7 triệu tấn / năm.
Nhật Bản cung cấp10% sản lƣợng cam quýt trên thế giới với 2,7 triệu tấn vào
những năm 20 của thế kỷ XX, trong đó chủ yếu là quýt Unshiu, loại quýt này chiếm

cây bƣởi vết bệnh khoảng 8mm.

Ở quả vết bệnh cũng tƣơng tự nhƣ ở lá.Vết bệnh rắn xù xì màu nâu ở giữa lõm,
mép ngoài nổi gờ lên, ở giữa vết bệnh mô chết rạn nứt. Toàn thể chiều dày của vỏ quả
có thể bị loét nhƣng không bao giờ vết loét ăn sâu vào ruột quả, bệnh nặng có thể làm
cho quả biến dạng ít nhiều.
Hình 2.1 Triệu chứng bệnh loét
trên lá bƣởi Da Láng

Hình 2.2 Triệu chứng bệnh loét
trên trái bƣởi Da Láng 7


năm khác.
Theo Wolf (1916) vi khuẩn bệnh loét cam có thể tồn tại qua đông trong đất,
nhƣng Pltier và Frederich lại cho rằng vi khuẩn không thể tồn tại qua đông ở trong đất
hoặc trong lá rụng. Lee (1920) và Fulton (1925) cho rằng vi khuẩn bệnh loét cam
không đấu tranh đƣợc với tập đoàn vi khuẩn khác nên dễ dàng chết trong đất. Loucks
Hình 2.3 Triệu chứng bệnh loét
trên cành bƣởi Da Láng 8

(1930) đã chứng minh rằng vi khuẩn ở trong đất không vô trùng chỉ sống đƣợc 6-13
ngày nhƣng trong đất vô trùng có thể tồn tại đƣợc 150 ngày. Theo Rao và Hingorant ở
đất vô trùng, vi khuẩn sống đƣợc 52 ngày còn ở đất không vô trùng chỉ sống đƣợc 17
ngày. Cũng từ hai tác giả trên thời gian sống của vi khuẩn ở những lá cây chết rụng
xuống đất khoảng 6 tháng. (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999).
Vào mùa mƣa trời ẩm ƣớt vi khuẩn từ trong vết bệnh cũ hoạt động, truyền
lan đi trong mƣa, gió hoặc côn trùng, chim. Vi khuẩn cũng có thể truyền dễ dàng
qua quần áo, nông cụ. Vi khuẩn rơi trên quả, lá, cành sẽ xâm nhập qua vết thƣơng,
khí khổng.
Đặc điểm xâm nhiễm gây bệnh: bệnh phát sinh do 3 yếu tố cơ bản tác động lẫn
nhau quyết định là “cây ký chủ- vi khuẩn gây bệnh-điều kiện ngoại cảnh môi trƣờng”
(Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999).
Dựa triệu chứng bệnh và sự biến chủng của vi khuẩn có các loại bệnh loét sau:
- Loại Asiatic (Canker A), do Xanthomonas axonopodis pv.citri, bắt nguồn từ
châu Á, phân bố rộng, khả năng gây bệnh rất mạnh.
- Loại B, do Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii , bắt nguồn từ Nam Mỹ,

sinh loài (Baldwin và ctv., 1995; Hershkovitz và ctv., 1996, 1999) cũng nhƣ các
nghiên cứu về địa lý sinh vật (biogeographic) (Baldwin, 1993; Suh và ctv., 1993;
Hsiao và ctv., 1994; Dubouzet và Shinoda, 1999). (Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005).
2.3.2. Vùng rDNA-ITS trên Xanthomonas ssp.
Phân tích mối quan hệ loài dựa trên vùng 16s-23s rDNA bằng cách thiết kế
cặp primer Xan1330 và Xan332 dựa trên vùng gen 16s-23s rDNA ở Xanthomonas
sp. Sản phẩm PCR thu đƣợc là đoạn có kích thƣớc 1,1 kb và đƣợc xác định là
Xanthomonas sp. (Edmilson R Gonealves và Yoko. B. Rosato, 2002). (Hình 2.3,
Hình 2.4)
2.4. Sơ lƣợc về hrpW gen
Sự tƣơng tác giữa ký sinh với ký chủ phụ thuộc vào hệ thống protein . Đặc biệt
đối với tƣơng tác vi khuẩn gram âm gây bệnh thực vật với cây ký chủ. Loại protein
này đƣợc mã hóa bởi hrp gen. Trên Xanthomonas axonopodis pv.citri ngƣời ta xác
định các loại hrp gen: hrpG, hpaA, hpaB, hrcV, hrpB1, hrpD6, hrpB2, hrcU, hrcW,
hrpB4, hrcN. Trên X. a. pv.citri các hrp gen này nằm thành cụm trừ hrpW. (Marcos
C. Alergria và ctv, 2004). Dựa vào đặc tính của hrp gen là đặc trƣng cho từng loài gây
bệnh nên ngƣời ta thiết kế primer chuyên biệt cho phản ứng PCR phát hiện nhanh,
10

