Xác định kiểu gen virut viêm gan C trong
huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ
thuật sinh học phân tử Real time – PCR

Phương Thị Hà

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn Thạc sĩ ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40
Người hướng dẫn: TS.BS. Nguyễn Văn Tiến
Năm bảo vệ: 2011

Abstract: Trình bày đặc điểm sinh học virut viên gan C (HCV), genotype HCV, bệnh
học viêm gan virut C và các kỹ thuật real-time PCR. Phân tích những mẫu huyết thanh
và các bệnh nhân đã xác định anti HCV dương tính đến xét nghiệm tại Khoa Truyền
nhiễm bệnh viện Bạch Mai từ tháng 01/ 2011 đến tháng 01/2012. Đưa ra kết quả
nghiên cứu: tỷ lệ bệnh nhân chuẩn đoán viêm gan C theo giới tính; tỷ lệ bệnh nhân
chuẩn đoán viêm gan C theo mạn; mối tương quan giữa kết quả định lượng với kết quả
định type; xác định lại kiểu gen type 1 bằng phương pháp giải trình tự gen
(Sequencing) trên đoạn NS5B.

Keywords: Vi sinh vật học; Virus viêm gan C; Kiểu gen; Sinh học phân tử

Content
ĐẶT VẤN ĐỀ
Sau khi xác định được người dương tính với anti-HCV, Bác sĩ trước khi cho chỉ đinh điều
trị phải làm xét nghiệm hai yếu tố quan trọng có vai trò tiên lượng cho thành công cũng như
thời gian điều trị cần thiết là định lượng số lượng siêu vi trong máu (HCV-ARN) và định kiểu
gen của siêu vi gây viêm gan C (HCV Genotypes) Để xác định được genotypes HCV thì ngày
nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là chuyên ngành công nghệ sinh học
phân tử đã phát minh nhiều kỹ thuật để xác định kiểu gen HCV. Trên thế giới có nhiều công
ty: Bayer, Beckman Coulter, QIAgen, Roche… đã cho ra đời các bộ kit xác định genotypes

Genome của HCV có một lõi chứa vật liệu di truyền là một sợi ARN có tính phân cực
dương, bao quanh bởi một màng protein có chức năng bảo vệ tạo hình đa diện đều và gói lại
bởi màng lipid từ nguồn của tế bào gan, kích thước của một chuỗi đơn ARN (+) là 9,6 kb.
Giống như các chuỗi ARN dương của các loại virut khác, tổ chức genome của virut viêm gan
C cũng mang vai trò như một ARN thông tin (mARN) truyền đạt thông tin di truyền cho
protein của virut [17,40,47].
Mà ng vỏ
ARN virus
Mà ng vỏ
glycoprotein
Core

3
Tổ chức Genome của HCV được chia làm hai vùng
Vùng cấu trúc mã hóa cho các protein cấu trúc gồm:
- Gen C mã hóa cho protein nuclecapsit p22 làm nhiệm vụ gắn với ARN để tạo
nuclecapsit.
- Gen E1 mã hóa cho glycoprotein vỏ ngoài p33.
- Gen E2 mã hóa cho protein vỏ ngoài gp 70.
Vùng không cấu trúc mã hóa cho các protein không cấu trúc bao gồm:
- Gen NS2 mã hóa cho protein gắn vào màng (p23).
- Gen NS3 mã hóa cho proteaza và helicaza (p72).
- Gen NS4 được chia thành NS4A mã hóa cho protein p10 và NS4B mã hóa cho protein
p27.
- Gen NS5 được chia thành NS5a mã hóa cho replicaza và NS5b mã hóa cho ARN-
Polymeraza phụ thuộc ARN cần cho quá trình sao chép.
Phân tử ARN dạng mạch thẳng có chứa một đơn khung mở (ORF- open reading frame),
mã hóa cho một tiền chuỗi protein với chiều dài khoảng 3000 gốc amino axit (Hình 1.3).
Trong quá trình virrut sao chép chuỗi protein này sẽ được kích hoạt bởi enzyme virut giống
như tế bào chủ trong ba protein cấu trúc (gồm nhân lõi-core, E1,E2) và bảy protein không cấu

