1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
******

BÀI TIỂU LUẬN
KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
VÀ BỆNH VIÊM NÃO XỐP Ở BÒ
(BOVINE SPONGIFORM ENCEPHOLOPATHY)

GVHD: PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải.
Sinh viên thực hiện: Trịnh Thị Huyền Trang
(nên được tả là não thể xốp).Vì thế người ta gọi là bệnh xốp não bò (Bovine
Spongiform Encephalopathy - BSE) hay vẫn được gọi là bệnh bò điên (Mad Cow
desease). Thể bệnh này rất giống với nhiều bệnh khác có cùng triệu chứng và
cách truyền bệnh, bao gồm : bệnh gãi cừu, bệnh xốp não ở chồn, bệnh kuru ở
người (xốp não được tìm thấy ở bộ tộc Papua ở New guine), bệnh CJD
(Creutzfeldt- Jakob Disease) ở người. Những động vật bị bệnh có biểu hiện mất
kh
ả năng phối hợp động tác, không thể điều khiển nổi chân, run, sợ hãi và có thể
ngứa với cường độ mạnh. Đôi khi bệnh thể hiện triệu chứng ngủ gà hoặc triệu
chứng kích động. Thời gian ủ bệnh kể từ khi nhiễm đến khi phát bệnh thường lâu,
nhiều năm. Nhưng khi bệnh đã phát thì con vật sẽ chết sau ít tháng.
Có nhiều bằng chứng về khả năng bệnh bò điên lây sang người, gây một bệnh tiến
triển chậm tác hại đến hệ thần kinh, làm xốp não và dẫn đến cái chết. Điều đó
khiến dư luận thế giới lo ngại và nhiều nước đã cấm việc nhập khẩu bò sống và
các sản phẩm của bò có xuất xứ từ nước Anh. Còn nhiều điểm về bệnh chưa đượ
c
biết rõ, đang trong quá trình nghiên cứu. Nước Anh và nhiều nước khác đã áp
dụng các biện pháp chống dịch nghiêm ngặt nên bệnh đã được khống chế.
Hiện ở Việt Nam chưa phát hiện thấy bệnh này, nhưng chính phủ và Bộ NN
&PTNT đã có nhiều văn bản quy định hạn chế việc nhập bò và các sản phẩm của
bò từ các nước có bệnh. Tuy nhiên, trong sự vận động sôi động của nề
n kinh tế thị
trường mọi người cần luôn cảnh giác để đề phòng bệnh bò điên không xảy ra ở
Việt Nam.
4
II, TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về bệnh viêm não xốp.

năng của não và các tập tính bình thường. Tiến triển của bệnh là sự phá hoại ở đại

5
não và chức năng đại não, giảm các hoạt động thần kinh, cảm giác và mất dần
chức năng nhìn, bệnh nhân chết, 90% bệnh nhân chết sau 1 năm, 5% sau 2 năm và
5% có thể kéo dài đến 10 năm.
Nhưng từ những năm 1990, bệnh này đã xảy ra cả
ở những người trẻ tuổi và ngày càng nhiều. Đến cuối năm 2000 đã có tới 80 người
ở Anh và 2 người ở Pháp chết do ăn phải thịt bò điên đều do hệ thống thần kinh
trung ương bị thoái hóa kéo dài từ 6 tuần đến 8 tháng với triệu chứng là trạng thái
mất cân bằng , mất trí nhớ, rồi dẫn đến liệt chân tay.CJD r
ất dễ nhầm với bệnh
Alzheimer, một căn bệnh lú lẫn ở người cao tuổi. Trí nhớ của người bệnh cũng bị
giảm sút nhanh chóng, khả năng nhận biết ngày một kém, tiến tới quên hết mọi
chuyện và mất khả năng nhận biết. Bệnh Alzheimer chỉ xảy ra ở người cao tuổi,
diễn biến kéo dài nhiều năm trong khi ở bệnh CJD thời gian bộc lộ triệu chứng chỉ
kéo dài vài tháng. Thời gian ủ bệnh của CJD rất dài, có thể 15- 25 năm, nhưng khi
bệnh phát, chỉ 4- 10 tháng sau bệnh nhân đã chết không có thuốc gì chữa được.