chính xác loài gây bệnh. Phƣơng pháp phát hiện nhanh bằng primer chuyên biệt này
nhanh, chính xác hơn các phƣơng pháp nuôi cấy.

Xan 322 5’ GGTTCTTTTCACCTTTCCCTC 3’

11

Ngƣời ta dựa vào trình tự hrpW gen của X. a. pv. citri (Genbank Accession No.
AE008923) thiết kế cặp primer XACR, XACF chuyên biệt phát hiện nhanh chính nó.
Sản phẩm PCR thu đƣợc là đoạn có kích thƣớc 561 bp (Dong Suk Park và ctv, 2006)
XACR 5’CGTCGCAATACGATTGGAAC 3’
XACF 5’CGGAGGCATTGTCGAAGGAA 3’
2.5. Những cứu về bệnh loét cam quýt trên Thế Giới và Việt Nam
2.5.1. Trên Thế Giới
Năm 2002, Edmilson R.Goncalves và ctv đã tiến hành phân tích mối quan hệ di
truyền giữa 17 loài Xanthomonas sp. bằng thực hiên phản ứng PCR và đọc trình tự
sản phẩm PCR.Phản ứng đƣợc thực hiện với cặp mồi Xan1330 và Xan332 đƣợc thiết
kế trên đoạn 16s-23s rDNA ITS.
Năm 2003, C. J. Vernière và ctv đã nghiên cứu sự phát triển và biểu hiện triệu
chứng bệnh của X. a. pv. citri trên cây có múi. C. J. Vernière và cộng sự đã kết luận
rằng để giảm bệnh loét nhà nông phải hạn chế tạo vết thƣơng cho cây, sự tăng trƣởng
quá nhiều chồi non và sự tăng trƣởng của quần thể X. a. pv. citri. Hệ thống chắn gió là
biện pháp hạn chế sự lan tràn bệnh hiệu quả nhất. Các tác nhân sinh học khác nhƣ ấu
trùng của côn trùng chít hút cũng là phƣơng tiện truyền bệnh nguy hiểm. Khả năng
nhiễm bệnh của ký chủ có liên quan đến giai đoạn phát triển của cây.
Năm 2003, Jung-Gun- Kim và ctv, đã mô tả đặc tính của vùng gây bệnh hrp của
X. a. pv. glycines Vùng này gồm vùng hrp gen, vùng hcr gen và vùng hca gen.Trong

a) Khả năng phát triển trong môi trƣờng YS ở 35
o
C trong 10-12 ngày.
b) Kiểm tra sự tạo nhầy, màu sắc của khuẩn lạc trên môi trƣờng GYCA hoặc
YDC trong 2-3 ngày.
c) Kiểm tra khả năng phân hủy protein: là thử nghiệm khả năng phân hủy
casein trong dịch sữa có chứa chất chỉ thị bromcresol purple đã khử trùng.
Dịch sữa và khuẩn đƣợc ủ 27
o
C quan sát phản ứng phân hủy.
d) Kiểm tra thủy phân asculin: phản ứng dƣơng tính khi dịch đổi màu nâu
tối (môi trƣờngYS lỏng + ferric ammonium citrate 0,05% và asculin 0,1%,
pH 6,8).
e) Kiểm tra khả năng thủy phân gelatin.
f) Kiểm tra khả năng tạo urease.
g) Kiểm tra tạo axit từ carbohydrates.

13

4. Kiểm tra tính gây bệnh
Khẳng định độc tính dòng phân lập đƣợc bằng cách chủng nhân tạo. Ký chủ
đƣợc chủng hoàn toàn là cây sạch bệnh. Tạo vết thƣơng trên cây ký chủ. Sau đó nhỏ
dòng vi khuẩn đã kiểm tra các bƣớc trên lên vết thƣơng. Đặt cây ký chủ đã chủng vào
điều kiện tối ƣu cho bệnh phát triển. Thông thƣờng thì ở nhiệt độ 27
o
C-30
o