B GIÁO DC VẨ ẨO TO
TRNG I HC M TP.HCM
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

Tên đ tài:

BC U TỊM HIU K THUT SINH HC
PHÂN T TRONG XỄC NH T BIN TRểN
GEN HBB GÂY BNH THIU MỄU HNG CU
HỊNH LIM
KHOA CÔNG NGH SINH HC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH ậ SINH HC PHÂN T GVHD: ThS. Trng Kim Phng
SVTH: Nguyn Th Thu Ngân
MSSV: 1053012479
Khóa: 2010 - 2014

TP.HCM, tháng 06 nm 2014
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân ậ 1053012479

LI CM N

Em xin gi lòng tri ơn đn cô Trng Kim Phng, ngi đƣ tn tình hng

ASA Allele specific amplification
AS-PCR Allele specific ậ polymerase chain reaction
bp Base pair
ddNTP Dideoxynucleotide triphosphat
dNTP Deoxynucleotide triphosphat
EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid
Glu Glutamic
Hb Hemoglobin
HbA Hemoglobin A
HbA
2
Hemoglobin A
2

HbAS Hemoglobin A ậ hemoglobin S
HBB Beta-hemoglobin
HbC Hemoglobin C
HbD Hemoglobin D
HbE Hemoglobin E
HbF Hemoglobin F
HbS Hemoglobin S
HbSbetathal Hemoglobin S ậ beta thalassemia
HbSC Hemoglobin S - hemoglobin C
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 ii

HbSD Hemoglobin S - hemoglobin D
HbSS Hemoglobin S - Hemoglobin S
IDT Integrated DNA Technologies

Thiu máu hng cu hình lim Sickle cell anemia
Tn thng c quan mn tính Chronic organ damage Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 iv DANH MC CÁC BNG
Bng I.1. Các đc đim lâm sàng ca bnh hng cu hình lim 6
Bng I.β. Các đc đim sinh hc ca bnh hng cu hình lim 7
Bng II.1. Thành phn phn ng PCR vi cp mi HBB1-F và HBB1-R 21
Bng II.2. Chu k nhit cho phn ng PCR vi cp mi HBB1-F và HBB1-R 22
Bng II.3. Thành phn phn ng PCR vi cp mi HBB2-F và HBB2-R 22
Bng II.4. Chu k nhit cho phn ng PCR vi cp mi HBB2-F và HBB2-R 23
Bng III.1. Các dng đt bin trên gen HBB 26
Bng III.2. T l các th đt bin trên gen HBB 27
Bng III.γ. Các phng pháp đc s dng trong xác đnh đt bin 27
Bng III.4. Thông tin trình t gen HBB thu thp trên NCBI 28
Bng III.5. Các h mi thu thp đc 29
Bng III.6. Các thông s vt lý ca mi 31
Bng III.7. Kho sát đ đc hiu ca mi HBB1-F và HBB1-R, HBB2-F và HBB2-
R bng phn mm Annhyb 32
Bng III.8.  đc hiu ca h mi bng công c Blast 33
Bng III.9. Kt qu đo OD DNA b gen ngi ca 3 mu bnh phm 35
Bng 1. Thông tin mu bnh phm s dng trong nghiên cu 55

mm Annhyb 55
Hình 4: Mc đ tng đng ca trình t A3-F và trình t gen HBB 56
Hình 5: Mc đ tng đng ca trình t A3-R và trình t gen HBB 57

Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 vi

MC LC
T VN 
PHN I: TNG QUAN
I.1 TNG QUAN V BNH THIU MÁU HNG CU HÌNH LIM 3
I.1.1 Tng quan v gen HBB (beta-hemoglobin)[44] 3
I.1.1.1 Gen HBB[44] 3
I.1.2 Bnh hng cu hình lim (Sickle cell disease, SCD) 4
I.1.2.1 nh ngha bnh hng cu hình lim (SCD) 4
I.1.2.2 Các th bnh hng cu hình lim 5
I.1.2.3 Du hiu ca bnh hng cu hình lim 5
I.1.3 Bnh hng cu hình lim  th HbSS[24] 7
I.2 TÌNH HÌNH BNH THIU MÁU HNG CU HÌNH LIM 8
I.2.1 Tình hình trên th gii 8
I.2.2 Tình hình bnh  Vit Nam 10
I.3 BIN CHNG CA BNH THIU MÁU HNG CU HÌNH LIM 10
I.3.1 t qu 10
I.3.2 Hi chng ngc cp tính (ACS) 10
I.3.3 Tn thng c quan mn tính 11
I.4 TÁC NG CA BNH THIU MÁU HNG CU HÌNH LIM 11
I.5 CÁC PHNG PHÁP CHN OÁN BNH THIU MÁU HNG CU
HÌNH LIM
13

