Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------------

Nguyễn Văn Bắc

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA
THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Lời cảm ơn!
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh, Trưởng
phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học – người thầy đã tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập và hoàn thành
khóa luận này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn Học viện
Quân y cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ
Sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời
gian thực tập và hoàn thành khóa luận.

DNA

: Acit deoxyribonucleic

dNTPs

: Deoxyribonucleotide Triphosphate

EDR

: Extensively drug resitant (Kháng thuốc mở rộng)

EMB

: Ethambutol.

HRS

: Ba loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin

HRSE

: Bốn loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin và ethambutol

INH

: Isoniazid

IPTG


RNA

: Acid Ribonucleic

RRDR

: Rifampin resistance determining region (Vùng quyết định kháng
rifampicin)

Taq polymerase

: Thermus aquaticus DNA polymerase

TCYTTG

: Tổ chức Y tế Thế giới

V

: Volume (thể tích)

X-gal

: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc


chủng lao phát hiện được. Các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid là do có liên quan
tới đột biến tại codon 315 trên gen katG, đối với các chủng kháng rifampicin do xuất
hiện các đột biến ở một vùng nóng gồm 27 codon nằm gần trung tâm của gen rpoB.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát

1


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử”
Với mục tiêu nghiên cứu: phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn lao kháng
thuốc thông qua xác định các vị trí đột biến liên quan kháng thuốc trên gen katG và
rpoB bằng phương pháp giải trình tự và kỹ thuật multiplex real-time PCR.
Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi tiến hành một số nội dung nghiên
cứu như sau:
1.

Xác định trình tự gen rpoB và katG.

2.

Phân tích đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc phân
lập tại Việt Nam trên cơ sở trình tự nucleotide của hai gen rpoB và katG.

3.

Tối ưu hóa thành phần và chu trình bộ kit multiplex real-time PCR phát

năm tới mà có thể trong thời gian khá dài, có thể đến hàng chục năm, ngay cả khi ở
thiên niên kỷ mới [3, 35].
1.2. TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC
Bệnh lao ngày càng trở nên phức tạp và có ảnh hưởng nặng nề khi xuất hiện
thêm vi khuẩn lao kháng thuốc tạo nên một dạng bệnh khó phòng chống. Các chủng

3


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

lao kháng thuốc được chia làm hai thể, đó là lao kháng đa thuốc (Multi-drugs resistant
- MDR) và lao kháng thuốc phổ rộng (Extensively drug resistant - XDR), những chủng
vi khuẩn lao kháng thuốc này là nguồn lây nhiễm và là mối đe dọa cho sức khỏe của
cộng đồng. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), trên thế giới có khoảng 42
vạn người mắc lao kháng đa thuốc, chiếm số lượng lớn nhất là ở khu vực Tây Thái
Bình Dương có 15 vạn trường hợp, kế đến là khu vực Đông Nam Á và sau đó là khu
vực Châu Phi và Đông Âu. Một số chủng lao vừa kháng đa thuốc vừa kháng thuốc phổ
rộng, có thể coi là loại siêu kháng thuốc [17]. Tình hình lao siêu kháng thuốc cũng
ngày càng trở nên trầm trọng, do vậy từ tháng 11/2004 đến 11/2005, WHO và Trung
tâm Kiểm soát Bệnh Hoa Kỳ đã phân tích 17.890 mẫu đờm gửi từ 40 quốc gia trên
toàn thế giới, và thấy rằng có 20% trường hợp là kháng đa thuốc và 2% trường hợp là
kháng thuốc phổ rộng. Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Chương trình Chống lao
Quốc gia thì có 32,5% các trường hợp bệnh lao mới mang vi khuẩn lao kháng thuốc [1,
3].
Vi khuẩn lao kháng thuốc là một thách thức lớn, đe dọa công cuộc phòng chống
lao trên toàn cầu, vì các thuốc chống lao có hiệu quả hiện nay đang bị vi khuẩn lao
kháng lại nhất là kháng đa thuốc [10]. Thuốc chống lao có nhiều loại, tác dụng của mỗi

