ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------------

Nguyễn Văn Bắc

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA
THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2010


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

Nguyễn Văn Bắc

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA
THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Bp

: Base pairs

CNSH

: Công nghệ sinh học

CTCLQG

: Chương trình chống lao quốc gia

DNA

: Acit deoxyribonucleic

dNTPs

: Deoxyribonucleotide Triphosphate

EDR

: Extensively drug resitant (Kháng thuốc mở rộng)

EMB


PAS

: Paraminosalicylic acid

PAZ

: Pyrazinamid

PCR

: Polymerase Chain Reaction

RMP

: Rifampicin

RNA

: Acid Ribonucleic

RRDR

: Rifampin resistance determining region (Vùng quyết định kháng
rifampicin)

Taq polymerase

: Thermus aquaticus DNA polymerase


Resistant - MDR), tức là thể lao với vi khuẩn kháng ít nhất hai loại thuốc chống lao
mạnh nhất là isoniazid (INH) và rifampicin (RMP). Theo số liệu thống kê của chương
trình chống lao Quốc gia năm 2007, thế giới có khoảng 511.000 trường hợp nhiễm lao
kháng đa thuốc, trong đó có hơn 130.000 trường hợp tử vong. Do những khó khăn
trong việc điều trị những bệnh nhân mang các chủng lao kháng thuốc phổ rộng và đa
kháng mà việc phát hiện sớm các chủng lao kháng đa thuốc sẽ trở nên rất quan trọng
trong điều trị bệnh lao.
Hiện nay nhiều nơi chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc vẫn dựa vào phương
pháp nuôi cấy vi khuẩn và làm kháng sinh đồ là chủ yếu, tuy nhiên, việc ứng dụng sinh
học phân tử cũng đang tạo ra những đột phá trong phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc.
Cơ chế kháng thuốc ở vi khuẩn lao là do trong quá trình tiến hóa, có nhiều đột biến
xuất hiện trong một số gen chức năng, trước hết là ở gen rpoB và katG. Thời gian chẩn
đoán có thể rút ngắn chỉ còn vài ngày, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện
cho kiểm soát bệnh lao dễ dàng hơn. Các nghiên cứu về sinh học phân tử trong chẩn
đoán lao kháng thuốc đã chỉ ra rằng mỗi loại kháng thuốc là do xuất hiện các đột biến
trên gen tương ứng chịu trách nhiệm. Chính vì vậy việc xác định các trường hợp nhiễm
lao kháng thuốc thường đi kèm với những chẩn đoán phát hiện đột biến gen đối với các
chủng lao phát hiện được. Các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid là do có liên quan
tới đột biến tại codon 315 trên gen katG, đối với các chủng kháng rifampicin do xuất
hiện các đột biến ở một vùng nóng gồm 27 codon nằm gần trung tâm của gen rpoB.

1


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát
hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử”

hưởng đến hệ thần kinh trung ương (lao màng não), hệ bạch huyết, hệ tuần hoàn (lao
kê), xương và khớp. Bệnh lao gắn liền với sự phát triển của xã hội loài người từ hàng
ngàn năm nay, trên thế giới chưa bao giờ và không một quốc gia nào, một khu vực nào,
một dân tộc nào không có người mắc và chết vì bệnh lao. Trực khuẩn lao lần đầu tiên
được bác sĩ Robert Koch đã phát hiện vào ngày 24/3/1882. Trong thời gian này ở Mỹ
và châu Âu, cứ 7 người thì có 1 người chết vì lao, do vậy, phát hiện của Robert Koch là
một bước ngoặt quan trọng trong việc khống chế và loại trừ căn bệnh này. Trước đây,
lao được xem là một trong những căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên thế giới,
lưu hành với tỷ lệ mắc bệnh khá cao, đặc biệt ở các nước thuộc châu Phi và khu vực
châu Á, trong đó có Việt Nam.
Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu.
Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và
Philippines về số bệnh nhân lao, cũng như số bệnh nhân lao xuất hiện hằng năm. Hiện
nay nguy cơ nhiễm lao ở nước ta hằng năm được ước tính là 1,5% dân số (ở các tỉnh
phía Nam là 2%, ở các tỉnh phía Bắc là 1%). Trên thực tế chỉ số nguy cơ nhiễm lao
hàng năm có thể cao hơn 1,5%, như vậy, các con số nêu trên còn có thể lớn hơn. Điều
đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công tác phòng chống lao không những trong các
năm tới mà có thể trong thời gian khá dài, có thể đến hàng chục năm, ngay cả khi ở
thiên niên kỷ mới [3, 35].
1.2. TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC
Bệnh lao ngày càng trở nên phức tạp và có ảnh hưởng nặng nề khi xuất hiện
thêm vi khuẩn lao kháng thuốc tạo nên một dạng bệnh khó phòng chống. Các chủng

