BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ QUỐC PHÒNG

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.10 BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

TÊN ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH NHANH VI
KHUẨN LAO VÀ LAO KHÁNG THUỐC
BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
Mã số: KC.10.15/06-10

Cơ quan chủ trì đề tài: Học viện Quân Y
Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thái Sơn


Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ

Hà Nội – 2010
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. VI KHUẨN LAO VÀ BỆNH LAO 3
1.1.1. Vi khuẩn lao 3
1.1.2. Bệnh lao 9
1.2. DỊCH TỄ PHÂN TỬ CỦA VI KHUẨN LAO VÀ LAO KHÁNG THUỐC 21
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO 26
1.3.1. Các phương pháp truyền thống 26
1.3.2. Các phương pháp miễn dịch 28
1.3.3. Các phương pháp sinh học phân tử 29
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO KHÁNG
THUỐC 35
1.4.1. Phương pháp xác định kiểu hình 35
1.4.2. Phương pháp xác định kiểu gen 38
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PH
ƯƠNG PHÁP 47
2.1.
VẬT LIỆU 47
2.1.1. Các chủng vi khuẩn lao, mẫu bệnh phẩm và vector 47

THUỐC 71
3.1.1. Thu thập các chủng vi khuẩn lao trên toàn quốc 71
3.1.2. Đặc điểm phân tử vi khuẩn lao ở Việt Nam 72
3.1.3. Đặc điểm phân typ vi khuẩn lao ở Việt Nam 76
3.1.3.1. Mô hình phân tử chủng lao khu vực miền Bắc (spoligotype) 77
3.1.3.2. Mô hình phân tử chủng lao khu vực miề
n Trung 79
3.1.3.3. Mô hình phân tử chủng lao khu vực miền Nam 81
3.1.4. Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao kháng thuốc ở Việt Nam 83
3.1.4.1. Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao nhạy cảm thuốc 83
3.1.4.2. Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao kháng đơn thuốc 86
3.1.4.3. Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao kháng đa thuốc 89
3.1.4.4. Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao siêu kháng thuốc 91
3.1.5. Dịch tễ
học phân tử của vi khuẩn lao Việt Nam 92
3.1.5.1. Phân bố dòng theo khu vực nghiên cứu của vi khuẩn lao Việt Nam 92
3.1.5.2. Phân bố dòng theo đặc điểm kháng thuốc của vi khuẩn lao Việt Nam 95
3.1.5.3. Phân bố dòng theo đặc điểm kháng thuốc và theo khu vực của vi khuẩn
lao Việt Nam 97
3.1.5.4. Phân bố chủng lao Việt Nam theo tuổi và giới tính bệnh nhân và theo khu
vực 100
3.1.5.5. Phân bố chủng lao Việt Nam theo tuổi bệnh nhân và mức độ kháng thuốc 103
3.1.5.6. Mối liên quan giữa phân bố dòng vi khuẩn lao Việt Nam và tuổi bệnh
nhân 105
3.1.5.7. Mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lao Việt Nam theo dòng 108
3.1.5.8. Mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lao Việt Nam theo dòng và theo khu
vực 110
3.1.6. Đặc điểm đột biến ở các gen liên quan kháng thuốc của vi khuẩn lao ở Việt
Nam 111
3.1.6.1. Phát hiện đột biến trên gen katG 112

4.1. Dịch tễ học phân tử vi khuẩn lao và lao kháng thuốc 183
4.2. Xây dựng được một số quy trình chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao và vi khuẩn
lao kháng thuốc 183
4.3. Chế tạo được một số bộ kit chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao và vi khuẩn lao
kháng thuốc 184
CÁC KẾT QUẢ KHÁC 184
KIẾN NGHỊ 184
TÀI LIỆU THAM KHẢO 185