1.2. Genotype HCV

5
HCV là một virus có bộ gen là ARN, trong chu kỳ nhân đôi của virus phải sử dụng men
RNA polymerase, mà men này không có khả năng sửa sai trong quá trình tổng hợp ARN, từ
đó làm cho bộ gen của virus rất đa dạng nên người ta đã phân virus thành nhiều loại (type)
khác nhau[7,50].
Tiến hành so sánh đối chiếu chuỗi nucleotit của các chủng virut thu nhận được từ các
bệnh nhân nhiễm bệnh với các nhóm bệnh khác nhau của quá trình lây nhiễm tại các vùng
miền địa lý khác nhau người ta đã phát hiện thấy sự tồn tại của ít nhất là 06 nhóm gen chính
bao gồm type 1, type 2,type 3 type 4,type 5 và type 6[12,39]. Khi tính toán mức trung bình
trên toàn bộ genome hoàn chỉnh, khi đó sự khác biệt về các tâm nucleotit là 30- 35% với sự
biến đổi nhỏ trong các vùng xác định như là glycoprotein E1 và E2 mà tại đó chuỗi của gen
nhân và một số gen không có cấu trúc như NS3 thì có sự bảo toàn cao hơn. Khả năng khác
nhau của các chuỗi ở mức thấp nhất giữa các genotype được phát hiện thấy trong 5’ NCR, tại
đó chuỗi riêng lẻ và cấu trúc ARN thứ cấp là cần thiết cho quá trình sao chép và chức năng
chuyển hóa[44,47].
Mặc dù có sự đa dạng về các chuỗi HCV, tất cả trình tự bổ sung và kích thước trên đoạn
gen là có sự đồng nhất. Tuy nhiên trái ngược với quan sát chung là sự biến đổi của chuỗi trình
tự mã hóa ở cả hai vị trí khung đọc và kích thước của protein là không có sự bảo tồn cao với
kiểu gen. Điều này trái ngược với tính chất bảo tồn tiến hóa của rất nhiều bản sao HCV, đồng
ý với ý kiến này cho rằng có khả năng gen này là sản phẩm sinh ra từ sự nhân đôi của ARN có
sự biến đổi codon thứ ba của gen lõi[42,44].

6

Hình 1.6 : Sự phân bố của các kiểu gen [44].

vực công nghiệp hóa ở Châu Âu
Kiểu gen 2 [2a,2b,2c] tìm thấy
chủ yếu ở các nước vùng Địa
Trung Hải và viễn Đông

7
gen 6 sự lưu hành ở khu vực Đông Á là phổ biến. Phân tích ở mức độ phân tử cho thấy rằng
sự có mặt của các kiểu gen này có thời gian lưu hành tại các khu vực địa lý tương ứng ít nhất
vài thế kỷ [42,44].
Kiểu gen 6 là một ví dụ nổi bật của sự đa dạng HCV trong vùng lưu hành. Thật vậy, kiểu
gen HCV được phân lập đầu tiên từ Đông Á rất khác nhau mà ban đầu các nhà nghiên cứu
phân loại là kiểu gen 7,8,9 và 11[42]. Những chủng này khi được phân loại như là phân nhóm
của kiểu gen 6. Lây nhiễm kiểu gen 6 là một con số đáng kể trong vùng dịch tễ: tổ chức WHO
xác định có 62 triệu người bị nhiễm trong khu vực Tây Thái Bình Dương, chiếm 1/3 lây
nhiễm các kiểu gen trên toàn thế giới [42]. Kiểu gen 6 phân lập đã thu được từ các cư dân của
Thái Lan, Ấn Độ, Campuchia, Lào, Myanmar, Việt Nam, Trung Quốc, Hồng Kông và
Indonesia [42,44]. Sự lưu hành của HCV trong cộng đồng có sự thay đổi giữa các nước Đông
Á, từ khoảng 0,5% tại Singapore và Hồng Kông, khoảng 6% tại Việt Nam và Thái Lan [42]
và vượt quá 10% tại Myanma, tỷ lệ báo cáo tại Trung Quốc là khoảng 2-3% xấp xỉ khoảng 30
triệu người [42]. Tất nhiên,không phải nhiễm HCV ở Đông Á là do kiểu gen 6 và sự phân bố
kiểu gen HCV có thể thay đổi giữa các nước trong khu vực Đông Á.
Các genotype của HCV có sự khác nhau về độc lực, khẳ năng gây bệnh và khả năng đáp
ứng điều trị bằng interferon (genotype 1 đáp ứng thấp hơn các genotype khác: 18,1% so với
54,9%)[2]
Hậu quả về tính đa dạng gen của HCV:
+Làm virut có khả năng né tránh đáp ứng miễn dịch của vật chủ dẫn đến tỉ lệ nhiễm HCV
mạn cao (>80%)
+ Sau khi khỏi bệnh, cơ thể không có miễn dịch bảo vệ và vẫn có nguy cơ bị tái nhiễm
+ Việc nghiên cứu sản xuất vacin phòng bệnh rất khó khăn hiện chưa có vacin (do thiếu
hệ thống nuôi cấy tế bào thích hợp, do HCV đột biến gen tạo ra chủng virut mới)