3


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

cộng lại. Tổ chức Y tế Thế giới đã nhận định bệnh lao hiện nay đã quay trở lại và trở
nên tồi tệ hơn bởi sự kháng thuốc của vi khuẩn lao [17].
Thuốc kháng sinh đầu tiên dùng để điều trị lao là streptomycin, nhưng vài năm
sau khi kháng sinh này được sử dụng thì người ta đã nhận thấy hiện tượng đề kháng lại
streptomycin của vi khuẩn lao. Sau đó các kháng sinh chống lao khác tiếp tục ra đời:
para – aminosalysilic, isoniazid, rifampicin nhưng đều không mang lại hiệu quả sau
một thời gian điều trị nhất định [7]. Nghiên cứu tìm kiếm hoá dược mới có hiệu quả
điều trị lao, đặc biệt là lao kháng thuốc luôn luôn được thực hiện và càng ngày càng
có nhiều hợp chất chống lao mới được đưa vào sử dụng, ví dụ, gần đây là linezolid
[43]. Tuy nhiên, theo cơ chế và áp lực, vi khuẩn không ngừng biến đổi tạo nên nhiều
chủng mới hơn có khả năng kháng thuốc nhanh chóng hơn [52]. Khả năng điều trị
thành công có thể đạt 95-100% đối với những bệnh nhân mắc lao thông thường, trong
khi tỷ lệ thành công với bệnh nhân mắc lao kháng thuốc chỉ là 20 – 30%, thậm chí
còn không điều trị được khi mắc lao kháng đa thuốc và kháng thuốc phổ rộng mặc dù
đã dùng kết hợp đến năm loại kháng sinh điều trị lao. Vì vậy, việc phát hiện và ngăn
chặn sự lan truyền các chủng lao kháng đa thuốc là vấn đề quan trọng nhất trong điều
trị lao hiện nay [7, 10, 35].
1.3. VI KHUẨN LAO
1.3.1. Cấu tạo
Trực khuẩn lao có dạng hình que, thân mảnh dẻ, không có nha bào, kích thước 2
- 3 µm, dày 0,3 µm, kháng cồn, kháng acid (hình 1.1). Khi được nhuộm bằng phương
pháp Ziehl - Neelsen, trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, do không bị cồn và acid làm
mất màu carbonfuchsin. Ở môi trường nuôi cấy có độ acid đậm đặc nhất định, trực
khuẩn lao vẫn phát triển được, vì vậy, chúng được gọi là trực khuẩn kháng cồn, kháng
toan (acid fast bacilli - AFB), đây là đặc điểm nổi bật của vi khuẩn thuộc chi
mycobacteria. Đặc điểm này rất quan trọng để phát hiện trực khuẩn lao bằng phương

Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn lao phát
triển trong môi trường nuôi cấy.
(http://abcnews.go.com/Health/Germs/st
ory?id=3079114&page=1)