1
MỞ ĐẦU
Lao là một bệnh truyền nhiễm và đã từng được Tổ chức y tế thế giới
(WHO) khuyến cáo về tình trạng khẩn cấp toàn cầu. Vi khuẩn lao
(Mycobacterium tuberculosis) hiện đang gây nhiễm cho khoảng 1/3 dân số thế
giới (hơn 2 tỷ người) và ước tính mỗi năm có khoảng 8 triệu trường hợp
nhiễm mới và 2 triệu người chết [70].
Việt Nam đứng thứ
12 trong số 22 quốc gia có gánh nặng bệnh nhân lao
cao trên thế giới. Một trong những nhân tố góp phần gia tăng bệnh lao là
những khó khăn trong quá trình chẩn đoán. Phát hiện nhanh vi khuẩn lao dựa
vào phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen các mẫu bệnh phẩm nghi lao, nhiều
trường hợp cho âm tính giả khi số lượng vi khuẩn lao ≤ 10
4
vi khuẩn/ml. Nuôi
cấy vi khuẩn lao được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán nhưng trên môi
trường Lowenstein phải mất khoảng 4-8 tuần mới cho kết quả. Trên hệ thống
nuôi cấy cải tiến MGIT, BACTEC mất khoảng 2 tuần, nếu làm kháng sinh đồ
mất thêm ít nhất 2 tuần nữa, do vậy khó đáp ứng yêu cầu giám sát và thanh
toán bệnh lao [62]. Hiện nay, nhờ áp dụng các phương pháp sinh học phân tử
vào chẩn đoán vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng thuốc, kh

về đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở Việt Nam nên không
có cơ sở để sử dụng kit này, hơn nữa giá thành các bộ kít thương mạ
i này
không phù hợp với điều kiện kinh tế Việt Nam. Hiện trong nước chưa có kit
thương phẩm chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc, do vậy việc nghiên cứu và
phát triển kit chẩn đoán lao và lao kháng thuốc ở Việt Nam là cần thiết.
Vì vậy, đề tài này được đặt ra nhằm vào các mục tiêu sau:
1. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng
đa thuốc.
2. Xây dự
ng qui trình xác định nhanh các chủng vi khuẩn lao và lao
kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
3. Xây dựng qui trình chế tạo các bộ kit xác định nhanh các chủng vi
khuẩn lao và lao kháng thuốc ở Việt Nam.

3
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. VI KHUẨN LAO VÀ BỆNH LAO
Bệnh lao là bệnh truyền nhiễm đã xuất hiện hàng nghìn năm nay, nhưng
phải đến ngày 24/3/1882 nhà bác học người Đức- Robert Koch lần đầu tiên
phát hiện ra vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) (vì vậy còn được gọi
là Bacilie de Kock- BK). Đây là một mốc quan trọng trong lịch sử y học bởi
đã tìm ra nguyên nhân của căn bệnh vô cùng nguy hiểm cho cả thế giới vào
thời điể
m đó. Sau này, ngày 24/3 hàng năm được lấy làm ngày phòng chống
lao trên toàn thế giới.
1.1.1. Vi khuẩn lao
1.1.1.1. Giới thiệu vi khuẩn lao
Vi khuẩn lao có tên khoa học là Mycobacterium tuberculosis. Thực chất
tác nhân gây bệnh lao là một phức hợp gồm nhiều loài được gọi chung là

được. Dưới kính hiển vi điện tử trực khuẩn lao có cấu trúc như sau:
- Cấu trúc vách tế bào
Lớp vách của trực khuẩn có vai trò rất quan trọng. Cấu trúc của lớp này
ngoài đảm bảo cho sự tồn tại của trực khuẩn, làm cho trực khuẩ
n bền vững đối
với hiện tượng thực bào, khi xâm nhập vào cơ thể trực khuẩn lao khó bị tiêu
diệt, ảnh hưởng rất lớn đến khả năng gây bệnh của trực khuẩn [38].
Mycobacterium tuberculosis có cấu trúc vách tế bào phức tạp, chia thành
4 lớp, lớp trong cùng là cấu trúc màng có thành phần chủ yếu là các
phospholipid. Các phân tử phospholipid lại bao gồm hai nhóm, nhóm ưa nước
hướng về bên trong và nhóm kị nước hướng về bên ngoài, quay ra phía vỏ
.
Lớp tiếp theo là peptidoglican liên kết với đường arabinose và các phân tử
mycolic acid tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vỏ vi
khuẩn có độ cứng nhất định. Lớp ngoài là lớp được tạo nên bởi sự liên kết
giữa các mycolic acid và các chất lipid phức tạp, đây là lớp tạo nên độc tính
của vi khuẩn lao và có cấu trúc làm tăng khả năng chống thấm nước của thành
vi khuẩn giúp trực khuẩn t
ồn tại lâu với môi trường bên ngoài, chống khả năng
bị huỷ diệt bởi đại thực bào và các tế bào miễn dịch. Lớp ngoài cùng có cấu
trúc peptidoglycolipid, đây là lớp chỉ thấy ở vi khuẩn lao phát triển bên trong
tế bào, nó có tác dụng tăng cường như một lớp áo giáp cho các vi khuẩn nằm
5
trong tế bào chống được các enzyme phân giải từ các lysozyme của tế bào.