Năm 1947, phát hiện ra bệnh xốp não ở chồn TME với cái chết không bình
thường của chồn ở Wiscosin (Mỹ), Canada, Phần lan. Phần lớn chồn bị chết sau
khi có dấu hiệu thần kinh rất ngắn. Thời gian nung bệnh thường là 6 tháng, bở
i vì
chúng sống tách biệt nhau và tách biệt các động vật khác nên con đường truyền
bệnh chỉ có thể là thức ăn. Đánh nhau và ăn thịt nhau ở những con non cũng có thể
là một trong những nguyên nhân truyền lây.

Năm 1956. phát hiện bệnh Kuru ở người. Kuru là một bệnh xuất hiện ở bộ tộc
Fore ở New Guinea. Ở đó tập tục ăn thịt người chết được tiến hành cho đến tậ
n

7
ca mắc bệnh trong khoảng 30.000 đàn bò. Hầu hết trường hợp bệnh là ở giống bò
sữa Holstein/ Friesian.
Sau đó lần lượt một số nước cũng thông báo có bệnh: Thụy Sỹ 205 trường hợp,
Ailen 12 con, Bồ Đào Nha 30 con. Các trường hợp có bệnh lẻ tẻ là Pháp, Đức,
Italia, Đan Mạch, Canada, Oman và quần đảo Falkland.
Trong số các nước có bệnh, nhiều trường hợp do nhập bò có bệnh từ nước Anh.

2.1.3. Tác nhân gây bệnh
.
Trong quá trình nhận diện tác nhân gây bệnh, các cách để làm biến đổi acid
nucleic đều không ảnh hưởng đến mức độ nhiễm , ngược lại các quá trình làm biến
tính protein đều làm giảm mức nhiễm. Điều này chứng tỏ tác nhân gây bệnh là
thành phần protein. Giả thuyết “chỉ do protein” đã được đặt ra bởi Griffith (1967)
và sau đó phát triển bởi Prusiner và cộng sự ( 1982, 1999) sau hơn 15 năm.

Stomley Prusimerr dùng chất chiết xuất từ não của cừu bị bệnh, phá huỷ axit
nucleic (đồng thời cả AND và ARN) mà vẫn không làm mất khả năng gây bệnh
của chất chiết khi tiêm chất chiết này sang não động vật khác. Ngược lại nếu phá

8
huỷ Protein của chất chiết thì khả năng gây bệnh không còn. S.Prusiner cho rằng
tác nhân gây bệnh có bản chất là Protein và ông đặt tên nó là Prion (proteinaceous
infection particle)
. Xác định chuỗi của protein gây bệnh này cho thấy nó giống hệt
cấu trúc của protein PrPc, và được đặt tên là PrPsc.

Normal and diseased prions
PrPc là protein với cấu trúc khoảng 253 ạcid amin ở người và 250 acid amin ở các
loài hữu nhũ khác . Nó được kiểm soát bởi một gene ở nhiễm sắc thể số 2 ở chuột

không thấy dấu vết của nhiễm prion ở não của chúng . Điều này có thể do PrPc là

10
thụ thể tiếp nhận prion.

Một prion bệnh được nhuộm màu (đỏ) được đưa vào qua đường tiêu hóa hoặc tự
phát. Một prion nội sinh của cơ thể (màu xanh) đi vào tương tác với prion bệnh,
chúng được ép sát vào nhau để thay đổi hình dạng của chúng thành prion bị bệnh.
Cuối cùng prion bệnh càng ngày càng tăng do sự chuyển đổi từ prion bình thường
sang prion bệnh, gây ra những thiệt hại cho mô
.
Về vị trí, PrPc thường có ở tế bào thần kinh. Protein này hiện diện trên bề mặt tế
bào thần kinh trong khi PrPsc ở trong tế bào chất.
Prion protein bệnh được tích luỹ
ở trong tế bào tạo thành những túi gọi là Lysosome. Trong não khi tế bào đầy
Lysosome có thể dẫn đến phá vỡ và làm chết tế bào. Khi tế bào chết nó tạo ra các
hố ở trong não. Các prion bệnh được giải phóng và nó xâm nhập vào các tế bào
khác. Như thế, PrPsc có thể đã biến thành PrPsc khi PrPc đi vào tế bào chất trong
quá trình tạo PrPc. 11

