M U ........................................................................................................4
Ch ơng 1. Tổng quan tài liệu ........................................................................... 6
1.1. Giới thiệu về cây lạc ............................................................................. 6
Ch ơng 2. ( ngắn gọn và gộp những cáci gì giữa vừng và lạc) ......................... 6
2.1.1. Nguồn gốc, phân loại, và phân bố ................................................ 6
2.1.1.1. Nguồn gốc ............................................................................ 6
2.1.1.2. Phân loại .............................................................................. 6
2.1.1.3. Sự phân bố của lạc ............................................................... 7
a. Diện tích, sản lợng trồng lạc của các nớc trên thế giới....................................................8
2.1.2. Di truyền học cây lạc .................................................................... 8
2.1.3. Tình hình sản xuất lạc .................................................................. 8
2.1.3.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới ....................................... 8
2.1.3.2. Tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam ........................................ 9
2.1.4. Một số ph ơng pháp chọn tạo giống cây lạc và vừng ................... 11
2.1.4.1. Xây dựng tập đoàn giống và cảI tiến quần thể .................... 11
2.1.4.2. Chọn tạo giống lạc bằng ph ơng pháp lai hữu tính ............... 11
2.1.4.3. Xử lý đột biến ...................................................................... 12
2.2. Giới thiệu về cây vừng ........................................................................ 13
2.2.1. Nguồn gốc, Phân loại và phân bố ............................................... 13
2.2.2. Tình hình sản xuất vừng ............................................................. 14
2.3. ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc phân tích đa hình kiểu
gen ............................................................................................................ 15
2.3.1. Ph ơng pháp phân tích RAPD (Random Aplified Polymorphic
DNA) ..................................................................................................... 15
2.3.1.1. Nguyên lý ........................................................................... 15
2.3.1.3. u nh ợc điểm của ph ơng pháp RAPD ................................... 17
2.3.1.4. ứng dụng ............................................................................ 17
2.3.2. Ph ơng pháp phân tích SSR (Simple Sequence Repeats) ........... 19
2.3.2.1. Nguyên lý ........................................................................... 19
2.3.2.2. Ph ơng pháp ........................................................................ 20
2.3.2.3. u nh ợc điểm ....................................................................... 20
4.2.1.4. Mối quan hệ di truyền giữa các giống lạc dựa trên phân tích
SSR. ................................................................................................. 39
f. Sơ đồ hình cây tập đoàn giống lạc theo hệ số của và kiểu phân nhóm gì??....42
g. Biểu đồ đa chiều (MDS) biểu diễn mối quan hệ giữa các giống lạc nghiên cứu (chú ý: thứ tự
ký hiệu các giống theo phụ lục 1).....................................................................................................43
4.2.2. Phân tích tính đa hình ADN vừng bằng ph ơng pháp RAPD ........ 43
4.2.2.1. Số phân đoạn và tần số xuất hiện các phân đoạn ............. 44
4.2.2.2. Sản phẩm RAPD với mồi UBC336 ...................................... 46
h. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của quần thể vừng với mồi UBC336..................47
4.2.2.3. Sản phẩm RAPD với mồi UBC302 ...................................... 47
i. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của tập đoàn vừng nghiên cứu với mồi UBC302.48
4.2.2.4. Mối quan hệ di truyền của các giống vừng nghiên cứu ....... 49
j. Sơ đồ hình cây các giống vừng nghiên cứu.................................................................51
2