thông thường, nhìn bề ngoài trên kính hiển vi điện tử
thể L có dạng hình cầu,
sinh sản theo kiểu nẩy chồi, không thể nuôi cấy ở môi trường thông thường.
Về mặt sinh học thể L chuyển hóa rất ít, hầu như không chịu tác dụng của các
thuốc chống lao. Thể L thực chất có thể là hình thức tồn tại của loại trực
khuẩn lao nằm vùng dai dẳng trong cơ thể, có vai trò quan trọng trong việc tái
phát bệnh lao. Theo dõi hình thể L có thể sẽ giúp cho công tác điề
u trị, có thể
dự đoán khả năng tái phát của bệnh.
* Đặc điểm nuôi cấy
Trực khuẩn lao là vi khuẩn ưa khí bắt buộc, không mọc được ở điều
kiện kị khí. Nhiệt độ thích hợp để mọc là 37
o
C. Hầu như không mọc ở nhiệt
độ dưới 37
o
C hoặc trên 42
o
C.
Trực khuẩn lao rất hiếu khí, phát triển tốt nhất khi pO
2
là 100 mmHg và
pCO
2
là 40 mmHg. Đỉnh phổi và vùng phổi dưới xương đòn hay mắc lao nhất
(pO
2
120-130 mmHg khi đứng) rồi đến thân xương và đầu xương (pO
2
là 100

các gen đáng chú ý với tỷ lệ G+C cao (>80%) duy nhất trong vi khuẩn và thuộc
về họ protein PE và PPE. Những nhóm có G+C thấp (<50%) là các nhóm mã
hóa cho các protein xuyên màng hoặc mã hóa sự tổng hợp polypeptide. Sự khác
biệt này đối với tỷ lệ G+C thấp được giải thích là hậu quả của tính kỵ nước bắt
buộc của các acid amine - là điều cần thiết đối với mọi protein xuyên màng nào
được mã hóa b
ằng các đơn vị mã hóa có tỷ lệ G+C. Bộ gen của vi khuẩn lao có
chứa tới 90,8 % trình tự được dự đoán là có mã hóa cho protein và chỉ có 8 gen
giả (pseudogene - gen không mang thông tin di truyền mã hóa cho protein) [43].
Trong hệ gen của phần lớn các vi khuẩn thường có nhiều operon rRNA (operon
rrn) nằm gần vị trí khởi đầu tái bản. Tuy nhiên hệ gen của vi khuẩn lao chỉ có
duy nhất 1 operon rrn cách vị trí khởi đầu tái bản 1,5Mb. Điều này góp phần lý
giải về tốc
độ sinh trưởng rất chậm của vi khuẩn đặc biệt này [17].
Một trong những đặc tính được quan tâm nhiều nhất của Mycobacterium
tuberculosis là nghiên cứu sự có mặt và phân bố của các trình tự chèn (IS),
trong đó đặc biệt là đoạn IS6110. Thể gen của M. tuberculosis H37Rv có 16
bản sao IS6110 và 6 bản sao IS1081; tuy nhiên chỉ có 95% số chủng vi khuẩn
lao có chứa 4-20 bản sao IS6110. Bộ gen của Mycobacterium tuberculosis
thiếu hệ thống MutS có tác dụng sửa chữa các lỗ
i trong bắt cặp nucleotide. Tuy
8
nhiên sự tái bản ở vi khuẩn lao lại rất chính xác do sự có mặt của gần 45 gen
liên quan đến cơ chế sửa chữa DNA bao gồm cả 3 bản sao của gen mutT mã
hóa cho loại enzyme chịu trách nhiệm cho việc loại bỏ các Guanin bị oxy hóa
trong quá trình tái bản- nguyên nhân gây ra sự bắt cặp sai [32, 34].
1.1.1.3. Phân loại vi khuẩn lao
Trong hệ thống sinh giới, vi khuẩn lao được phân loại như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Actinobacteria