Những tế bào liên quan đến bệnh của prion. Nhiều loại tế bào liên quan đến quá
trình vận chuyển của prion (tế bào lympho B và T, tế bào thần kinh, tế bào M)
trong quá trình sao mã của tác nhân lây lan (các neuron, các tế bào follocular
dendritic) trong khoảng trống của prion (vi tế bào thần kinh, tế bào đơn nhân lớn) .
Vì thế, để dẫn truyền tới não, tác nhân lây nhiễm này phải qua ít nhất 2 hàng rào
không thấm, hàng rào của ruột và máu não.
Chuỗi cấu trúc của prion là rào cản giữa các loài. PrPc của ký chủ càng gần cấu

trình ăn và tiêu hóa thịt bị nhiễm bệnh.
Họ nghiền mô não chứa prion của bệnh nhân mắc một dạ
ng bệnh bò điên. Sau đó,
mô được tiếp xúc với một loạt enzym tiêu hoá mạnh ở miệng, dạ dày và ruột, có
tác dụng phân huỷ protein thành các mẩu nhỏ hơn nữa. Kết quả cho thấy: Prion
cũng như một loại protein thứ hai tên là ferritin vẫn nguyên vẹn. Ferritin chứa sắt
và có rất nhiều trong thịt. Hai protein trên dường như bám vào nhau.
Tiếp theo, nhóm nghiên cứu bổ sung một màng tế bào lót ở thành ruột vào mô
hình ruột người. Bằng cách gắn nhãn phát sáng cho prion và ferritin, h
ọ chỉ ra rằng

13
hai protein ''dắt tay nhau'' đi qua tế bào lót nói trên. Singh cho rằng một lượng lớn
prion trong thịt bò nhiễm bệnh đã xâm nhập vào cơ thể bằng con đường này. Một
cuộc nghiên cứu tiến hành năm 2001 cũng cho thấy prion có thể đi qua thành ruột.
Nghiên cứu của Singh có thể giải thích cách prion vượt qua rào cản của các loài
động vật. Nhiều loài động vật có protein ferritin gần như giống hệt nhau, cho phép
ferritin bám vào và vận chuyển các prion lạ từ bò. Singh cho rằng ferritin có th
ể
vận chuyển prion của những động vật hoang dã mắc bệnh xốp não, chẳng hạn như
hươu, nai, vào cơ thể người.
Theo Singh, chặn đứng quá trình vận chuyển ferritin có thể ngăn prion xâm nhập
vào cơ thể người. Tuy nhiên, điều này rất khó có thể thực hiện do mọi người phải
được điều trị vào thời điểm đang bị phơi nhiễm.

Thời kì ủ bệnh: cũng như nhiều bệnh do virus chậm, bệnh bò điên có thời kì ủ
bệnh khá dài, thường là trên 18 tháng.Trong gây bệnh thực nghiệm, thời gian ủ
bệnh của cừu và dê ngắn nhất là 440 ngày và dài nhất là 1720 ngày. Thời gian ủ
bệnh nhân tạo ở bò cũng tương tự như trên.
Tính cảm nhiễm và sức đề kháng.