k. Biểu đồ đa chiều (MDS) của các giống vừng dùng trong nghiên cứu........................51
4.3. Xác định mức độ sai khác của các dòng lạc/vừng đột biến bằng ph ơng
pháp phân tử ............................................................................................. 52
4.3.1. Xác định mức sai khác của các dòng lạc đột biến bằng ph ơng
pháp SSR .............................................................................................. 52
4.3.1.1. Sản phẩn SSR của mồi L25 đối với các dòng lạc đột biến .. 52
l. Kết quả điện di sản phẩm SSR của các dòng lạc đột biến với mồi L25....................52
4.3.1.2. Sản phẩm SSR của mồi L41 đối với các dòng lạc đột biến . 53
m. Kết quả điện di sản phẩm SSR của các dòng lạc đột biến nghiên cứu với mồi L29 53
4.3.1.3. Số phân đoạn và tần số xuất hiện các phân đoạn ............. 54
n. Sơ đồ hình cây các dòng lạc đột biến từ giống lạc VD2 nghiên cứu.........................57
o. Biểu đồ đa chiều (MDS) của các dòng lạc đột biến từ giống lạc VD2 dùng trong nghiên cứu
...........................................................................................................................................................57
p. Sơ đồ hình cây các dòng lạc đột bién từ giống lạc L9801 nghiên cứu.......................60
q. Biểu đồ đa chiều (MDS) của các dòng lạc đột biến từ giống lạc L9801 dùng trong nghiên cứu
...........................................................................................................................................................60
4
Việc cải thiện giống bằng các phương pháp truyền thống như lai tạo, đột biến
đã làm năng suất tăng đáng kể đối với cây lạc, vừng. Chọn tạo giống cổ điển thường
mất rất nhiều thời gian và công sức.. Hơn nữa, vệc lựa chọn các giống làm bố mẹ
thường chỉ dựa vào kiểu hình để đánh giá kiểu gen, vì thế nên hiệu quả tạo giống
chưa cao.. Với sự hỗ trợ của sinh học phân tử đã giúp đẩy nhanh quá trình chọn tạo
giống mà không bị chi phối bởi môi trường. Hàng loạt các chỉ thị phân tử dựa trên
các kĩ thuật như: AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RAPD (Radom
Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeat)… đã được nghiên
cứu và từng bước áp dụng vào chọn giống cây trồng trong đó có mục đích để bảo tồn
giống và đánh giá đa dạng kiểu gen. Chỉ thị phân tử đã khắc phục được những thiếu
sót, hạn chế của phương pháp truyền thống trước đây, đặc biệt là xác định khoảng
cách di truyền. Chỉ thị RAPD và SSR hiện đang được áp dụng rất có hiệu quả ngay ở
Việt Nam trong chọn tạo các giống lúa mới kháng rày nâu, đạo ôn (Nguyễn Thị Lang
và CS, 2002). Tuy nhiên ở nước ta, việc cải tạo các giống cây lạc/vừng bằng ứng
dụng các chỉ thị phân tử mới bắt đầu được nghiên cứu.
Nhằm bước đầu cung cấp các thông tin di truyền, góp phần lưu giữ, duy trì
nguồn gen đa dạng của tập đoàn giống lạc và vừng ở phía Nam, đồng thời làm cơ sở
khoa học cho việc lựa chọn bố mẹ sử dụng trong các tổ hợp lai phù hợp theo mục
đích của người tạo giống, công trình nghiên cứu này là sử dụng hai loại chỉ thị
RAPD và SSR để “ Phân tích đa dạng ADN tập đoàn một số giống cây lấy dầu
(lạc, vừng) và đánh giá mức độ thay đổi phân tử của các dòng cây mới chọn tạo
được”.
5
Chơng 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Giới thiệu về cây lạc
Chơng 2. ( ngắn gọn và gộp những cáci gì giữa
vừng và lạc)
2.1.1. Nguồn gốc, phân loại, và phân bố
2.1.1.1. Nguồn gốc
châu Phi rồi từ đây, theo các thuyền buôn nô lệ, lạc lại đợc đa trở lại châu Mỹ
và cả châu Âu. Chính sự giao lu chéo rộng rãi này đã hình thành nên nhiều
vùng gen thứ cấp và làm phong phú thêm hệ gen của lạc [12].
Hiện nay, lạc đợc trồng ở hơn 100 nớc trên thế giới, với tổng diện tích
trên 21 triệu ha. Châu á chiếm 63.4% diện tích, sản lợng chiếm 71.7%; châu
Mỹ chiếm 31.3% diện tích, sản lợng chiếm 18.6% và Bắc Trung Mỹ chiếm
3.7% về diện tích, sản lợng 7.5% (hình 1).
Diện tích Sản lợng
7
Những
nớc sản xuất
lạc quan trọng
ở châu á là
Trung Quốc, ấn Độ , Thái Lan, Việt Nam và Indonesia. Trong đó, ấn Độ có
diện tích trồng lớn nhất trên 8 triệu ha.
ở Việt Nam, tổng diện tích trồng lạc khoảng 270000 ha (số liệu năm
2000) và phân bố trên tất cả các vùng sinh thái nông nghiệp của Việt Nam
[10].