III.3 KHO SÁT THC NGHIM 35
III.3.1 Kt qu đo OD 35
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 viii

III.3.2 Kt qu phn ng PCR vƠ đin di 36
III.3.3 Kt qu gii trình t 41
PHN IV: KT LUN VẨ  NGH
IV.1 KT LUN 45
IV.1.1 Khai thác d liu 45
IV.1.2 Kho sát in silico 45
IV.1.3 Kho sát thc nghim 45
IV.2  NGH 46
TÀI LIU THAM KHO 47
PH LC 53
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 1

T VN 
Thiu máu hng cu hình lim th HbSS (Sickle Hemoglobin) là mt dng
bnh lý di truyn v máu, tính cht gia đình, th đng hp, do đt bin đim (GAG
 GTG)  exon 1 ca gen  – globin dn đn s thay th ca acid glutamic thành
valine (Glu6Val)  v trí acid amin th sáu ca chui polypeptide  ậ globin làm
bin đi HbA thành HbS. Th HbSS hình thành các t bào hng cu hình lim gây
thiu máu, dn đn s tc nghn mch máu, nhim trùng và tn thng mt s c
quan quan trng trong c th con ngi, có th làm gim tui th và gây t vong
cho ngi bnh.
Hin nay, trên th gii có nhiu công trình nghiên cu v chn đoán bnh

PHN I: TNG QUAN
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 3

I.1 TNG QUAN V BNH THIU MÁU HNG CU HÌNH
LIM
I.1.1 Tng quan v gen HBB (beta-hemoglobin)
I.1.1.1 Gen HBB [44]
Gen beta-hemoglobin (HBB) mã hóa protein beta-globin, có kích thc 1606
bp (v trí nucleotide 5.246.695 ậ 5.248.300) trên NST 11p15.5.

Hình I.1: Hình nh ca gen HBB[44]
S đt bin trên gen HBB có th dn đn 2 dng bin th chính:
 t bin đim trên trình t gen HBB dn đn s tng hp chui globin bt
thng (HbS, HbC, HbE, HbD, ).
 Nhóm bin th thalassemia dn đn làm gim hoc bt hot s tng hp
chui globin.
Các bin th ca HBB có tn s xut hin khong 1-1,5/1000.
I.1.1.2 Hemoglobin (Hb)
Hemoglobin đc cu to bi bn chui globin bao gm 2 loi hemoglobin: [2]

bin trên gen HBB đƣ to nên các tiu đn v  ậ globin  th HbS và HbC.
Th hemoglobin C (HbC) đc hình thành do s thay th ca glutamic bng
lysine  v trí acid amin th 6 (vit là Glu6Lys). Mc đ nghiêm trng ca
dng bnh HbSC khá bin đng, nhng nó cng nghiêm trng nh bnh
thiu máu hng cu hình lim th HbSS.
 Dng bnh HbSE: dng bnh hng cu hình lim HbSE xy ra do s đt bin
trên gen HBB đƣ to nên các tiu đn v  ậ globin  th HbS và HbE. Th
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 5

hemoglobin E (HbE) hình thành do s thay th glutamic bng lysine  v trí
acid amin 26 (vit là Glu26Lys). Vi dng bnh nƠy, ngi bnh có th có
các du hiu và triu chng nghiêm trng liên quan đn thiu máu hng cu
hình lim nh các đt đau [10,44], thiu máu và chc nng lách bt
thng.[44]
 Dng bnh HbSD: dng bnh hng cu hình lim HbSD xy ra do s đt
bin trên gen HBB đƣ to nên các tiu đn v  ậ globin  th HbS và HbD.
Th hemoglobin D (HbD) hình thành do s thay th glutamic bng glutamin
 v trí acid amin 121.[2]
 Mt dng bnh khác là HbS BetaThal, đc gây ra bi đt bin hemoglobin
S (HbS) và beta thalassemia xut hin cùng nhau. Các du hiu và triu
chng ca HbS betathalassemia thng nghiêm trng hn so vi dng HbSC
và có th bao gm đau nghiêm trng và tn thng c quan [44]. -
thalassemia đc hình thành do s thiu ht chui -globin.[2]
SCD là mt nhóm các ri lon di truyn mn tính Hb trong đó ngi bnh
tha hng hai gen globin đt bin t c cha ln m, mt trong nhng gen này luôn
luôn lƠ đt bin hng cu hình lim.[24]
I.1.2.2 Các th bnh hng cu hình lim [2]
Bnh hng cu hình lim có hai th: th đng hp t và th d hp t. Th d

 Lách to.
HbSC
 Thiu máu, tan máu mn tính, có cn tan máu.
 Lách to.
 au xng.
HbS Thalassemia
 Thiu máu nng, có cn tan máu nh.
 Lách to.