còn không điều trị được khi mắc lao kháng đa thuốc và kháng thuốc phổ rộng mặc dù
đã dùng kết hợp đến năm loại kháng sinh điều trị lao. Vì vậy, việc phát hiện và ngăn
chặn sự lan truyền các chủng lao kháng đa thuốc là vấn đề quan trọng nhất trong điều
trị lao hiện nay [7, 10, 35].
1.3. VI KHUẨN LAO
1.3.1. Cấu tạo
Trực khuẩn lao có dạng hình que, thân mảnh dẻ, không có nha bào, kích thước 2
- 3 µm, dày 0,3 µm, kháng cồn, kháng acid (hình 1.1). Khi được nhuộm bằng phương
pháp Ziehl - Neelsen, trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, do không bị cồn và acid làm
mất màu carbonfuchsin. Ở môi trường nuôi cấy có độ acid đậm đặc nhất định, trực
khuẩn lao vẫn phát triển được, vì vậy, chúng được gọi là trực khuẩn kháng cồn, kháng
toan (acid fast bacilli - AFB), đây là đặc điểm nổi bật của vi khuẩn thuộc chi
mycobacteria. Đặc điểm này rất quan trọng để phát hiện trực khuẩn lao bằng phương
pháp hình thái học (nhuộm màu) trong các mẫu bệnh phẩm. Một số giả thiết cho rằng

5


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

mức kháng acid là do độ dài của các chuỗi mycolic acid. M. tuberculosis có khả năng
thể hiện tất cả các cơ chế cần thiết để tổng hợp các vitamin, amino acid và các enzyme
cofactor thiết yếu của tế bào. Mycobacteria có cấu trúc gần giống với vi khuẩn Gram
dương nhưng chúng không được xếp vào loại vi khuẩn Gram dương do các phân tử
gắn với thành tế bào là lipid chứ không phải protein hay polysaccharide. Do đó, chúng
không giữ lại tinh thể màu tím xuất hiện trong nhuộm Gram [2, 5, 37, 38].
Trực khuẩn lao rất hiếu khí, phát triển tốt nhất ở 37 oC và dưới áp suất của O 2 là
100 mmHg. Đỉnh phổi và vùng phổi dưới xương đòn thường hay mắc lao nhất vì có áp



Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

gồm 2 nhóm: nhóm ưa nước hướng vào bên trong, nhóm kỵ nước quay ra ngoài. Cấu
trúc này tạo nên màng sinh học có tác dụng giúp trực khuẩn điều hòa sự thẩm thấu của
vỏ ngoài trực khuẩn, màng còn chứa các protein chức năng khác như các protein truyền
tín hiệu đến bộ máy trao đổi chất và di truyền trong nguyên sinh chất, các enzyme liên
quan đến quá trình trao đổi chất và sinh năng lượng, các chất mang làm trung gian cho
quá trình vận chuyển các chất dinh dưỡng và các ion. Các enzyme xuyên màng và tổng
hợp màng, tạo thành vách ngăn trong phân chia tế bào, tập hợp và tiết một số enzyme
ngoại bào, sao chép DNA [2, 4, 37, 38].
- Lớp tiếp theo là peptidoglucan liên kết với đường arabinose và các phân tử
mycolic acid tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vi khuẩn có
độ cứng nhất định. Thành tế bào của mycobacteria là cấu trúc phức tạp nhất được biết
ở prokaryote, có một số thành phần hóa học và liên kết chéo bất thường, mức độ liên
kết giữa peptidoglucan ở thành tế bào M. tuberculosis là 70 - 80% trong khi ở vi khuẩn
E. coli là 20 - 30% [38]
- Lớp ngoài được tạo nên bởi sự liên kết giữa các mycolic acid và các chất
phức tạp, đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao và có cấu trúc phức tạp làm
tăng khả năng chống thấm nước của thành tế bào vi khuẩn giúp trực khuẩn tồn tại
lâu với môi trường bên ngoài, chống khả năng bị hủy diệt bởi đại thực bào và các tế
bào miễn dịch [38].
- Lớp vỏ ngoài cùng có vai trò rất quan trọng, có cấu trúc peptidoglyolipid.
Nó đảm bảo cho sự tồn tại của trực khuẩn, làm cho trực khuẩn bền vững với hiện
tượng thực bào, giúp bảo vệ khỏi áp suất thẩm thấu nên khi vào cơ thể trực khuẩn
khó bi tiêu diệt.


nguyên bào sợi kết tập lại tạo các u hạt, với các tế bào lympho vây quanh đại thực bào.
Chức năng của các u hạt không chỉ ngăn cản sự lan tỏa của tế bào M. tuberculosis mà
còn tạo môi trường tại chỗ cho các tế bào của hệ miễn dịch trao đổi thông tin [23]. Bên
trong các u hạt, tế bào lympho T tiết ra các cytokine, như γ interferon, hoạt hóa đại