2.1.2. Di truyền học cây lạc
Kawakami (1930) đã xác định số lợng nhiễm sắc thể của lạc A.
hypogaea là 2n=4x=40. Husted (1931, 1933) đã xác định đợc 40 nhiễm sắc
thể soma của 6 giống lạc thơng phẩm và 16 dòng của những giống lạc trồng
trọt. Xác nhận số đơn bội của lạc n=2x=20 ở một số dạng Valencia đứng và
hai dạng thân bò. Patel và Narayana (1937) cũng thông báo n=2x=20 nhiễm
sắc thể đơn bội và 40 nhiễm sắc thể soma ở hai giống lạc đứng small japan
và Gudiyaham Bunch . Nh vậy, số nhiễm sắc thể đặc trng cho các giống
khác nhau của loài A. hypogaea là 2n=4x=40 [37], [18].
2.1.3. Tình hình sản xuất lạc
2.1.3.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới
Lạc là cây lấy dầu và cung cấp thực phẩm quan trọng. Nó là cây cung
2003) [38]. Điều đó chứng tỏ Mỹ là nớc đứng đầu về áp dụng các tiến bộ khoa
học kỹ thuật.
2.1.3.2. Tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam
ở nớc ta, lạc đợc trồng rộng rãi trên nhiều loại đất và địa hình khác
nhau. Diện tích trồng lạc có xu hớng tăng mạnh những năm trớc đây và nay
có xu hớng ổn định diện tích 245- 247 triệu ha (bảng 1)
Bảng 1: Diễn biến sản xuất lạc ở nớc ta
Năm
Diện tích
(1000ha)
Năng suất
(tạ/ha)
Sản lợng
(tấn)
1939 4,6 7,4 3,4
1955 17,7 8,3 14,5
1965 85,9 9,42 80,9
1973 81,5 9,66 78,7
1985 231,0 9,5 202,4
1993 217,1 11,9 259,3
1994 248,2 11,9 294,4
9
1995 259,9 12,9 334,6
1998 269,4 14,3 386,0
1999 247,6 12,8 318,1
2001 244,6 14,8 363,1
2002 246,7 16,2 400,4
Từ năm 1990 đến nay, công tác nghiên cứu và chuyển giao tiến bộ kỹ
thuật trồng lạc ở nớc ta đã đợc quan tâm hơn trớc. Các đề tài nghiên cứu cấp
Nhà nớc, cấp Ngành, các dự án trong nớc và Quốc tế về nghiên cứu, chuyển
này. Tập đoàn giống gồm các giống có nguồn gốc khác nhau: các giống có
thể thu thập từ các địa phơng hay nhập nội
Từ tập đoàn giống, ta tiến hành các thí nghiệm so sánh, khảo nghiệm
để xác định giống tốt cho sản xuất, một số giống khác lại đợc dùng làm
nguyên liệu cho lai tạo hoặc xử lý đột biến. Từ năm 1991 1995, bằng ph ơng
pháp chọn lọc cá thể, dòng lạc VD1 đợc chọn tạo từ giống địa phơng Lỳ. Qua
đánh giá giống VD1 cho năng suất cao hơn giống đối chứng địa phơng Lỳ
19%, hàm lợng dầu cao hơn 3%... Hiện tại, VD1 đã đợc Bộ Nông nghiệp &
PTNT cho phép khu vực hóa phía Nam.
Hiện nay, thông qua các bớc đánh giá, tuyển chọn từ các giống nhập
nội chúng ta đã tuyển chọn đợc nhiều giống lạc cho năng suất cao, thích hợp
với các điều kiện sinh thái khác nhau. Các giống hiện đợc trồng phổ biến rộng
rãi ở phía Bắc là L14, L18 Đều là những giống có nguồn gốc nhập nội từ
Trung Quốc đợc Trung tâm NC & TN Đậu đỗ Viện KHNN Việt Nam chọn
tạo [10] [12].
Ngày nay, ngoài việc đánh giá tập đoàn giống bằng các chỉ thị hình
thái, ngời ta còn đánh giá tập đoàn giống bằng các phơng pháp chị thị phân tử
(RAPD, SSR, RFLP, AFLP ). Nhờ các chỉ thị này mà chúng ta biết đ ợc
khoảng cách di truyền giữa các giống, tạo việc lựa chọn bố mẹ cặp lai phù
hợp.