6


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Trực khuẩn lao có cấu tạo rất phức tạp, hoàn hảo mà ít vi sinh vật nào có được.
Dưới kính hiển vi điện tử trực khuẩn lao có cấu tạo chính như sau (hình 1.3):
- Lớp trong cùng có cấu trúc màng, có thành phần chủ yếu là các phospholipid
gồm 2 nhóm: nhóm ưa nước hướng vào bên trong, nhóm kỵ nước quay ra ngoài. Cấu
trúc này tạo nên màng sinh học có tác dụng giúp trực khuẩn điều hòa sự thẩm thấu của
vỏ ngoài trực khuẩn, màng còn chứa các protein chức năng khác như các protein truyền
tín hiệu đến bộ máy trao đổi chất và di truyền trong nguyên sinh chất, các enzyme liên
quan đến quá trình trao đổi chất và sinh năng lượng, các chất mang làm trung gian cho
quá trình vận chuyển các chất dinh dưỡng và các ion. Các enzyme xuyên màng và tổng
hợp màng, tạo thành vách ngăn trong phân chia tế bào, tập hợp và tiết một số enzyme
ngoại bào, sao chép DNA [2, 4, 37, 38].
- Lớp tiếp theo là peptidoglucan liên kết với đường arabinose và các phân tử
mycolic acid tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vi khuẩn có
độ cứng nhất định. Thành tế bào của mycobacteria là cấu trúc phức tạp nhất được biết
ở prokaryote, có một số thành phần hóa học và liên kết chéo bất thường, mức độ liên
kết giữa peptidoglucan ở thành tế bào M. tuberculosis là 70 - 80% trong khi ở vi khuẩn
E. coli là 20 - 30% [38]
- Lớp ngoài được tạo nên bởi sự liên kết giữa các mycolic acid và các chất

nguyên bào sợi kết tập lại tạo các u hạt, với các tế bào lympho vây quanh đại thực bào.
Chức năng của các u hạt không chỉ ngăn cản sự lan tỏa của tế bào M. tuberculosis mà
còn tạo môi trường tại chỗ cho các tế bào của hệ miễn dịch trao đổi thông tin [23]. Bên
trong các u hạt, tế bào lympho T tiết ra các cytokine, như γ interferon, hoạt hóa đại

8


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

thực bào khiến chúng diệt khuẩn tốt hơn. Tế bào lympho T cũng tiêu diệt trực tiếp các
tế bào bị nhiễm. Nhưng điều quan trọng là vi khuẩn không bị u hạt loại trừ hoàn toàn
mà trở nên bất hoạt tạo dạng nhiễm khuẩn “tiềm ẩn” (latent tuberculosis) [18].
1.3.3. Đặc điểm hệ gen
Toàn bộ hệ gen của vi khuẩn lao M. tuberculosis chủng H37Rv được giải trình
tự, phân tích và công bố năm 1998 gồm 4.411.529 bp, với đặc tính là chứa nhiều
guanine và cystosine (G + C khoảng 65 %). Trên 90% trình tự được dự đoán là có mã
hóa cho protein và chỉ có 6 gen giả (pseudogene - gen không mang thông tin di
truyền mã hóa cho protein) [28, 38, 44]. Dữ liệu hệ gen của một số vi khuẩn thuộc chi
Mycobacterium, trước hết là của vi khuẩn lao (M. tuberculosis) và vi khuẩn phong
(M. leprae) có tầm quan trọng đặc biệt trong nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử
hỗ trợ dịch tễ học, di truyền học và nghiên cứu kháng thuốc, số liệu đã được lưu giữ
tại một số trung tâm và có thể sử dụng một số chương trình để truy cập khám phá và
sử dụng [11, 53].
1.4. CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC Ở VI KHUẨN LAO
1.4.1. Kháng sinh trong điều trị lao
Thuốc chống lao có nhiều loại, và tác dụng của chúng lên trực khuẩn lao cũng
không giống nhau. Hiện nay người ta chia thuốc chống lao làm hai loại: (1) Các thuốc


-

Sản phẩm của gen, mà hoạt tính của nó bị ức chế bởi thuốc được vi khuẩn
sản xuất thừa ra, do đó lượng thuốc mà bệnh nhân uống vào không đủ để ức
chế hoàn toàn vi khuẩn lao.

-

Những thay đổi xảy ra ở mức độ phân tử và cơ chế xâm nhập của thuốc vào
bên trong tế bào vi khuẩn làm cho nồng độ thuốc bên trong tế bào không đạt
tới nồng độ tối thiểu có khả năng giết chết vi khuẩn gây bệnh.

Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn lao có thể xảy ra trước khi xâm nhập (tiên
phát) hoặc sau khi nhập vào cơ thể người bệnh (thứ phát). Vi khuẩn lao kháng thuốc tiên
phát là hiện tượng lây nhiễm bởi một chủng đã kháng thuốc mà vi khuẩn này đã có sự đề
kháng tự nhiên. Vì vậy, bệnh nhân mắc lao do sự lây nhiễm này, ngay từ đầu vi khuẩn
lao xâm nhập vào cơ thể đã có sự đề kháng với thuốc đang sử dụng. Còn hiện tượng
kháng thuốc thứ phát xảy ra đối với các chủng vi khuẩn lao ở bệnh nhân nào đó dùng

10


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

thuốc chống lao không đúng quy định, không đúng liều lượng, thời gian sử dụng thuốc
do đó đã chọn lọc vi khuẩn lao khang thuốc [1, 38].
Các chủng vi lao kháng thuốc được chia làm hai loại: (1) Các chủng lao kháng

được chiết xuất từ nấm Streptomyces mediterranei, là thuốc có hoạt tính diệt khuẩn
mạnh, tiệt khuẩn, thuốc diệt vi khuẩn lao trong và ngoài tế bào. Rifampicin không có
hiện tượng kháng thuốc chéo với các loại thuốc chữa lao khác. Nồng độ ức chế tối
thiểu (minimum inhibitory concentration - MIC) đối với vi khuẩn là 5 - 200 ng/ml (in
vitro). Đây là thuốc ức chế RNA polymerase mạnh nhất [29, 48].

12


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

A

B

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của rifampicin (A) và isoniazid (B) [48]

Cơ chế tác động của rifampicin liên quan đến khả năng ức chế hoạt động
của RNA polymerase. Enzyme này là một phức hợp oligomer gồm bốn tiểu đơn
vị khác nhau (α, β, β’, ω), và được mã hóa tương ứng bởi các gen rpoA, rpoB,
rpoC, rpoD [7, 20].
Khi rifampicin gắn với tiểu đơn vị β của RNA polymerase (rpoB), làm ức chế
các hoạt động sao chép tạo ra các mRNA của vi khuẩn lao và do đó làm ngưng trệ các
hoạt động sống của vi khuẩn lao. Đây là cơ chế cơ chế tác dụng của RMP đối với vi
khuẩn lao (hình 1.6).

Hình 1.6. Cấu trúc tinh thể liên kết giữa rifampicin và RNA polymerase [20]



Nguyễn Văn Bắc

giảm hoặc mất đi. Như vậy đột biến trên vùng gen này của rpoB đã làm cho vi khuẩn
lao trở nên kháng thuốc với rifampicin.
- 90 - 95 % các chủng M. tuberculosis kháng rifampicin được xác định là do các
đột biến trên vùng gen nóng 81 bp này của rpoB. Như vậy còn 5 - 10 % các chủng vi
khuẩn lao không có đột biến trên vùng này của gen rpoB. Điều này cho thấy cần phải xác
định thêm những đột biến khác trên gen này hoặc những gen khác có liên quan để xác
định chính xác và toàn bộ cơ chế kháng rifampicin của vi khuẩn lao [19, 37].
1.4.4. Isoniazid và cơ chế kháng
Isoniazid có tên khoa học là isonicotinylhydrazine (INH) (hình 1.5B), là thuốc
chống lao đặc hiệu cao, có tác dụng chống lại M. tuberculosis và các loại
Mycobacterium không điển hình khác như M. bovis, M. kansasii. Isoniazid diệt khuẩn
phụ thuộc vào nồng độ thuốc ở vị trí tổn thương và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn. Cơ
chế tác dụng của isoniazid có liên quan tới sự hình thành phức hệ acyl isonicotinicNADH và như đã trình bày ở trên chúng ức chế sự tổng hợp acid mycolic cần cho
thành tế bào vi khuẩn lao.
Gen katG có kích thước 2223 bp mã hóa catalase – peroxidase. Enzyme này
hoạt hóa INH bằng cách kết hợp acyl isonicotinic với NADH để tạo thành phức hệ acyl
isonicotinic-NADH. Phức hệ này liên kết chặt chẽ với ketoenoylreductase (mã hóa bởi
gen InhA), theo đó làm ngăn cản sự hình thành cơ chất enoyl-AcpM và hoạt động tổng
hợp acid béo. Quá trình này làm ức chế sự tổng hợp acid mycolic cần cho thành tế bào
vi khuẩn lao.