điều khiển của chủ
nuôi. Bò bệnh có vẻ cảnh giác khi có người đến gần và thường
do dự không vào khoang vắt sữa, đôi khi có thể tấn công người khi bị bắt buộc
phải vào. Khi đi, đầu nghiêng sang một phía, kêu rống. Bò hay tỳ móng vào thành
chuồng, uể oải, cử động mất phối hợp, loạng choạng. Lúc nằm nghỉ bò bệnh rất
thận trọng và thường chọn một chỗ riêng. Bò bệnh đôi khi đứng cúi đầu, cổ v
ươn
thẳng, tai chĩa về phía sau, các cử chỉ bất thường, phần sau không phối hợp, đặc
biệt dễ quan sát khi bò đang ăn cỏ bãi chăn. Triệu chứng tiến triển đôi khi làm bò
ngã, nằm nghiêng. Một tiếng động bất ngờ có thể làm con vật co giật. Đa số bò bị
bệnh bị giết chết trong giai đoạn này vì sản lượng sữa giảm thấp, giảm trọng lượ
ng
và tính tình trở nên không kiểm soát được. Diến biến của bệnh kéo dài khoảng 2- 3
tuần lễ hoặc hàng tháng, cuối cùng bò bị bại liệt dần. Thường nếu bệnh xuất hiện
càng gần thời điểm cai sữa thì càng diễn biến nhanh hơn.
Các triệu chứng cũng có thể tiến triển theo một chiều hướng khác như con vật trở
nên hung dữ, chạy loạn lên, lao đầu vào tường, run rẫy, ngã, bạ
i liệt rồi chết.
Các biến đổi bệnh lý học chỉ thấy được dưới kính hiển vi và giới hạn ở não. Chúng
bao gồm các thoái hóa đối xứng ở 2 bên não, có thoái hóa không bào ở tế bào chất
ở phần chất xám. Khi quan sát dưới kính hiển vi một miếng cắt từ não, có cảm

15
giác như nhìn mặt cắt miếng bọt biển ( đệm mút), vì thế có tên gọi là bệnh viêm
não dạng xốp.
Vị trí bệnh tích thường gặp nhất là ở hành tủy, chiếm 99% trường hợp. Các bệnh
tích của BSE cho thấy đó là một phản ứng viêm mô liên kết thần kinh.
Một đặc điểm nổi bật của bệnh BSE là khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử, chất
chiết từ
não có các sợi fibrin có kích thước từ 100 – 500nm chiều dài, được gọi là

Huyết thanh đông lạnh được xả ở 4°C trong nước đá và 250μL được chuyển
thành những ống ly tâm nhỏ 1,5ml. Ống được ly tâm 4000 vòng trong 25 phút ở
4°C trong một mô hình đầu máy ly tâm 5.214 ghế (Eppendorf, Hamburg, Đức) để
loại bỏ
các mảnh vụn tế bào. Phần nổi trên mặt được chuyển vào một ống sạch và
ly tâm 2000 vòng trong 35 phút. Phần nổi trên mặt đã được lấy ra cẩn thận và viên
kết được sử dụng để phân tích xa hơn.
Tách chiết Nucleic acid
Sử dụng 20.000 × g bột viên với một silica chuẩn dựa trên chiết xuất axit nucleic
theo hướng dẫn của nhà sản xuất . Các axit nucleic được sử dụng ngay lập tức
hoặc đ
ông lạnh ở -80 ° C cho đến khi tiếp tục sử dụng.
Primers.
Mồi được sử dụng trong nghiên cứu này đã được bắt nguồn từ trước khi điều tra
Một thời gian ngắn, hai súc vật bị bệnh BSE và bốn đối chứng bình thường được
sử dụng; dùng mồi CHX-1F và CHX-1R. 1F và CHX-CHX-1R. CHX-1F thì
tương đồng với cDNA của bò tương tự như calmodulin trong khi CHX-1R thì
tương đồng với các đơn vị monomer củ
a Bov-tA.
Giải trình tự.
Mồi CHX-1F và CHX-1R đã được sử dụng trên chiết xuất axit nucleic trong 20μl
PCR với 30-35 chu kỳ ở 48-55°C bắt cặp (60 seconds), 68°C kéo dài (2 min),
and 94°C biến tính (1 min). Mẫu lấy từ các trường hợp bị bệnh BSE , bò khỏe
mạnh làm đối chứng được phủ lên gel polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)
và phân tích như mô tả. Band được cắt ra khỏi gel, tách rửa , và phải chịu sự
reamplification. Các sản phẩm được kết thúc với polymerase T7 DNA và
phosphoryl hóa với polynucleotide kinase và ATP. Hỗ
n hợp phản ứng này đã được
sử dụng cho việc thắt đầu bằng vào một enzyme tiêu hóa SmaI, vector pGEM-