2.1.4.2. Chọn tạo giống lạc bằng phơng pháp lai hữu tính
Lai giống là phơng pháp cơ bản để tạo ra biến dị tổ hợp phục vụ cho
chọn lọc. Nhờ lai giống mà có thể phối hợp đợc các đặc tính và tính trạng có
lợi của các dạng bố mẹ và con lai. Tuy nhiên, bố mẹ truyền cho con cái bộ
gen của chúng và kết quả của quá trình tái tổ hợp mà nhiều kiểu gen mới đợc
11
tạo ra, sau khi tơng tác với môi trờng đã tạo ra các kiểu hình mới rất có ích
cho chọn giống. Đó là cây kiểu thâm canh, kiểu cây lý tởng ở lúa, hàm lợng
dầu siêu cao ở hớng dơng...
Một hiệu ứng đặc biệt nhận đợc trong lai giống là hiệu ứng u thế lai biểu
5-30 phút. Xử lý phóng xạ bằng phơng pháp xử lý hạt khô.
- Chọn lọc sau xử lý
12
Chọn lọc cá thể từ M1-M4, chọn các dòng ổn định để tiến hành chọn
lọc quần thể. Quần thể đột biến ổn định từ M8 và sau đó có thể tiến hành
nhân giống [13].
Giống lạc V79 là giống lạc quốc gia đợc Viện KHNN Việt Nam chọn tạo
bằng phơng pháp xử lý đột biến tia gamma Co
60
liều lợng 5kr [10].
2.2. Giới thiệu về cây vừng
2.2.1. Nguồn gốc, Phân loại và phân bố
Cây vừng (Sesamum indicum L.) là cây công nghiệp ngắn ngày và là
cây lấy dầu quan trọng. Cây vừng thuộc họ vừng (Pedaliaceae) gồm 16 chi
với 60 loài. Có khoảng 37 loài thuộc chi Sesamum nhng chỉ Sesamum
indicum là loài duy nhất đợc con ngời sử dụng trong trồng trọt. Về di truyền
học, vừng là cây lỡng bội 2n = 2x = 26 [46].
Vừng là cây lấy dầu cổ xa nhất, có nguồn gốc từ Nam Phi. Tại đây còn
rất nhiều vừng hoang dại cho hạt, nhng có vị đắng. ở Babylon và Assyria
vừng đã đợc đánh giá là cây lấy dầu có giá trị cao cách đây 4000 năm [39].
Theo nhiều con đờng khác nhau, vừng đã lan tỏa ra khắp Châu Phi, Trung
Mỹ, Nam Mỹ, miền Trung á, ấn Độ, Trung Quốc, các nớc Đông Nam á trong
đó có Việt Nam. Vừng có mặt ở các vùng nhiệt đới, á nhiệt đới và một phần
ôn đới vào lúc thời tiết cha bắt đầu lạnh giá. Vừng chỉ có thể nảy mầm khi
nhiệt độ đất trên 20
0
C và phát triển ở nhiệt độ dới 30
0
C. Sản phẩm chính của
vừng là hạt, hạt vừng chứa bình quân 50% dầu thực vật, 25% protein, 5% chất
800,000
2 Trung Quốc 650,000
3 Myanmar 380,000
4 Sudan 325,000
5 Uganda 110,000
6 Nigeria 75,000
7 Pakistan 68,000
8 Bangladesh 50,000
9 Cộng hòa Trung Phi 42,800
10 Liên minh Cộng hòa Tanzania 41,000
11 Thái Lan 40,000
12 Ethiopia 39,000
13 Ai Cập 37,000
14 Guatemala 35,049
15 Iran (Islamic Republic of) 33,000
16 Việt Nam 30,000
17 Paraguay 30,000
18 Burkina Faso 29,000
14
19 Somalia 28,400
20 Mehico 22,593
Hiện nay, các nghiên cứu về cây vừng ở nớc ta còn rất hạn chế, năng
suất vừng còn thấp. Các giống vừng hiện trồng chủ yếu là các giống nhập nội
nh V6, V36... Tại trung tâm NC & TN đậu đỗ, năm 2001 đã chọn tạo đợc
giống vừng đen VĐ10 có nguồn gốc từ Minh Lộc Hậu Lộc Thanh Hóa.
Qua một số nghiên cứu khảo nghiệm ở một số địa phơng thì VĐ10 cho năng
suất cao hơn cả V6 và V36 [17].
