Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong
phân tích đa dạng cà định dạng của tập đoàn
cây Dó Bầu ( Aquilaria SP.) tại Hà Tĩnh

Hoàng Đăng Hiếu

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Khoa Sinh học
Luận văn Thạc sĩ ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70
Người hướng dẫn: PGS.TS. Chu Hoàng Hà
Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Tổng quan về cây dó bầu; phương pháp sử dụng trong việc định danh loài
và xác định quan hệ di truyền; DNA barcode - quan điểm mới trong phân loại; locus
được sử dụng trong phương pháp DNA barcode ở thực vật; tình hình nghiên cứu
DNA barcode ở thực vật. Tìm hiểu một số kết quả trong nghiên cứu về cây dó bầu
tại Việt Nam và trên thế giới, Nghiên cứu thu thập 18 mẫu lá các cây dó dầu tại Hà
Tĩnh, Phú Quốc và tại Lào, tách chiết tinh sạch DNA. Sử dụng phương pháp PCR để
nhân bản đoạn gen quan tâm với mồi đặc hiệu. Tách dòng đoạn gen và xác định
trình tự gen. Đưa ra kết quả và thảo luận: kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng
số; tìm nhiệt độ gắn mồi đăc hiệu của phản ứng PCR; nhân bản gen với các cặp mồi;
kết quả tách dòng gen; xác định và phân tích trình tự nucleotide của các đoạn DNA
chỉ thị.

Keywords. Di truyền học; Cây dó dầu; Sinh học phân tử

Content

1. Đặt vấn đề
Cây dó bầu (Aquilaria sp) là một trong những loài thực vật đặc hữu của nước ta, cây

Hình 1. Kết quả điện di DNA tổng số của một số mẫu dó bầu nghiên cứu
Kết quả sau khi điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm bằng Ethidium bromide (hình
1) cho thấy DNA thu được sau khi tách có chất lượng tốt, DNA không bị đứt gẫy, các băng
vạch đều sáng rõ.
3.2. Tìm nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu của phản ứng PCR
Bốn cặp mồi chúng tôi tiến hành nghiên cứu được thiết kế dựa theo Vijayan và Tsou
(2010). Chúng tôi tiến hành thử nghiệm nhiệt độ gắn mồi của 4 cặp mồi và kiểm tra kích
thước nhân bản thực tế của 4 gen này với 18 mẫu dó bầu. Sau quá trình thử nghiệm với các
dải nhiệt độ gắn mồi khác nhau, đã xác định được nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu cho 4 cặp mồi
nghiên cứu và kích thức nhân bản của 4 gen này so với dự đoán ban đầu có sự thay đổi thể
hiện trên bảng 1.
Bảng 1 Nhiệt độ bắt mồi và kích thước gen của các cặp mồi nghiên cứu
STT
Vùng gen
nhân bản
Ký hiệu
mồi
Kích thước
đoạn gen nhân
bản
Nhiệt độ bắt
cặp mồi lý
thuyết
Nhiết độ bắt cặp
mồi thực tế
1
rbcL
P2F
750 bp
53

57
P12R

76

3.3. Kết quả nhân bản gen với các cặp mồi nghiên cứu
Sau khi tối ưu được nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu chúng tôi đã tiến hành nhân bản bằng
phản ứng PCR với 4 cặp mồi nghiên cứu. Kết quả cho thấy 18 mẫu dó bầu nhân bản tốt với 4
cặp mồi nghiên cứu.

Hình 2. Kết quả PCR gen ITS
Hình 3. Kết PCR gen psbA – trnH Hình 4. Kết quả PCR gen rpoB
Hình 5. Kết quả PCR gen rbcL
3.4. Kết quả tách dòng gen
3.4.1 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel)
Sản phẩm PCR thu được sau phản ứng khuếch đại gen có các tạp chất như mồi, đệm
PCR, các nucleotide, còn dư, và đôi khi có thể chứa các sản phẩm phụ sẽ ảnh hưởng đến kết
quả của quá trình tách dòng, do vậy cần tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR trước khi tiến
hành quá trình đưa gen vào vector tách dòng.
Các đoạn gen sau khi tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0.8% để
kiểm tra chất lượng và xác định sơ bộ hàm lượng DNA tinh sạch, kết quả thể hiện ở hình 6.