3.1.2. Tỉ lệ bệnh nhân chẩn đoán viêm gan C mạn
3.2. Tỉ lệ kiểu gen của HCV bằng kỹ thuật RT-PCR
3.2.1. Mối tương quan giữa kết quả định lượng với kết quả định type
3.2.2. Tỉ lệ kiểu gen trong 228 bệnh nhân được xác định genotype
Bảng 3.4 Tỉ lệ kiểu gen HCV
Kiểu gen
HCV
Type 1
Type 2
Type 3
Type 6
Không xác
định đƣợc
Tổng
Số mẫu
151
5
0
70
2
228

Tỉ lệ %
66.23%
2.19%
0%
30.7%
0.88%
100%



10
Kiểu gen
HCV
Type 1
Type 2
Type 3
Type 6
Không xác
định đƣợc
Tổng
Số mẫu
151
5
0
70
2
228

Tỉ lệ %
66.23%
2.19%
0%
30.7%
0.88%
100% Qua bảng 3.4 ta thấy rằng trong số 228 mẫu huyết thanh được định genotype thì tỉ lệ type
1 chiếm nhiều nhất là 151 mẫu chiếm 66.23%, sau đó là type 6 gồm 70 mẫu chiếm 30.7% tỉ

Đối với hệ mồi và mẫu dò trên vùng 5’NC của HCV thiết kế thí nghiệm sử dụng RNA
chứng dương là HCV genotype 1 được đưa vào hỗn hợp cho phản ứng revers transcription
RT- PCR chứa các probe đặc trưng cho HCV genotype 1,2,3 và 6. Việc bố trí thí nghiệm cũng
được tiến hành tương tự cho các genotype còn lại. Kết quả chỉ có hỗn hợp chứa mẫu dò Probe
1 đặc trưng cho HCV genotype 1 mới cho tín hiệu dương tính. Kết quả tương tự cho các
genotype còn lại (Hình 3.6)

HCV genotype 1
HCV genotype 3
HCV genotype2
HCV genotype 6
Chứng âm

Hình 3.6 Kết quả
khảo sát khả năng
khuếch đại của mồi
và mẫu dò trên vùng 5’NC của HCV

12
Hình 3.6 cho thấy các phản ứng nếu có các kiểu gen tương ứng với các mẫu dò đặc trưng
thì các tín hiệu huỳnh quang vượt trên tín hiệu nền, các mẫu chứng âm (được thiết kế với các
thành phần tương tự cho phản ứng real-time PCR và real-time RT PCR) có tín hiệu huỳnh
quang thấp hơn tín hiệu nền.
Tuy nhiên trong 228 bệnh phẩm xác định genotype HCV có 59 trường hợp kết quả cho
hai tín hiệu dương tính đặc trưng cho HCV genotype 1 và 6 (Hình 3.7).
Tổng
16
11
3
Tín hiệ u mẫu
dò type 6