2.3. ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc
phân tích đa hình kiểu gen
nucleotide trong genome có 10 gốc bổ trợ sẽ vào khoảng 1/4
10
1/1010 =
1/1.000.000. Có nghĩa cứ khoảng 1 triệu gốc nucleotide sẽ có 1 vị trí gồm 10
gốc bổ trợ cho 10 gốc của mồi RAPD với trình tự xác định nào đó. Do kỹ thuật
này chỉ sử dụng một loại mồi đồng nhất cho cả hai đầu của đoạn ADN cần
nhân bản, ngoài ra 2 đoạn mồi này phải đ ợc kết cặp trên hai sợi đơn khác
nhau của chuỗi ADN và phải đi theo chiều hớng vào nhau, nên xác suất trên
phải nhỏ đi nhiều. Trên thực tế xác suất bắt cặp của các mồi còn nhỏ hơn
nhiều lần nữa, bởi trong điều kiện PCR thông th ờng chỉ tổng hợp đ ợc một
đoạn ADN không dài quá năm nghìn nucleotide. Đối với ADN thực vật, các
mồi RAPD th ờng cho sản phẩm PCR từ một vài băng đến vài chục băng có
chiều dài từ 100-5000 nucleotide [3],[16].
Với đặc điểm là ngắn, nên khả năng đoạn mồi tìm ra đợc điểm gắn trên
DNA khuôn không quá khó khăn. Tuỳ vào từng loại thực vật hay vi sinh vật
mà các đoạn mồi ngẫu nhiên đợc thiết kế. Theo lý thuyết, số lợng của các
đoạn DNA đợc nhân bản phụ thuộc vào độ dài và vị trí của các đoạn mồi, kích
thớc và mức độ phức tạp của cấu trúc DNA geneome. Kết quả là sau khi điện
di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện đợc tính đa hình dựa trên các phân đoạn
DNA đợc nhân bản. Sự đa hình của sản phẩm RAPD là do kết quả thay đổi
các điểm gắn của mồi (ví dụ: đột biến điểm) hoặc do thay đổi nhiễm sắc thể
trong các vùng đợc nhân bản (ví dụ: thêm đoạn, mất đoạn hay đảo đoạn) sẽ
gây ra sự thay đổi về kích thớc hay ngăn cản sự nhân bản DNA. Sản phẩm
khuyếch đại đợc phân tách bằng điện di trên gel agarose hoặc
polyacrylamide và có thể quan sát đợc sau khi gel đợc nhuộm bằng hoá chất
đặc trng. Tính đa hình đợc nhận ra do sự có mặt hoặc vắng mặt của một sản
phẩm nhân bản.
16
2.3.1.2.
2.3.1.3. u nhợc điểm của phơng pháp RAPD
17
tính đa hình dễ dàng nên kỹ thuật này đợc sử dụng cho việc nghiên cứu tính
thuần của giống.
Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây cho thấy kỹ thuật RAPD là một ph-
ơng pháp rất hiệu quả trong việc phân tích quần thể và nguồn gốc loài,
nghiên cứu di truyền loài, lập bản đồ di truyền. Kỹ thuật RAPD cũng đợc sử
dụng để nhận biết và phân loại các giống cây khác nhau, sự đa hình di truyền
trong các kiểu gen lúa nớc và lúa nơng, sự đa hình di truyền giữa lúa Indica và
Japonica, xác định sự đa hình của các cây tái sinh có nguồn gốc từ mô sẹo,
tế bào huyền phù và tế bào trần.
Kỹ thuật RAPD đợc sử dụng để phân tích và xác định mối quan hệ thân
thuộc giữa các loài hay giữa các cá thể để phục vụ cho công tác lai tạo hoặc
phân loại. Chúng cũng đợc sử dụng nh những chỉ thị phân tử để xác định
những gen kiểm soát hoặc có liên quan đến một tính trạng nào đó ở cây
trồng, nh tính trạng chất lợng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virut ở cà chua
[6], [20].
Hiện nay, kỹ thuật RAPD đợc sử dụng trong nhận biết, phân loại và
phân tích đa hình di truyền của các loài khác nhau nh phân tích sự đa dạng
ADN giữa các giống mía [35], xác định và phân loại các kiểu di truyền của các
giống đậu Hà Lan [60], phân tích mối quan hệ di truyền giữa các loài
Orobanche [58], phân tích các biến đổi di truyền trong loài cỏ ba lá trắng ở
Bắc Mỹ [34].