Hình 6. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR gen rpoB
M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4,
T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch ở hình 6 cho thấy chỉ có một băng vạch
có kích thước tương ứng với đoạn gen được nhân lên bằng mồi barcode tương ứng. Các băng

cặp mồi vector pUC-18.

Hình 8. Kết quả điện di sản phẩm PCR - clony khuẩn lạc mồi rbcL
M : thang Marker 1Kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,
22, 23, 24 : Các khuẩn lạc.
Mồi pUC18 được thiết kế nằm trên vector pBT và ở hai phía đối với đoạn cắt đa
điểm. Khoảng cách giữa 2 mồi trên vector vào khoảng 200 bp. Do đó khi tiến hành phản ứng
clony - PCR các khuẩn lạc trắng do vector tự đóng vòng sẽ thu được băng có kích thước
khoảng 200 bp, còn với plasmid tái tổ hợp còn các plasmid tái tổ hợp nhận được đoạn gen sẽ
có kích thước bằng kích thước gen cộng thêm 200 bp.
Mồi rbcL nhân lên đoạn gen barcodes có kích thước vào khoảng 750 bp, kết quả điện
di trên hình 3.8 xuất hiện các băng vạch duy nhất có kích thước vào khoảng hơn 900 bp. Như
vậy bước đầu cho thấy các dòng khuẩn lạc đều mang gen quan tâm trừ dòng số 1, 4, 5, 7, 8, 9,
11, 12, 17, 24 vì những dòng khuẩn lạc này không có băng vạch chúng ta quan tâm.
Các mồi còn lại cũng được tiến hành tương tự và đã thu được các dòng khuẩn lạc
mang gen cần quan tâm.
3.4.5. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp
Sau khi các dòng khuẩn lạc chứa đoạn gen ở trên được lựa chọn sẽ được nuôi trong 3
ml môi trường LB lỏng có bổ sung carbenicillin 50 mg/l, lắc 200 vòng/phút qua đêm, sau đó
tiến hành tách plasmid sau đó plasmid được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8%.

Hình 9. Kết quả điện di plasmid tách chiết
M : thang maker 1kb; T1,T2,T3,T4,T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14, M1, Qx, G1, PQ64 : các
plasmid của mồi rbcL
Qua kết quả điện di plasmid hình 9 ta thấy các plasmid tái tổ hợp đều có 3 băng rõ nét
không bị đứt gẫy. Để kiểm tra chính xác sự có mặt của DNA đã được biến nạp chúng tôi tiến
hành xử lý plasmid thu được bằng enzyme cắt giới hạn BamHI.
3.4.6. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp
Các plasmid sau khi tách chiết cần tiến hành cắt kiểm tra plasmid bằng enzyme giới
hạn BamHI để khẳng định plasmid có mang đoạn gen quan tâm hay không. Theo lý thuyết

khác giữa 18 mẫu nghiên cứu, tuy nhiên những sai khác này là những sai khác điểm nhỏ lẻ có
thể bắt nguồn từ sự sai khác trong quá trình PCR vì emzym Taq polymerase không có hoạt
tính sửa chữa trong quá trình PCR. Phân tích trình tự đoạn gen rpoB cho thấy độ tương đồng
khi so sánh 18 mẫu dó bầu nghiên cứu và trình tự A.sinensis đã được đăng trên ngân hàng
GenBank có độ tương đồng rất cao (99,0 - 100%). Điều này càng khẳng định tính bảo thủ của
hệ gen lục lạp ở thực vật.
3.5.3. Kết quả xác định và phân tích trình tự vùng gen lục lạp rbcL
Đoạn gen phân tích được có kích thước 734 bp phù hợp với kích thước ban đầu, trong
kết quả phân tích trình tự thấy xuất hiện những vị trí sai khác của 18 mẫu dó bầu nghiên cứu
đặc biệt ở vị trí 43 có sự thay đổi nucleotit A bằng G của với 6 mẫu Dó bầu nghiên cứu là
AL2, AL6, AL8, M1, Qx, PQ64 so với 12 loài dó bầu còn lại. Đây là hai nhóm có xuất xứ
cách xa nhau về mặt địa lý, các mẫu AL2, AL6, AL8, M1, Qx, PQ64 có xuất xứ từ Lào và
Phú Quốc, các mẫu còn lại có xuất xứ từ Hà Tĩnh. Đây có thể coi là một dấu hiệu để bước
đầu phân biệt 18 cá thể dó bầu mà chúng ta nghiên cứu dù hệ số tương đồng của 18 mẫu vẫn
rất cao ( 99,0 - 100% ).
3.5.4. Kết quả xác định và phân tích trình tự gen ITS
Kết quả phân tích trình tự cho thấy gen ITS có kích thước 655 bp, hệ số tương đồng di
truyền giữa các mẫu vẫn cao ( 91,1 - 100%) tuy nhiên trong trình tự xác định được xuất hiện
nhiều sai khác có giá trị có thể sử dụng để phân loại đặc biệt là ở các vị trí 196, 455, 536, 596
611, 612. Một số sai khác được liệt kê trong bảng 2. Với những sai khác ở những vị trí trên
đã bổ xung thêm cơ sở để xác định phân loại 18 mẫu dó bầu nghiên cứu.
Bảng 2. Các vị trí sai khác dùng để phân loại của đoạn gen vùng ITS
STT
Tên
mẫu
Vị trí dùng để phân loại
113
131
196
217