Tín hiệ u mẫu
dò type 1
Tín hiệ u mẫu
dò type 2
Tín hiệ u mẫu
dò type 3 13

Tỉ lệ %
53.33
36.67
10.0 Trong 30 mẫu giải trình tự gen có 16 mẫu huyết thanh là type 1 và 11 mẫu huyết thanh
xác định là type 6 và có 3 mẫu là không giải được trình tự gen, không chỉ xác định type mà
giải trình tự gen còn xác định đến subtype. Như vậy có 11 mẫu huyết thanh định type bằng
phương pháp RT- PCR dùng taqman probe gắn huỳnh quang FAM phát hiện genotype HCV
cho tín hiệu dương tính với genotype 1 còn phương pháp giải trình tự gen cho kết quả là type
6, trong đó có 2 mẫu là type 6k, 6 mẫu là type 6e, 1 mẫu là type 6f và 2 mẫu là type 6h (Bảng
3.7 ).

pháp Real-time PCR với phương pháp giải trình tự gen là 11/27 mẫu bằng 40,74%.
Như vậy định type bằng phương pháp Real-time PCR xét về mặt kinh tế thì phù hợp với
đa số điều kiện của bệnh nhân, tuy nhiên không xác định được subtype và tỉ lệ nhầm lẫn giữa
type 1 và type 6 là 40,74% vì vậy sẽ ảnh hưởng đến kết quả điều trị của bệnh nhân,do các
genotype HCV có sự khác nhau về độc lực, khả năng gây bệnh và khả năng đáp ứng điều trị
và genotype 1 thường đáp ứng thấp hơn với các genotype khác (Genotype 1 thường điều trị
trong vòng 48 tuần còn các genotype khác điều trị trong 24 tuần). Do đó bệnh nhân khi đã xác
định là type 1 bằng phương pháp RT- PCR và có kết quả định lượng >10
3
copies/ml nên kiểm
tra lại bằng phương pháp giải trình tự gen.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN
1. Qua kết quả nghiên cứu định genotype HCV bằng kỹ thuật sinh học phân tử Real-time
PCR cho tỉ lệ genotype 1 là cao nhất chiếm 66,23%, tiếp đó là type 6 chiếm tỉ lệ 30,7%, type
2 có tỉ lệ thấp nhất là 2,19%, type 3 không có trong 228 trường hợp nghiên cứu
2. Lấy ngẫu nhiên 30 mẫu đã xác định là genotype 1 bằng kỹ thuật Real-time PCR giải
trình tự gen có 16 mẫu huyết thanh là type 1trong đó có 9 mẫu là type 1a và 7 mẫu là type 1b ,
có 11 mẫu huyết thanh xác định là type 6 trong đó 2 mẫu là type 6k, 6 mẫu là type 6e, 1 mẫu
là type 6f và 2 mẫu là type 6h . Ta thấy rằng tỉ lệ nhầm lẫn giữa type 1 và type 6 trong 30
mẫu định type bằng phương pháp Real-time PCR với phương pháp giải trình tự gen là
40,74%, tuy nhiên khi nồng độ virut thấp không làm được giải trình tự gen.

KIẾN NGHỊ:
1. Vẫn có thể dùng kỹ thuật Real-time PCR để định type khi nồng độ virut thấp.
2. Khi đã xác định là type 1 bằng phương pháp Real-time PCR và có kết quả định lượng
>10
3
copies/ml nên kiểm tra lại bằng phương pháp giải trình tự gen (Sequencing).

pp.2436-2441.
14. Batey R.G. (2007), “ Controversies in and challenges to our understanding of hepatitis C”,
World Journaly Gastroenterology,13(31), pp.4168-4176.
15. Barth H., Schafer C., Adah M.I., Zhang F., Linhardt R.J., Toyoda H., Toyoda A.K., Toida T.,
Kuppevelt T.H., Depla E., Weisackev F.V., Blum H.E., Bacmert T.F. (2003), “ Cellular
Binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparin sulfate”,
The Journal of Biologycal chemistry, 278 (42), pp. 41003-41012.