u vaccine phòng lao và đã thành công vào năm 1921 (vaccine BCG-
Bacillus Calmette-Guérin). Đến năm 1944, Waksmann tìm ra kháng sinh chữa
lao đầu tiên là streptomycine, năm 1952, thuốc isoniazid được đưa vào điều trị
lao. Năm 1965, thuốc rifampicin được nghiên cứu thành công và năm 1978, cơ
chế và tác dụng của pyrazynamide được xác định. Những thuốc này cùng với
việc tiêm chủng phòng lao bằng vaccine BCG đã làm thay đổi được tình hình
lao trên thế giới.
Do sự phát minh các thuốc hóa học chống lao khiến việc chữa lao đơn
giản hơn và hiệ
u quả hơn, đồng thời đã phát sinh tâm trạng lạc quan của y
giới, đã làm lãng quên căn bệnh nguy hiểm này. Ngày nay, bệnh lao đang xuất
hiện trở lại và cùng với đại dịch HIV/AIDS trở thành một trong những căn
nguyên gây mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước đang phát
triển.
Năm 1993, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã tuyên bố tình trạng khẩn cấ
p
toàn cầu của bệnh lao và mối hiểm hoạ của nó trong tương lai là bệnh lao kháng
thuốc.
1.1.2.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3
dân số thế giới). Theo số liệu công bố của WHO [73], ước tính trong năm
2006 có thêm khoảng 9,3 triệu người mắc lao mới và 2,4 triệu người chết do
lao. Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các nướ
c có
thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao động.
10
Trong đó, có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh nặng
bệnh lao cao [6].
Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 85%, nhưng tỷ lệ phát
hiện chỉ đạt 44% số bệnh nhân ước tính. Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao

thể là 225/100.000 dân, tỉ lệ tử vong do lao là 23/100.000 dân.
Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh lao
toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách
thức mới là bệnh lao kháng thuốc và Lao/HIV, Nhà nước và Bộ Y tế Việt nam
đã quyết định đưa Chương trình chống lao thành một trong những Chương
trình y tế Quốc gia trọng đi
ểm (Chương trình chống lao quốc gia - CTCLQG)
[7].
Năm 1996, Chương trình chống lao quốc gia với sự hỗ trợ về kỹ thuật
và tài chính của Chính phủ Hà Lan, Hiệp hội chống lao Hoàng gia Hà Lan, Uỷ
ban hợp tác y tế Hà Lan - Việt nam, CTCLQG đã hình thành và xây dựng kế
hoạch phòng chống lao giai đoạn 1996-2000. Đến năm 1999, chiến lược
DOTS (điều trị bằng hoá trị liệu ngắn ngày có kiểm soát trực tiếp) đã được
bao ph
ủ 100% số huyện trên cả nước.
Trong giai đoạn 1997-2002, CTCLQG đã phát hiện được 532.703 bệnh
nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính (so với mục
tiêu của WHO là 70%), CTCLQG đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi
AFB(+) với tỷ lệ khỏi là 92%.
Năm 2002, khu vực Tây-Thái Bình Dương phát hiện 806.460 bệnh nhân
lao các thể, 372.220 bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới. Trong đó, số bệnh nhân
do CTCLQG Việt nam phát hiện chiếm 12% b
ệnh nhân các thể và 15% số
bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới.
Với những kết quả đạt được trong chỉ tiêu phát hiện và điều trị bệnh
nhân, năm 1996, Việt nam là nước đầu tiên ở Châu Á đã đạt được mục tiêu
của WHO. Việt nam đã được WHO và Ngân hàng thế giới đánh giá cao thành
tích đạt được trong mọi hoạt động chống lao. Từ năm 1997, WHO và Hiệp hội
Bài lao và Bệnh phổi Quốc tế
cùng phối hợp với CTCLQG Việt Nam tổ chức