Hai nhà khoa học Yang và Quiros đã sử dụng 28 đoạn mồi có trình tự
10 nucleotide để nghiên cứu sự khác biệt của 28 giống cần tây và đợc chia
làm ba nhóm. Kết quả thu đợc càng đợc khẳng định khi sử dụng 6 chỉ thị
protein để phân loại các giống cần tây trên [70]. Tơng tự, nhiều tác giả đã sử
dụng RAPD để lập cây chủng loại phát sinh của ngô, lúa gạo, lúa mì... [9],
[61].
Kỹ thuật RAPD còn là một công cụ rất hiệu quả trong việc tìm ra các
chỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay các loài khác nhau. Sun và cộng sự
Phơng thức lặp lại cũng rất đa dạng và có thể chia làm 3 loại:
- Lặp lại hoàn toàn , các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau.
- Lặp lại không hoàn toàn, xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là 1 hoặc 1 số
nucleotide.
- Lặp lại phức tạp, có sự xen kẽ vào các đơn vị lặp lại nhiều nucleotide
khác nhau.
19
Vùng microsatellites thờng là những vùng siêu biến, nó không chỉ khác
nhau giữa các loài mà còn giữa các cá thể có quan hệ gần gũi. Đó chính là cơ
sở tạo ra tính đa hình của phơng pháp SSR. Tính đa hình SSR thờng biểu lộ
tính đồng trội.
Cách thông thờng nhất để dò microsatellites là thiết kế các mồi PCR nó
nằm duy nhất trong một locus trên genome, do vậy một cặp mồi PCR có thể
đặc trng cho từng cá thể trong loài, việc tạo ra các sản phẩm PCR có kích th-
ớc khác nhau đó cũng chính là các microsatellites có kích thớc khác nhau [2],
[8].
2.3.2.2. Phơng pháp
Phơng pháp SSR dựa trên nguyên tắc PCR với mồi đặc hiệu khoảng
20 nucleotide, với nhiệt độ bắt mồi 55
0
C - 65
o
C, cho sản phẩm đặc hiệu có
kích thớc 100-400 bp, Sản phẩm đợc điện di trên gel polyacrylamide 6% -8%.
2.3.2.3. u nhợc điểm
Hầu hết các locus SSR ở thực vật có sự đa hình cao hơn các chỉ thị
khác. Trong phân tích SSR không dùng phóng xạ hoặc bất kỳ một bớc nghiên
cứu phức tạp nào khác mà cho kết quả nhanh, tin cậy hơn RAPD RFLP Chỉ
thị SSR là các locus đặc trng, đa alen và cung cấp nhiều thông tin nên chúng
hết sức có ích cho việc phát hiện sự thay đổi trình tự nucleotide đặc trng cho
lại đây việc thiết kế các mồi SSR chuyên dụng cho lạc đã đợc một số Viện
nghiên cứu trên thế giới thực hiện. Hiện nay, có khoảng vài trăm chỉ thị SSR
đã đợc công bố là có tính đa hình cao ở lạc nuôi trồng. Kết quả chỉ ra rằng
trình tự lặp lại GA/CA đợc phân tán thờng xuyên trong lạc [36]. Theo nghiên
cứu của He G. và cs (2003) trong số 56 cặp mồi đợc thiết lập trên cơ sở của
cây lạc thì chỉ có 19 cặp mồi chỉ ra tính đa hình khi phân tích với 15 giống lạc.
Trung bình có 4,25 alen trên một locus và đặc biệt có trên 14 alen đã đợc tìm
thấy trong một locus. Điều này chỉ ra rằng chỉ thị SSR cho độ đa hình cao hơn
các chỉ thị khác ở lạc.
ở Việt Nam, kỹ thuật SSR đã đợc ứng dụng rộng rãi để nghiên cứu tính
thuần của lúa, đánh giá quỹ gen của cây lúa, lập bản đồ phân tử các đặc
điểm rễ ở lúa cạn, xác định chỉ thị phân tử bệnh rỉ sắt ở lạc...
21
Chơng 3. Nguyên liệu và phơng pháp
3.1. Nguyên liệu nghiên cứu
3.1.1. Nguyên liệu thực vật
Vật liệu thực vật đợc sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm:
o 32 giống lạc và 14 giống vừng đang đợc trồng rộng rãi khắp cả nớc, đ-
ợc cung cấp bởi viện Viện Cây có dầu Miền Nam. Danh sách các giống
lạc và vừng nghiên cứu đợc trình bày ở phụ lục 1 và 2.
o Viết cụ thẻ số lợng Một số dòng lạc, vừng đột biến đợc trình bày ở phụ
lục 3 và 4.