9


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

thực bào khiến chúng diệt khuẩn tốt hơn. Tế bào lympho T cũng tiêu diệt trực tiếp các
tế bào bị nhiễm. Nhưng điều quan trọng là vi khuẩn không bị u hạt loại trừ hoàn toàn
mà trở nên bất hoạt tạo dạng nhiễm khuẩn “tiềm ẩn” (latent tuberculosis) [18].
1.3.3. Đặc điểm hệ gen
Toàn bộ hệ gen của vi khuẩn lao M. tuberculosis chủng H37Rv được giải trình
tự, phân tích và công bố năm 1998 gồm 4.411.529 bp, với đặc tính là chứa nhiều
guanine và cystosine (G + C khoảng 65 %). Trên 90% trình tự được dự đoán là có mã
hóa cho protein và chỉ có 6 gen giả (pseudogene - gen không mang thông tin di
truyền mã hóa cho protein) [28, 38, 44]. Dữ liệu hệ gen của một số vi khuẩn thuộc chi
Mycobacterium, trước hết là của vi khuẩn lao (M. tuberculosis) và vi khuẩn phong
(M. leprae) có tầm quan trọng đặc biệt trong nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử
hỗ trợ dịch tễ học, di truyền học và nghiên cứu kháng thuốc, số liệu đã được lưu giữ
tại một số trung tâm và có thể sử dụng một số chương trình để truy cập khám phá và
sử dụng [11, 53].
1.4. CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC Ở VI KHUẨN LAO
1.4.1. Kháng sinh trong điều trị lao
Thuốc chống lao có nhiều loại, và tác dụng của chúng lên trực khuẩn lao cũng
không giống nhau. Hiện nay người ta chia thuốc chống lao làm hai loại: (1) Các thuốc


-

Sản phẩm của gen, mà hoạt tính của nó bị ức chế bởi thuốc được vi khuẩn
sản xuất thừa ra, do đó lượng thuốc mà bệnh nhân uống vào không đủ để ức
chế hoàn toàn vi khuẩn lao.

-

Những thay đổi xảy ra ở mức độ phân tử và cơ chế xâm nhập của thuốc vào
bên trong tế bào vi khuẩn làm cho nồng độ thuốc bên trong tế bào không đạt
tới nồng độ tối thiểu có khả năng giết chết vi khuẩn gây bệnh.

Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn lao có thể xảy ra trước khi xâm nhập (tiên
phát) hoặc sau khi nhập vào cơ thể người bệnh (thứ phát). Vi khuẩn lao kháng thuốc tiên
phát là hiện tượng lây nhiễm bởi một chủng đã kháng thuốc mà vi khuẩn này đã có sự đề
kháng tự nhiên. Vì vậy, bệnh nhân mắc lao do sự lây nhiễm này, ngay từ đầu vi khuẩn
lao xâm nhập vào cơ thể đã có sự đề kháng với thuốc đang sử dụng. Còn hiện tượng
kháng thuốc thứ phát xảy ra đối với các chủng vi khuẩn lao ở bệnh nhân nào đó dùng
thuốc chống lao không đúng quy định, không đúng liều lượng, thời gian sử dụng thuốc

11


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

do đó đã chọn lọc vi khuẩn lao khang thuốc [1, 38].
Các chủng vi lao kháng thuốc được chia làm hai loại: (1) Các chủng lao kháng

được chiết xuất từ nấm Streptomyces mediterranei, là thuốc có hoạt tính diệt khuẩn
mạnh, tiệt khuẩn, thuốc diệt vi khuẩn lao trong và ngoài tế bào. Rifampicin không có

13


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

hiện tượng kháng thuốc chéo với các loại thuốc chữa lao khác. Nồng độ ức chế tối
thiểu (minimum inhibitory concentration - MIC) đối với vi khuẩn là 5 - 200 ng/ml (in
vitro). Đây là thuốc ức chế RNA polymerase mạnh nhất [29, 48].

A

B

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của rifampicin (A) và isoniazid (B) [48]

14


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Cơ chế tác động của rifampicin liên quan đến khả năng ức chế hoạt động
của RNA polymerase. Enzyme này là một phức hợp oligomer gồm bốn tiểu đơn
vị khác nhau (α, β, β’, ω), và được mã hóa tương ứng bởi các gen rpoA, rpoB,

507-GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC
CCG CTG TCG GGC TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG CGC CTG-533
Mỗi nucleotide trên đoạn này có thể bị thay thế, hoán đổi vị trí, mất đi, thêm vào
để tạo ra các đột biến được thể hiện trên hình 1.7 như sau: [41].