chủng vi khuẩn kháng đa thuốc mở rộng cần phải điều tr
ị trên 2 năm so với từ
6-8 tháng trước đây và chi phí điều trị cũng tăng lên gấp 100 lần.
Tại Việt Nam, theo CTCLQG năm 2006, tình hình kháng thuốc của vi
khuẩn lao tại Việt Nam đang là một vấn đề đáng lo ngại, tỷ lệ kháng thuốc tiên
phát là 30,7% vào loại cao trên thế giới. Tỷ lệ kháng đa thuốc chung là 4%,
13
trong đó tỷ lệ đa kháng thuốc thứ phát là 19.3%, tỷ lệ đa kháng thuốc tiên phát
là 2,7%. Ước tính đến 2015, số ca tử vong do lao khoảng 14.000 [73].
Thuốc kháng sinh đầu tiên dùng để điều trị lao là streptomycin, nhưng
sau vài năm sau khi kháng sinh này được sử dụng thì người ta đã nhận thấy
hiện tượng đề kháng lại streptomycin của vi khuẩn lao. Sau đó các kháng sinh
chống lao khác tiếp tục ra đời: para - aminosalysilic, isoniazid, rifampicin,…
nhưng đều không mang lại hiệu quả
sau một thời gian điều trị nhất định. Khả
năng điều trị thành công có thể đạt 95 - 100 % đối với những bệnh nhân mắc
lao thông thường, trong khi tỷ lệ thành công với bệnh nhân mắc lao kháng
thuốc là 20 - 30 %, thậm chí còn không điều trị được khi mắc lao kháng đa
thuốc và kháng thuốc phổ rộng mặc dù đã dùng kết hợp đến năm loại kháng
sinh điều trị lao. Vì vậ
y, việc phát hiện và ngăn chặn sự lan truyền các chủng
lao đa kháng thuốc là vấn đề quan trọng nhất trong điều trị lao hiện nay.
Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao được định nghĩa là sự giảm mức
mẫn cảm của Mycobacterium tuberculosis trong in vitro làm cho chúng có sự
khác biệt với các chủng dại chưa bao giờ tiếp xúc với thuốc kháng sinh. Trong
các trường hợp lao kháng thuốc cần phải phân biệt:
Lao kháng thu
ốc là những trường hợp vi khuẩn lao kháng với một
trong những thuốc chống lao dòng thứ nhất: isoniazid, rifampin,
pyrazinamide, ethambutol hoặc streptomycin.

trở lên trong khi đó tần số xuất hiện đột biến liên quan đến tính kháng isoniazid
của vi khuẩn lao khoảng 10-7 đến 10-9 còn tần số đột biến kháng rifampicin là
khoảng 10-10. Tính kháng thuốc do sự phát sinh ngẫu nhiên các đột biến liên
quan này được gọi là tính kháng di truyền . Khi không có mặt của thuốc kháng
sinh, các chủng vi khuẩn lao mẫn cảm thuốc phát triển lấn át các chủng kháng
thuốc. Sự có mặt của thuốc kháng sinh trong điều trị đã cung cấp một áp lực chọn
lọc cho các chủng vi khuẩn lao. Các chủng mẫn cảm bị ức chế sinh trưởng, thậm
chí bị tiêu diệt, các chủng kháng thuốc trở thành ưu thế hình thành tính kháng
thuốc thu được, đặ
c biệt là trong các bệnh nhân có chứa một lượng lớn trực
khuẩn lao. Sự lây lan của các chủng kháng thuốc này sang những người khác làm
cho những người này bị nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc ngay từ đầu (tính kháng
thuốc sơ cấp).
15
Tính kháng nhiều loại thuốc khác nhau của vi khuẩn liên quan đến sự có
mặt đồng thời các đột biến ở các gen đặc hiệu. Ví dụ, tính kháng isoniazid của
vi khuẩn lao có tần số là từ 10
-7
đến 10
-9
, sự xuất hiện các đột biến liên quan
đến tính kháng rifampicin có tần số khoảng 10
-10
, và sự xuất hiện các đồng
thời các đột biến liên quan đến tính kháng cả 2 loại thuốc này có tần số
khoảng 10
-14
. Tuy nhiên, trong một quần thể vi khuẩn chỉ kháng isoniazid, các
đột biến ngẫu nhiên phát sinh có thể dẫn đến tính kháng rifampcin ở một vài cá
thể. Khi bệnh nhân được điều trị bằng tổ hợp isoniazid và rifampicin, các chủng

16s rRNA
60
<10
Fluoroquinolone
gyrA DNA gyrase >90
Pyrazinamide
pncA Amidase 70-100
Ethambutol
emb CAB EmbCAB 69