3
AL 08
C
T
T
C
C
G
A
A
G
T
4
G 1
C
T
T
C
C
G
A
A
G
T
5
T 1
T
T
C
T

8
T 4
T
C
C
T
T
C
G
G
A
C
9
T 6
C
T
T
C
C
G
A
A
G
T
10
T 7
C
T
T
C

13
T 10
C
T
T
C
C
G
A
A
G
T
14
T 11
C
T
T
C
C
G
A
A
G
T
15
T 14
T
C
C
T

18
M1
C
T
T
C
C
G
A
A
G
T

T7
QX
A crassna AY920326
M1
Al8
A crassna AY920327
T11
T8
A sinensis FJ980392
A sinensis EF645836
G1
PQ64
Al6
Al2
A sinensis GQ891956
A sinensis EF645834
A sinensis EF645833

Qx, PQ64, M1, T6, T7, T8, T9, T10, T11 cùng với A.crassna và A. sinensis, nhóm thứ hai
bao gồm các 5 mẫu còn lại. Các mẫu T1, T2, T3, T4, T14 phân thành 1 nhóm phân loại riêng
với so với các loài A.crassna, A.sinensis, A.rugosa, A.yunasensis với chỉ số bootstrap 99,9%,
có thể kết luận các mẫu này không thuộc 4 loài trên. Ở Việt Nam hiện nay ngoài 4 loài trên
còn có 2 loài Dó Bà Nà (A.banacensis) và Dó Mã Lai (A. malacensis), tuy nhiên trình tự hai
loại này chưa được nghiên cứu. Nhiều khả năng các mẫu này là một trong hai loài trên. vì vậy
cần sử dụng thêm các chỉ thị khác và các mồi barcode khác để có thể có kết luận chính xác
hơn. Trình tự đoạn ITS của các mẫu T6, T7, T8, T9, T10, T11, các mẫu M1, QX, PQ64, G1
thu thập tại Phú Quốc và 3 mẫu thu thập ở Lào không có khác biệt tin cậy (25-47%) so với
trình tự này của các loài A crassna và A. sinensis.
Từ kết quả phân tích chúng tôi nhận thấy rằng mối tương quan di truyền giữa 18 mẫu
dó bầu được nghiên cứu là tương đối cao, Chỉ số tương đồng di truyền khoảng (91,1-100%).
Các mẫu dó bầu có mức độ đa dạng di truyền thấp, tính bảo thủ cao điều này đã được chứng
minh rõ ràng khi chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số chỉ thị đối với hệ gen lục lạp như
trên.
3. Kết luận và kiến nghị
4.1. Kết luận
- Đã tách chiết và tinh sạch được DNA tổng số của 18 mẫu dó bầu trong đó có 3 loài
của Lào, 4 mẫu thu tại Phú Quốc và 11 mẫu thu tại Hà Tĩnh.
- Đã nhân bản thành công các đoạn gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, ITS bằng phương
pháp PCR từ DNA tổng số của 18 mẫu dó bầu.
- Đã xác định được trình tự nucleotide của 4 đoạn gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, trnL
của 18 mẫu dó bầu.
- Xuất hiện được những sai khác ở 4 gen này tuy nhiên gen trnH-psbA và rpoB khó có
thể sử dụng để phân loại vì những sai khác này là do quá trình nhân bản.
- Với rbcL gen và ITS đã tìm được những sai khác có tính hệ thống và có giá trị trong
việc sử dụng để phân loại.
4.2. Kiến nghị
- Tiếp tục sử dụng phương pháp DNA bacode trong phân loại và xác định loài ở Việt
Nam.