Hình 1.7. Trình tự nucleotide và các vị trí có khả năng xảy ra đột biến trên đoạn “nóng”
của gen rpoB [41]

- Khi xảy ra đột biến gần vùng lõi của gen rpoB sẽ làm thay đổi cấu trúc tiểu
phần β của RNA polymerase mà nó mã hóa nên làm cho khả năng kết hợp của RMP
với tiểu phần này giảm đi. Kết quả là tác dụng của rifampicin đối với vi khuẩn lao
giảm hoặc mất đi. Như vậy đột biến trên vùng gen này của rpoB đã làm cho vi khuẩn
lao trở nên kháng thuốc với rifampicin.
- 90 - 95 % các chủng M. tuberculosis kháng rifampicin được xác định là do các

17


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

đột biến trên vùng gen nóng 81 bp này của rpoB. Như vậy còn 5 - 10 % các chủng vi
khuẩn lao không có đột biến trên vùng này của gen rpoB. Điều này cho thấy cần phải xác
định thêm những đột biến khác trên gen này hoặc những gen khác có liên quan để xác
định chính xác và toàn bộ cơ chế kháng rifampicin của vi khuẩn lao [19, 37].
1.4.4. Isoniazid và cơ chế kháng
Isoniazid có tên khoa học là isonicotinylhydrazine (INH) (hình 1.5B), là thuốc
chống lao đặc hiệu cao, có tác dụng chống lại M. tuberculosis và các loại
Mycobacterium không điển hình khác như M. bovis, M. kansasii. Isoniazid diệt khuẩn



Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC
1.5.1. Đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm cận lâm sàng
*) Đặc điểm lâm sàng
Nhìn chung các dấu hiệu lâm sàng của bệnh lao có vi khuẩn kháng thuốc không
khác nhiều với bệnh lao mà vi khuẩn nhạy cảm với thuốc.
Trường hợp nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc tiên phát có thể có triệu chứng cấp
tính hơn, sốt cao hơn.
Đối với kháng thuốc mắc phải phần lớn gặp ở những bệnh nhân lao mạn tính,
được điều trị ít nhất 2 lần. Những bệnh nhân này cũng chiếm tỷ lệ chủ yếu trong số
bệnh nhân lao kháng đa thuốc. Hầu hết bệnh lao kháng đa thuốc bệnh tiến triển, hay
gặp dò phế quản – màng phổi mà điều trị gặp nhiều khó khăn [7].
*) Xét nghiệm lâm sàng
- Phản ứng Tuberculin: thường thì phản ứng da ở những bệnh nhân kháng thuốc tiên
phát có mức độ mạnh hơn so với những bệnh nhân có vi khuẩn nhạy cảm với thuốc.
Đối với kháng thuốc mắc phải, đặc biệt là kháng đa thuốc ở bệnh nhân đồng nhiễm
HIV (+) thì tỷ lệ phản ứng này âm tính khá cao.
- Hình ảnh X Quang: khi chụp phổi thẳng, kết quả cho thấy hình ảnh về bệnh lao
phổi giữa trường hợp lao kháng thuốc tiên phát với trường hợp nhạy cảm với
thuốc không có sự khác biệt. Nhưng những trường hợp kháng thuốc mắc phải thì
gặp nhiều là thể xơ hang, diện tích phổi tổn thương nhiều hơn và có nhiều hang,
kích thước của hang lớn hơn.
- Xét nghiệm vi khuẩn:
+ Về hình thể: các vi khuẩn bình thường có cấu tạo thành tế bào 3 lớp nhưng ở
vi khuẩn kháng thuốc thành tế bào có cấu tạp 4 lớp (vi khuẩn có thêm một lớp

lao trong môi trường nuôi cấy có kháng sinh, từ đó đưa ra kết luận về khả năng kháng
thuốc của chủng vi khuẩn lao đang nghiên cứu [12]. Nhược điểm của các phương pháp
này là vi khuẩn lao mọc chậm, trên môi trường Lowenstein-Jensen thường mất 4-6
tuần. Sử dụng hệ thống môi trường lỏng được cải tiến như MGIT, BATEC cũng mất 2
tuần. Điều này làm cho công tác điều trị và kiểm soát tình hình bệnh lao cũng như bệnh
lao kháng thuốc còn khó khăn.
1.5.3. Xác định kiểu gen

21