- Kháng rifampicin: Rifampicin (RIF) được đưa vào sử dụng trong điều
trị chống lao vào đầu những năm 1970 và là một thành phần rất quan trọng
trong điều trị. Cơ chế tác động của RIF liên quan đến ức chế enzyme RNA
polymerase phụ thuộc DNA, enzyme này là một phức oligomer bao gồm 4
tiểu đơn vị khác nhau (a, b, b9), và được mã hoá bởi các gen rpoA, rpoB,
rpoC, rpoD) có thể xẩy ra một trong hai dạng là core enzyme (a2bb9) và
holoenzyme (a2bb9 plus s).
RIF gắn với tiểu đơn v
ị b của RNA polymerase (rpoB), enzyme chịu
trách nhiệm cho sao chép và biểu hiện của các gen ở mycobacteria, kết quả là
ức chế hoạt động sao chép của vi khuẩn.
Chẩn đoán phân tử của tính kháng rifampin là phù hợp nhất vì các
nghiên cứu chỉ ra rằng tính kháng thuốc là do đột biến ở vùng lõi của gen
rpoB. Các phương pháp phân tử đã được tận dụng bao gồm đọc trình tự tự
động trực tiếp vùng đích đã được khuếch đạ
i của gen rpoB. Khuếch đại vùng
đích bằng PCR tiếp đó là bằng phân tích tính đa hình các sợi đơn (SSCP) và
thử nghiệm có thể thương mại hoá dựa trên khuếch đại vùng đích bằng PCR
sau đó lai mẫu dò thẳng với các đầu dò oligonucleotide (INNO-LiPA Rif. TB
17

nhau của M. tuberculosis, katG mã hoá catalase peroxidase, inhA mã hoá
enoyl acyl carrier protein (ACP) reductase, kasA mã hoá cho b-ketoacyl A C
18
P synthase và ahpC mã hoá cho alkylhydroperoxide reductase. Mặc dù thế,
gần 5-10% các chủng M. tuberculosis kháng isoniazid không có một đột biến
có thể xác định. Tính kháng isoniazid ở mức cao có liên quan đến lâm sàng
chủ yếu là do các đột biến thêm đoạn/ mất đoạn hoặc các đột biến nhầm nghĩa/
vô nghĩa bên trong gen katG. Đối với sự đề kháng INH, đột biến trên gen katG
hay gặp nhất ở vị trí 315 [12, 64]. Sự thay thế Ser315Thr xảy ra ở khoảng 30-
60% ch
ủng kháng sự thay thế này trong gen katG đã chỉ ra trực tiếp là dẫn tới
tính kháng cao với isoniazid. Đột biến S315T được đi kèm bởi sự mất đi vị trí
enzyme giới hạn ở vị trí này. Do đó đột biến nhầm nghĩa có thể được phát hiện
dễ dàng bằng phân tích giới hạn các đoạn được khuếch đại (PCR-RFLP). Sự
kiện và tính lan truyền của đột biến này trong các chủng M. tuberculosis lâm
sàng kháng isoniazid thay
đổi đáng kể phụ thuộc vào vùng địa lý và thành
phần dân tộc của những cá nhân bị nhiễm. Do đó sàng lọc sự thay đổi di
truyền này trong gen katG có thể cung cấp một phương pháp sàng lọc nhanh
cho việc phát hiện các chủng lao M. tuberculosis kháng isoniazid, cung cấp
tính lan rộng cao của đột biến đặc biệt có thể được thiết lập từ một vùng địa lý
xác định.
Đột biến thay thế S315T trên gen katG cũng thường đ
i kèm với biểu hiện
của protein alkyl hydroperoxide reductase (ahpC). Sự biến đổi của 5
nucleotide khác đã được xác định ở vùng promoter của gen ahpC, dẫn tới
bieur hiện quá mức của ahpC và đề kháng INH.
Đột biến xảy ra trên gen inhA sẽ dẫn tới kháng ngay từ đầu với INH và
ethionamide (ETH) [13]. Sáu vị trí đột biến trong cấu trúc của gen inhA liên
quan đến kháng INH đã được xác định là Ile16Thr, Ile21Thr, Ile21Val,

- Streptomycin: Streptomycin là một kháng sinh aminoglycoside được sử
dụng như một thuốc cơ bản để điều trị lao. Thuốc gắn với 16S rRNA ức chế
khởi đầu dịch mã và ảnh hưởng đến tính chính xác của dịch mã trong quá trình
tổng hợp protein. Đột biến liên quan đến tính kháng streptomycin ở M.
tuberculosis đã được xác định trong gen 16S rRNA (rrs) và gen rpsL mã hoá
cho protein S12 của ribosome. Từ đó genom của
M. tuberculosis có một bản
copy gen đơn bản của gen rrn, những thay đổi nucleotide đơn lẻ có thể tiềm ẩn
sinh ra tính kháng với kháng sinh. Các đột biến điểm xảy ra ở 65–67% các