 Du hiu sinh hc ca bnh hng cu hình lim

Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 7

Bng I.2. Các đc đim sinh hc ca bnh hng cu hình lim

Th bnh
Du hiu sinh hc
Th
đng
hp t
HbSS
 Huyt đ: thiu máu, tan máu mn. Hng cu
hình li lim: 40 ậ 100%.
 Ty đ: hng cu tng, có hng cu hình lim.
 Lách đ: thy nhiu hng cu lim.

thay đi hình dng. Kt qu ca đt bin này là vic sn xut mt dng bt thng
ca  -globin là HbS.[44]
Ngi b bnh thiu máu hng cu hình lim th HbSS do nhn yu t di
truyn  th HbS t c cha và m. Do đó  ngi bnh có triu chng thiu máu
hng cu hình lim gây ra bi s thay th 2 tiu đn v  ậ globin bng HbS.[25]
I.2 TÌNH HÌNH BNH THIU MÁU HNG CU HÌNH
LIM
I.2.1 Tình hình trên th gii
Bnh hng cu hình lim ln đu tiên đc công nhn là mt ri lon v huyt
hc do Herrick đa ra vƠo nm 1910. Nm 1949, Pauling công b nghiên cu v
mt loi huyt cu t bt thng chit xut t hng cu các bnh nhân thiu máu có
hng cu hình lim [15,25], đơy là mt cn bnh phân t [15].
Theo báo cáo ca T chc y t th gii (World Health Organisation, WHO)
các bnh v ri lon di truyn hemoglobin ban đu đc trng ca vùng nhit đi và
cn nhit đi nhng hin nay ph bin trên toàn th gii do di c [6,25]. Bnh thiu
máu hng cu hình lim là bnh ph bin trên th gii. Bnh thng gp nht 
nhng ngi Châu Phi,  các nc vùng a Trung Hi nh Hy Lp, Th Nh K
vƠ ụ, bán đo  Rp, n  và khu vc ting Tây Ban Nha  Nam M, Trung M
(đc bit là Panama), và các b phn ca vùng bin Caribean.[25]
Bnh hng cu hình lim tác đng ti hn 1γ triu ngi trên toàn th gii và
nh hng đn hn 70.000 ngi ti Hoa K và có ít nht 75.000 ca nhp vin tn
trên 500 triu USD mi nm đ điu tr các bin chng ca bnh hng cu hình
lim (SCD) [19]. c tính có khong 1/500 ngi M gc Phi vƠ 1/1000 đn
1/1400 ngi M gc Tây Ban Nha b mc bnh này [21,24]. Có khong 2 triu
ngi M hoc 1/1β ngi M gc Phi mang đc đim hng cu hình lim [24].
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 9

 Brazil s ph bin ca bnh thiu máu hng cu hình lim đc c tính t


I.2.2 Tình hình bnh  Vit Nam
 Vit Nam cho đn nm β014, vn cha có s liu thng kê nào c th v
tình hình bnh thiu máu hng cu hình lim, điu này chng t các công trình
nghiên cu phân t v bnh này ti Vit Nam còn rt ít. Chính vì vy vic nghiên
cu này rt thit thc vƠ nên đc tin hƠnh đ tìm hiu tình hình bnh  Vit Nam.
I.3 BIN CHNG CA BNH THIU MÁU HNG CU
HÌNH LIM
Bnh có ph rng gây ra rt nhiu bin chng. Ph bin nht là bin chng do
các t bào hng cu hình lim làm gim kh nng vn chuyn O
2
.  tr em các
hng cu hình lim không có kh nng di chuyn đn các mô, c quan khác trong
c th ( đng trong lách). Do vy, bnh hng cu hình lim dn đn nguy c thiu
máu đt ngt có th gây t vong  tr em. Tr em t 6 đn 18 tháng tui b bnh
thng b sng đau bƠn tay và/hoc bàn chân (hi chng tay-chân). Ngi trng
thành b bnh hng cu hình lim vi th HbSS có các bin chng nghiêm trng
nh đt qu, hi chng ngc cp tính và tn thng c quan.
I.3.1 t qu
t qu là mt bin chng nghiêm trng ca thiu máu hng cu hình lim
[13]. t qu do thiu máu cc b là mt trong nhng bin chng nghiêm trng
nht ca SCD vi mt t l cao  giai đon sm vào la tui 7 và mt t l cao na
vƠo giai đon cui tui trng thành. Du hiu bao gm co git, tê chân tay, mt ý
thc. Mt cn đt qu có th gây t vong [48].
I.3.2 Hi chng ngc cp tính (ACS) [24]
ACS là mt bnh lý phi ph bin thng gn lin vi st, th nhanh, ho, khò
khè và khó th. Nó là mt quá trình cp tính và bin chng đe da tính mng ca
bnh nhân thiu máu hng cu hình lim. Nguyên nhơn thng gp do nhi máu
phi, các t bào hng cu hình lim chn mch máu, ty xng. ACS lƠ bin chng
ph bin th hai ca SCD, vi t l 1β,8 trng hp trên 100 bnh nhơn/nm. Bin