15


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

gặp dò phế quản – màng phổi mà điều trị gặp nhiều khó khăn [7].
*) Xét nghiệm lâm sàng
- Phản ứng Tuberculin: thường thì phản ứng da ở những bệnh nhân kháng thuốc tiên
phát có mức độ mạnh hơn so với những bệnh nhân có vi khuẩn nhạy cảm với thuốc.
Đối với kháng thuốc mắc phải, đặc biệt là kháng đa thuốc ở bệnh nhân đồng nhiễm
HIV (+) thì tỷ lệ phản ứng này âm tính khá cao.
- Hình ảnh X Quang: khi chụp phổi thẳng, kết quả cho thấy hình ảnh về bệnh lao
phổi giữa trường hợp lao kháng thuốc tiên phát với trường hợp nhạy cảm với
thuốc không có sự khác biệt. Nhưng những trường hợp kháng thuốc mắc phải thì
gặp nhiều là thể xơ hang, diện tích phổi tổn thương nhiều hơn và có nhiều hang,
kích thước của hang lớn hơn.
- Xét nghiệm vi khuẩn:
+ Về hình thể: các vi khuẩn bình thường có cấu tạo thành tế bào 3 lớp nhưng ở
vi khuẩn kháng thuốc thành tế bào có cấu tạp 4 lớp (vi khuẩn có thêm một lớp
peptidoglycolipid ở ngoài cùng). Vi khuẩn kháng với rifampicin có thành tế
bào cũng dày hơn hẳn so với vi khuẩn nhạy với thuốc. Khuẩn lạc của vi
khuẩn kháng thuốc có thể không điển hình khi nuôi cấy, mọc cằn cỗi [7]
+ Về số lượng vi khuẩn khi soi kính và nuôi cấy: những bệnh nhân kháng thuốc
thứ phát có số lượng vi khuẩn khi soi kính cao hơn nhiều so với bệnh nhân
thông thường. Không có sự khác nhau nhiều giữa bệnh nhân kháng thuốc tiên
phát và bệnh nhân thông thường. Khi nuôi cấy trên môi trường đặc số khuẩn
lạc mọc ở bệnh nhân kháng thuốc mắc phải là cao hơn và thời gian mọc

17


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

đòi hỏi thiết bị hiện đại, tốn kém và cần nhân lực có trình độ chuyên sâu nhưng thời
gian chẩn đoán bằng phương pháp này nhanh hơn, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
Để xác định đột biến trên gen có liên quan tới kháng thuốc (gen rpoB và katG)
hiện nay giải trình tự gen vẫn là phương pháp xác định cơ bản, chính xác nhất và thời
gian cho kết quả từ 3 - 5 ngày. Sau khi giải trình tự đoạn gen vừa được tách dòng từ
chủng lao nghiên cứu ta sẽ so sánh trật tự sắp xếp các nucleotide ở mẫu thí nghiệm với
trật tự nucleotide chuẩn để biết được các vị trí sai lệch [22, 16].
Việc xác định các đột biến có liên quan kháng thuốc rifampicin và isoniazid
bằng kỹ thuật giải trình tự cho biết chính xác vị trí đột biến cũ và mới trên gen cần
nghiên cứu, mang lại hiểu biết sâu sắc về sự đa dạng của cấu trúc quần thể vi khuẩn lao
ở bệnh nhân lao kháng thuốc, đánh giá được tỷ lệ đột biến liên quan kháng thuốc trên
các chủng lao phân lập từ các vùng địa lý khác nhau. Qua đó làm tiền đề xây dựng một
số bộ kit real-time PCR, nhằm phát hiện nhanh vi khuẩn lao kháng rifampicin và
isoniazid tại Việt Nam.
1.5.4. Kỹ thuật real-time PCR và multiplex real-time PCR
Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được
ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, do đặc điểm này nên với real-time PCR
người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các bước thí nghiệm để đọc và
phân tích kết quả để xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không vì kết quả cuối
cùng của phản ứng khuếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứng
khuếch đại. Như vậy, nên có thể nói real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích
trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch
đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để
người làm thí nghiệm có thể thấy được.
Chìa khóa của kỹ thuật real-time PCR chính là hóa chất và thuốc thử có trong
phản ứng, trong đó chất huỳnh quang được thêm vào hỗn hợp phản ứng là yếu tố đầu