16
16. Blanchard E., Blouzard S., Goueslain L., Wakita T., Dubuisson J., Wychowski C., Rouille Y.
(2006), “ Hepatitis C virus entry depends on clathrin-mediated endocytosis”, Journal of
Virology, 80(14), pp.6964-6972.
17. Branch A.D., Stump D.D., Gutierrez J.A., Eng F., Walewski J.L. (2005), “ The hepatitis virus
alternate reading frame (ARF) and its family of novel products: the alternate reading frame
protein/F-protein, the double-frameshift, and others”, Seminars in liver disease 2005, 25(1),
pp.105-117
18. Donahue J.G., D.V.M., Munoz A., Paul M., Ness M.D., Donald E., Broun J.R., David H., Yawn
M.D., Hugh A., McAllister J.R., Bruce A., Rettz M.D. (1992), “ The declining risk of post-
transfusion hepatitis C virus in fection”, The new England Journal of Medicine, 327(6),
pp.369-373.
19. Duvet S., Beeck A.O.D., Cocquerel L., Wychowski C., Cacan R., Dubuisson J. (2002), “
Glycosylation of the hepatitis C virus envelope protein E1 occurs posttranslationally in a
mannosylphosphorylclolichol-deficient CHO mutant cell line”, Insttutde Biologie delille/
Instiut Pasteur delille, BP447,59021 LILLE Cedex, France.
20. Esfahani S.N., Shahhosseing M.H., Yaghmai P., Praivar K., Moslemi E., Amini H.K. (2010), “
Rapid and simple detection of Hepatitis C virus by reverse transcriptase-loop-mediated
isothermal amplification method”, African Journal of Microbiology Research, 4(23), pp.2580-
2586.
21. Friebe P., Bartenschlager R. (2002), “Genetic analysis of sequences in the 3’ nontranslated
region of hepatitis C virus that are important for RNA replication”, Journal of Virology,

31. Hsu M., Zhang J., Flint M., Logvinoff C., Cheng-Mayer C., Rice C., McKeating J.A. (2003), “
Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retro viral
particles”, 1230 York Avenue, New York.
32. James G., Donahue Jr., David H., Yawn M.D., Hugh A., McAllister J.R., Bruce A., Rettz M.D.,
Kenrad E. (1992), “The declining risk of post-transfusion hepatitis C virus infection”, The
new England Journal of Medicine, 327(6), pp.369-373.

33. Kapadia S.B., Barth H., Baumert T., Mekeating J.A., Chisari F.V. (2007), “ Initiation of
hepatitis C virus infection is dependent on cholesterol and cooperativity between CD81 and
scavenger receptor B type 1”, Journal of Virology, 81(1), pp.374-383.
34. Kolykhalov A.A., Feinstone S.M., Rice C.M. (1996), “ Identification of a highly conserved
sequence element at the 3’ terminus of hepatitis C virus genome RNA”, Journal of Virology,
70(6), pp. 3363-3371.
35. Marshall D.J., Heisler L.M., Lyamichev V., Murvine C., Olive D.M., Ehrlich G.D., Neri B.P.,
deArruda M. (1997), “ Determination of hepatitis C virus genotypes in the United States by
Cleavase fragment length polymorphism analysis”, Journal of Clinical Microbiology, 35(12),
pp.3156-3162.

18
36. Martell M.,Gomez J., Esteban T., Sauleda S., Quer J., Cabot B., Esteban R., Guardia J. (1999), “
High-throughput Real-time reverse transcription – PCR quantitation of hepatitis C virus
RNA”, Journal of Clinical Microbiology, 37(2), pp.327-332.
37. Martial J., Morice Y., Albel S., Cabie A.,Rat C., Lombard F., Edouard A., Bierre-louis S.,
Chout R., Gordien E., Deny P., Cesaire R. (2004), “ Hepatitis C virus (HCV) genotypes in the
Caribbean island of martinique: evidence for a large radiation of HCV for a recent
introduction from Europe of HCV-4”, Journal of Clinical Microbiology, 42(2), pp.784-791.
38. McOmish F., Yap P.L., Dow B.C., Follett E.A.C., Seed C., Lin C., Lai C., Leong S., Medgyesi
G.A., Hejjas M., Kiyokawa H., Fukada K., Cuypers T., Saeed A.A., Al-rasheed A.M. (1994),
“ Geographical distribution of hepatitis C virus genotypes in blood donors : an international
collaborative survey”, Journal of Clinical microbiology, 32(4), pp.884-892.

50.
51.