C trong 45
giây, và 68°C trong 1 phút, SybrGreen cđược ghi lại trong một MX4000 PCR hệ
thống (cửa hàng số 401.260). Diện tích dưới đường cong (AUC) của các chức
năng nóng chảy bắt nguồn-d (F) / dT giữa 87°C và 90°C đã được sử dụng để phân
tích. sử dụng cách này vì nó không bị ảnh hưởng bởi các sản phẩm không đặc

18
hiệu: mồi-dimers, mà thường xuyên có thể có mặt do việc sử dụng các SybrGreen
trong PCR. Các mẫu phản ứng của mỗi cá thể đã được tính toán trên cơ sở một
AUC hơn giới hạn phát hiện, ( +5 độ lệch chuẩn). Tất cả các mẫu ban đầu phản
ứng đã được lặp lại. Mẫu hiển thị phản ứng khi retesting được định nghĩa là nhiều
lần.
Phân tích thố
ng kê.
Tỷ lệ phản ứng lặp đi lặp lại trong các nhóm lân cận và nhóm đối chứng khỏe đã
được tính toán và dùng thử nghiệm chi –square . Để so sánh tổng số nhóm thực
hiện 9 bậc tự do , so sánh hai nhóm 2 nhóm với nhau mức độ tự do hạ xuống đến
1.
Điện di.
Tám μl của hỗn hợp PCR đã được trộn lẫn với đệm và cho vào một gel
polyacrylamide đúc sẵn 12-20% trong đệm Tris-borat-EDTA (45mM Tris,
45mM acid boric, 1mM EDTA) (4
đến 20% Tris - borat-EDTA gel; Điện di ở
nhiệt độ môi trường xung quanh trong 45 phút tại 180V. Các gel được nhuộm màu
cho 20 phút trong một giải pháp và chụp ảnh dưới tia UV.
Trình tự của các sản phẩm PCR từ BSE và BSE-tiếp xúc với con bò dựa trên mồi
CHX-1F và CHX-1R đã được gửi cho cơ sở dữ liệu EMBL (nhập số AJ780924 để
AJ780929).

19

Sơ đồ của các kỹ thuật IPCR
Bắt giữ kháng kháng thể của PrP , được hấp phụ lên tấm microwell, được sử
dụng để nắm bắt các kháng nguyên PRP. Các cầu nối của Streptavidin-HRP giữa
một máy dò -kháng thể kháng PRP và phóng 500bp biotinylated. Reporter DNA
được khuếch đại bằng PCR sử dụng một probe huỳnh quang để phân tích thời
gian thực.
III/ KẾT LUẬN.
Bệnh viêm não xốp ở bò là một bệnh truyền nhiễm khá đặc biệt mới được phát
hiện ở Anh vào nửa cuối thập kỷ 80.Tác nhân gây bệnh còn nhỏ hơn cả virus gọi
là prion là các tiểu phần protein có khả năng gây nhiễm. Bệnh đã được phát hiện ở
nhiều trại nuôi bò của nước Anh. Sau đó có lẽ do việc xuất bò sống hoặc sản phẩm

21
của bò, bệnh đã được phát hiện ở nhiều nước Châu Âu và các lục địa khác tuy số
lượng không nhiều.
Người ta sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau để phát hiện ra bệnh viêm não xốp ở
bò. Kỹ thuật PCR được dùng được dùng để phát hiện yếu tố SINEs (cell stress-
related short interspersed nucleotide elements) một đoạn ngắn các nucleotide có
tính mất ổn định hiện diện ở vùng trung tâm bảo toàn của PrPc trong huyết thanh
gia súc liên quan đến b
ệnh BSE. Sử dụng một cặp mồi (CHX-1F/CHX-1R) cho
thấy không có phản ứng với nhóm đối chứng là động vật khỏe mạnh nhưng có
phản ứng với nhóm mang bệnh BSE.
Ngoài ra người ta còn sử dụng kỹ thuật IPCR là một kỹ thuật nhờ đó mà khả năng
khuếch đại của PCR là đi đôi với phát hiện của các protein bệnh cho kháng thể
trong một định dạng ELISA.
IV/ TÀI LIỆU THAM KHẢO.

1. Trần Thị Dân, ,2005,công nghệ sinh học trong chăn nuôi gia súc, NXB
Nông nghiệp.