10. Aron J. F., Kevin S. B., Prasad R. K., Sean W. G., Steven G. N., Brian C. H., Diana M.
P., Mehrdad Hajibabaei, Spencer C. H. B. (2008), “Multiple multilocus DNA
barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well”. PLoS
ONE, 3(7), pp. 2802.
11. Barden A., Awang A.N., Mulliken T., Song M. (2000),“Heart of the matter: agarwood
use and trade and CITES implementation for Aquilaria malaccensis”.
12. Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W. (2003),
“Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal
angiosperms”, J. Evol. Biol, (6), pp. 558-576.
13. Chakrabarty K., Kumar A., Menon V. (1994) “Trade in Agarwood. TRAFFIC-India
Publications, New Delhi”, published by Avenash Dutta.
14. Chase M. W., Nicolas S., Mike W., James M. D., Rao P. K., Nadia H., and Vincent S.
(2005), “Land plants and DNA barcodes: short-term and long-term goals”, Philos
Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462), pp. 1889-1895.
15. CITES (2004), “Thirteenth Meeting of the Conference of the Parties. Amendments to
Appendices I and II of CITES”. Bangkok, Thailand, 3-14 October 2004 unpublished.
16. Gonzalez M. A., Baraloto C., Engel J., Mori S. A., Pe´tronelli P. (2009), “Identification of
Amazonian trees with DNA barcodes”, PLoS ONE 4(10), pp. 7483.
17. Harvey M., Botha F.C., (1996), “Use of PCR-based methodologies for the determination
of DNA diversity between Saccharum varieties”, Euphytica, (89), pp. 257-265.
18. Kiet L., Kessler PJA. and Eurlings M. (2005), “A new species of Aquilaria
(Thymelaceaceae) from Vietnam”, Blumea, (50), pp. 135-141.
19. Kress W. J., Erickson D. L. (2008), “DNA barcodes: Genes, genomics, and
bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp. 2761-2762.
20. Michiho I., Ken I. O., Toru Y., Gisho H., Fumiyuki K., Yasuo S. (2005) ,“Induction of
sesquiterpenoid production by methyl jasmonate in Aquilaria sinensis cell suspension
culture”, Journal of Essential Oil Research, 17(2), pp. 175-180.
21. Nurita T. M., Dewi R., Anidah (2009), “ Genetic variations among aquilaria species and
gyrinops vetseegii using amplified fragment length polymorphism markers”
Biotropia, Vol. 16 (No.2), pp. 88 - 95.

DNA”, Lindleyana (15), pp.96114.
33. Valentini A., Miquel C., Nawaz M. A., Bellemain E. V. A., Coissac E., (2009), “New
perspectives in diet analysis based on DNA barcoding and parallel pyrosequencing:
the trnL approach”, Molecular Ecology Resources (9), pp. 51-60.
34. Valentini A, Miquel C, Taberlet P (2010) “DNA barcoding for honeybiodiversity”,
Diversity 2, pp. 610-617.
35. Van DeWiel C. C. M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J. L., Duistermaat C. H.,
Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species,
floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”,
Molecular Ecology Resources (9), pp.1086-1091.
36. Vijayan K. and Tsou C. H. (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new
perspective”, Current science, vol. 99, pp. 1530 - 1540.
37. Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R. (2010) “DNA barcoding of the
Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology (10), pp.205.
38. Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S. D. (2006), “Combining
bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single-copy orthologous
genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the
euasterid plant clade”, Genetics (174), pp. 1407-1420.
39. Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J. (2010), “Use of ITS2 region as theuniversal DNA
barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5), pp.13102.
40. Yong H. L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L. and Hui Y. (18 December,
2010) “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”,
Journal of Medicinal Plants Research Vol. 4(24), pp. 2706-2709.
Tài liệu Internet
41.
42. />Nghe/Cay-Do-Bau/
43. huong
44.
45. ).