3.1.2. Thiết bị và hóa chất
Công trình nghiên cứu đợc thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bào thực
vật thuộc Viện Công nghệ Sinh học.
Thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là của các hãng sản xuất
chuyên dụng cung cấp nh: Máy ly tâm (Beckman), máy PCR System 9700
(Pharmacia), máy điện di (Biorad), máy đo quang phổ Diode Array
Spectrophotometer của hãng Hewlett - Packard, máy chụp ảnh gel - Doc
(Pharmacia), máy ổn nhiệt, máy soi UV, lò vi sóng, các hóa chất tách chiết
B
1
: Cân 200 mg mẫu lá non cho vào ống eppendorf 2 ml.
B
2
: Cho nitơ lỏng vào ống eppendorf có chứa mẫu lá. Nghiền bằng đũa
thủy tinh có đầu nhọn vừa với ống eppendorf thành dạng bột mịn.
B
3
: Bổ sung 800 l đệm tách ADN, đảo nhẹ để tạo thành hỗn hợp đồng
nhất, ủ trong 60 phút ở 65
0
C.
B
4
: Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
B
5
: Bổ sung 800 l hỗn hợp Chloroform : Isoamyl (24:1), đảo đều.
B
6
: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút để phân tách thành 2 pha,
hút cẩn thận dịch nổi cho vào ống eppendorf mới.
B
7
: Tủa dịch nổi bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1), đảo nhẹ.
23
B
8
: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút loại bỏ dịch nổi (hoặc vớt
16
: Rửa ADN hai lần bằng ethanol 80%.
B
17
: Hoà tan ADN trong 300 àl TE 1X, giữ ở -20
0
C đến khi sử dụng.
3.2.2. Xác định hàm lợng và độ tinh sạch của ADN
3.2.2.1. Phơng pháp đo quang phổ
Việc xác định hàm lợng và độ tinh sạch của ADN có thể đợc thực hiện
bằng cách đo độ hấp thụ tia UV ở các bớc sóng 230, 260, 280 nm trên máy
đo quang phổ. Khi đó ADN có đỉnh hấp thụ cực đại ở bớc sóng 260 nm. Từ
giá trị OD260 ta sẽ tính đợc hàm lợng của ADN thu đợc (chẳng hạn số đo trên
máy là 1,0 thì hàm lợng ADN sẽ vào khoảng 50 mg/1 ml mẫu). Độ tinh sạch
của ADN có thể đợc xác định bằng tỷ số OD260/OD280 và OD260/ OD230.
Các tỷ số này lần lợt chỉ ra sự có mặt của các tạp chất là protein, các hợp
chất polyphenol và carbonhydrate. Một mẫu ADN đợc coi là tinh sạch nếu tỷ
số OD260/OD280 và OD260/OD230 đạt 1,8 - 2.
Các bớc đo đợc tiến hành nh sau:
- Chỉnh cân bằng máy (Blank): dùng nớc cất 2 lần khử ion, vô trùng để
làm chuẩn.
- Kiểm tra máy: đo một mẫu ADN có nồng độ chuẩn đã biết trớc (ADN
của thực khuẩn thể ).
- Đo mẫu ở bớc sóng = 260 nm và = 280 nm.
Mẫu đợc pha loãng 200 lần theo công thức: lấy 995àl nớc cất + 5àl
ADN mẫu, lắc đều cho vào cuvet, đặt vào máy đo.
- Sau mỗi lần đo phải rửa sạch cuvet bằng nớc cất.
- In kết quả đo đợc.
24
Từ đó, ta tính đợc hàm lợng và độ sạch của ADN theo công thức:
H
2
O) và tra vào giếng.
- Điện di: Hiệu điện thế dùng để điện di từ 80 - 100 V. ADN chuyển từ
cực âm sang cực dơng. Quan sát sự di chuyển bằng mầu của bromophenol
để biết lúc nào ngừng điện di.
- Nhuộm ADN: Nhuộm ADN bằng Ethidium Bromide. Bản gel đợc lấy ra
khỏi khay điện di và đa vào dung dịch EtBr 0,5g/ml trong thời gian khoảng
15 phút trên máy lắc nhẹ.
25
Copyright: Tài liệu đại học ©