 i vi tr em
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 12

Bnh nh hng đn sc khe ca tr em c v th cht ln trí tu. T l t
vong ca tr em di 5 tui  chơu Phi lƠ 5% vƠ 16% trng hp t vong  các
quc gia tây Phi.
Tr em vi SCA thng xuyên ngh hc nh hng đn quá trình tip thu kin
thc cng nh các hot đng khác. Ezenwosu và cng s (2013) đƣ ghi nhn kt
qu hc tp kém  tr em vi SCA sau khi ngh hc thng xuyên do bin chng
hng cu hình lim  M. SCA có th có mt tác đng trc tip vào kh nng trí tu
ca mt s tr em. Tr em vi SCA có nguy c kt qu hc tp kém vì ch s IQ
đc bit đn là nh hng đn kt qu hc tp [16]. T l đt qu do thiu máu
cc b  nhng ngi có SCA lƠ cao hn bn ln  tr em 2-15 tui, cao hn bt c
la tui khác [23,43]. Các trng hp b đt qu do thiu máu cc b chim 12%
các ca t vong  tr em b bnh SCA [24]. Bnh nhân hng cu hình lim di 15
tui có nguy c phát trin tn thng mch máu nƣo hn so vi nhng ngi trên
15 tui [43]. Tr em SCA cng có th phát trin nhi máu não im lng, trong đó liên
quan đn suy gim nhn thc và kt qu hc tp kém [23]. Khong 11% bnh nhân
di 20 tui b đt qu [13]. 75% ca 300.000 ca sinh trên toàn cu b nh hng
[30,41], c tính 50-80% nhng bnh nhân này s cht trc khi trng thành
[30,40].
 i vi ph n mang thai
S phát trin ca t cung chm, sy thai t nhiên và tin sn git có th xy ra.
Nhau thai tin đo và d bong do thiu oxy máu và nhi máu nhau thai. Khi sinh,
tr s sinh thng sinh non hoc có cân nng thp.[24]
 Ngi ln
Khong 30% bnh nhơn ngi ln b thiu máu hng cu hình lim có tng áp
phi.[24]

bit  mc tng amino acid).
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 14

I.5.4 Phng pháp PCR (Polymerase chain reaction)
Phng pháp PCR ra đi bi Karl Mullis và cng s vƠo nm 1985.[4,5]
 Nguyên tc ca phng pháp PCR:
S sao chép DNA xy ra khi có s tham gia ca DNA polymerase giúp tng
hp mch DNA mi khi đon mi bt cp vi mch DNA khuôn vi vt liu là các
dNTP trong điu kin phù hp. Phn ng PCR là s khuch đi DNA mch khuôn
theo cp s nhân, mi phn ng PCR gm nhiu chu k ni tip nhau, mi chu k
gm ba bc:
Bc 1: Trong hn hp phn ng có đy đ thành phn (dNTP, Mg
2+
, Taq
polymerase, DNA mch khuôn). DNA mch khuôn b bin tính bi tác nhân nhit
đ thành mch đn. Nhit đ này phi cao hn Tm (melting temperature ậ nhit đ
nóng chy ca DNA) ca phân t DNA khuôn mu, thng vào khong 94 ậ 95
0
C
trong vòng 30 giây ậ 1 phút. ơy lƠ giai đon bin tính (denaturation).[4]
Bc 2: LƠ giai đon lai (hybridization), các mi bt cp đc hiu vi mch
khuôn  nhit đ thích hp (thp hn Tm ca các mi). Nhit đ phn ng  giai
đon này ph thuc vào Tm mi s dng, thng dao đng trong khong 40 ậ 70
0
C,
kéo dài t 30 giây ậ 1 phút.
Bc 3: nhit đ đc tng lên khong 72
0